Name: Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Découvrez la mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes de souris fraîchement isolés. Cette méthode préserve l'intégrité des organites et minimise les variations d'expression génique pour des résultats fiables.

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Ce travail a été soutenu par la subvention R35GM119528 des National Institutes of Health à Roberta Leonardi.

<ol><li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li>
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<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li>
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<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Pendant la perfusion hépatique, il est essentiel d’éviter l’introduction de bulles d’air, car elles bloquent les microcapillaires dans le foie, empêchant ou restreignant la circulation tampon et diminuant globalement le rendement en hépatocytes et la viabilité20,21. Des précautions, telles qu’une inspection minutieuse de la conduite d’entrée remplie de tampon avant la canulation de la CIV et éviter de soulever la conduite d’entrée du tube contenant le tampon 1 po...

La β-oxydation des acides gras est un processus essentiel dans le métabolisme des lipides, fournissant une voie catabolique pour équilibrer la synthèse des acides gras et l’apport de l’alimentation. Ce processus génère de l’énergie pour plusieurs organes, y compris le muscle cardiaque, le cortex rénal et le foie à jeun, et utilise les acides gras obtenus à partir de l’alimentation, la lipolyse du tissu adipeux et les réserves internes de triglycérides 1,2.
L’oxydation des acides gras par la voie β-oxydation entraîne le raccourcissement séquentiel de la chaîne acylique grasse par deux carbones à la fois, libérés sous forme d’acétyl-CoA, et ce processus se produit à la fois dans les mitochondries et les peroxysomes. Alors que la plupart des acides gras ne subissent qu’une β-oxydation, certains sont oxydés à différents carbones avant d’entrer dans cette voie. Par exemple, les acides gras substitués au 3-méthyle, tels que l’acide phytanique, subissent l’élimination d’un carbone par α-oxydation dans les peroxysomes avant d’entrer dans la voie de β-oxydation. De même, certains acides gras sont d’abord convertis en acides gras dicarboxyliques par oxydation du groupe méthyle terminal (ω-oxydation) dans le réticulum endoplasmique avant d’être préférentiellement oxydés dans les peroxysomes par β-oxydation3.
Quel que soit l’organite spécifique, un acide gras doit d’abord être converti en un thioester de coenzyme A (CoA), ou acyl-CoA, pour être oxydé par la voie de β-oxydation. β-oxydation des acyl-CoA à longue chaîne dans la matrice mitochondriale nécessite la navette carnitine pour leur translocation, où la carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1) catalyse la conversion des acyl-CoAs en acylcarnitines et est l’enzyme limitant le taux dans ce processus4. Une fois transloqués dans la matrice mitochondriale, les acyl-CoAs sont reformés et servent de substrats à la machinerie mitochondriale β-oxydation. À jeun, l’acétyl-CoA produit par β-oxydation dans les mitochondries hépatiques est principalement canalisé vers la cétogenèse. Les peroxysomes servent de site principal pour la β-oxydation des acides gras à très longue chaîne, à chaîne ramifiée et dicarboxyliques. Les peroxysomes n’ont pas besoin de la navette carnitine pour importer des substrats d’acides gras, mais importent plutôt les acyl-CoA correspondants par l’activité des transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) ABCD1-35. Dans les peroxysomes, les acyl-CoAs sont ensuite oxydés par un ensemble dédié d’enzymes, distinctes de la machinerie mitochondriale d’β-oxydation des acides gras. Les mitochondries et les peroxysomes nécessitent également un apport de NAD+ et de CoA libre pour oxyder les chaînes acyles grasses. Il a été démontré que les niveaux de CoA dans le foie augmentent en réponse au jeûne, ce qui favorise l’augmentation du taux d’oxydation des acides gras qui se produit dans cet état6. De plus, l’augmentation de la dégradation du CoA dans les peroxysomes entraîne une diminution sélective de l’oxydation des acides gras peroxysomaux7. Par conséquent, le processus d’oxydation des acides gras dans la cellule est régulé par les niveaux d’expression et les activités des enzymes impliquées dans l’activation, le transport et l’oxydation des acides gras, ainsi que par les concentrations de cofacteurs et d’autres métabolites dans plusieurs compartiments subcellulaires.
Les procédures utilisant des homogénats tissulaires pour mesurer l’oxydation des acides gras détruisent l’architecture cellulaire régulant et soutenant ce processus, conduisant à une collecte de données qui ne reflètent pas avec précision le métabolisme in vivo. Alors que les techniques utilisant des hépatocytes primaires plaqués préservent ce système, la culture de cellules isolées pendant de longues périodes entraîne une perte du profil d’expression génique in vivo qui était présent dans les cellules lorsqu’elles vivaient encore chez l’animal 8,9. Le protocole suivant décrit une méthode pour isoler les hépatocytes primaires et tester leur capacité à β-oxydation des acides gras immédiatement après l’isolement et en suspension, en utilisant l’acide [1-14C]palmitique. Le dosage est basé sur la mesure de la radioactivité associée aux métabolites solubles dans l’acide (ASM) ou à des produits, comme l’acétyl-CoA, produits par la β-oxydation de l’acide [1-14C]palmitique10,11.

<table><tbody><tr><td>Sel sodique (R)-(+)-étomoxir</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4539/10</td><td></td></tr><tr><td>[1-14C]-Acide palmitique, 50&ndash ; 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/mL</td><td>Produits chimiques radiomarqués américains</td><td>ARC 0172A</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, stérile</td><td>Corning</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro ; L capillaires/pistons jetables pour pipette à déplacement positif</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008604</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ; L, 200 et micro ; L, et 10 & micro ; Pipettes et pointes</td><td></td><td></td><td></td>en L</tr><tr><td>Pipettes</td><td></td><td></td><td></td>sérologiques de 5 mL, 10 mL et 25 mL</tr><tr><td>Tubes à centrifuger stériles de 50 mL</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’acide perchlorique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A2296-1LB</td><td></td></tr><tr><td>BSA, sans acides gras</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydraté</td><td>MilliporeSigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>E-217</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>Système de filtration, 0.22 &mu ; m Filtre PES, 500 mL, CellTreat</td><td></td><td>stérile 229707</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-400-25</td><td></td></tr><tr><td>HDPE, 6,5 mL flacons à scintillation</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-342-3</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles hypodermiques 22 G, 1,5 po</td><td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VetOne</td><td></td><td></td>502017</tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>MilliporeSigma</td><td>5401119001</td><td>Mélange défini de collagénase I et II purifiée avec une concentration moyenne de thermolysine</td></tr><tr><td>M199</td><td>moyenne MilliporeSigma</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 heptahydrate</td><td>MilliporeSigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>accuSpin Micro 17</td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>424270010</tr><tr><td>Acide palmitique</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Pipette à déplacement positif MR-10, 10 &micro ; L</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008575</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée avec inserts pour tubes coniques de 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>Tubes à essai de culture en polypropylène à fond rond, 14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-9A</td><td></td></tr><tr><td>Compteur à scintillation</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>TriCarb 4810 TR</td></tr><tr><td>ScintiVerse BD cocktail</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à secousses, capacité de 30 L</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>&nbsp ; Modèle G76</td></tr><tr><td>Crépines à cellules stériles, 100 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pansement pour le pouce</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique à débit variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>138762</td><td></td></tr><tr><td>Bains-marie, 2&ndash ; Capacité de</td><td></td><td></td><td></td> 2,5 L</tr></tbody></table>

mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique clé pour répondre aux besoins énergétiques du foie et fournir des substrats et des cofacteurs pour des processus supplémentaires, tels que la cétogenèse et la gluconéogenèse, qui sont essentiels pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et soutenir la fonction extra-hépatique des organes à jeun. La β-oxydation des acides gras se produit dans les mitochondries et les peroxysomes et est régulée par de multiples mécanismes, y compris l’absorption et l’activation des acides gras, les niveaux d’expression enzymatique et la disponibilité de cofacteurs tels que la coenzyme A et le NAD +. Dans les essais qui mesurent la β-oxydation des acides gras dans les homogénats hépatiques, la lyse cellulaire et l’ajout commun de niveaux supraphysiologiques de cofacteurs masquent les effets de ces mécanismes de régulation. De plus, l’intégrité des organites dans les homogénats est difficile à contrôler et peut varier considérablement d’une préparation à l’autre. La mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes primaires intacts surmonte les pièges ci-dessus. Ce protocole décrit une méthode de mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés incubés avec de l’acide palmitique marqué 14C. En évitant les heures à les jours de culture, cette méthode a l’avantage de mieux préserver les niveaux d’expression des protéines et l’activité de la voie métabolique du foie d’origine, y compris l’activation de l’β-oxydation des acides gras observée dans les hépatocytes isolés de souris à jeun par rapport aux souris nourries.

La perfusion hépatique décrite ici donne généralement 30 à 40 millions de cellules/foie avec une viabilité moyenne de 80 %, telle qu’estimée par l’exclusion du bleu de trypan (Figure 2). La concentration typique de glucose dans le tampon Krebs-Henseleit (KHB), qui est utilisé pour préparer les tampons de perfusion 1 et 2, est de 11 mM. Lors de la mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes isolés de souris à jeun, la concentration de glucose dans le KHB peut être abaissée p...

La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique essentielle responsable de la génération d’énergie dans de nombreux types de cellules, y compris les hépatocytes. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer l’oxydation β des acides gras dans des hépatocytes primaires fraîchement isolés en utilisant de l’acide palmitique marqué 14C.

Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Ce protocole a été développé pour fournir une méthode robuste pour la mesure de la bêta-oxydation totale des acides gras mitochondriaux et peroxysomaux dans les hépatocytes primaires de souris. L’utilisation de cellules intactes maintient l’intégrité des organites et les mécanismes de régulation en place. De plus, le dosage des hépatocytes fraîchement isolés minimise les changements dans l’expression des gènes par rapport au foie d’origine.La chirurgie peut être difficile. Vous devez être confiant, diligent et concentré. Une fois que la canulation est réussie, essayez de vous détendre, mais faites attention et surveillez la qualité de la perfusion.Pour commencer la procédure, vaporisez généreusement l’abdomen et la poitrine de la souris anesthésiée avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, utilisez la pince pour tirer la peau et la paroi abdominale près de la base de l’abdomen et coupez latéralement de chaque côté de la ligne médiane et jusqu’au diaphragme pour exposer les organes. Exposez la veine cave inférieure, ou IVC, en déplaçant les intestins vers le côté droit et en retournant doucement les lobes du foie vers le haut.Insérez un petit objet cylindrique, tel qu’un capuchon d’aiguille

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Biochimie

Dans cette vidéo, nous démontrons la coloration in vitro de lipides neutres dans les hépatocytes pour détecter une stéatose hépatique ou une accumulation excessive de graisse dans le foie. L’excès de graisse s’accumule dans les cellules sous forme de gouttelettes lipidiques. Oil Red O est un colorant liposoluble qui se lie aux lipides neutres intracellulaires dans ces gouttelettes lipidiques. Lorsqu’elles sont observées au microscope optique, ces gouttelettes lipidiques intracellulaires...

Coloration au rouge d’huile O : une technique de coloration des lipides neutres dans les hépatocytes pour détecter la stéatose hépatique in vitro

Et la lipogenèse de novo d'acides β oxydation gras constituent des voies métaboliques clés dans des hépatocytes, des voies qui sont perturbées dans plusieurs troubles métaboliques, y compris la maladie du foie gras. Ici, nous démontrons l'isolement des hépatocytes primaires de souris et de décrire la quantification de l'oxydation et de la lipogenèse acide β-gras.

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

Le protocole suivant décrit la préparation et l’utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d’oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé du rat actif. Les méthodes utilisées pour l’analyse des échantillons et l’interprétation des données sont également abordées.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

Ici, des méthodes optimisées pour générer des modèles in vivo et in vitro de stéatose hépatique et pour analyser les phénotypes stéatotiques et les paramètres physiologiques associés sont décrites.

Analyse optimisée des<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Stéatose hépatique

Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de 14CO2 in vitro.

Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2

Nous présentons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la lipogenèse de novo des acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo.

Détermination quantitative de la synthèse d’acides gras de novo dans le tissu adipeux brun à l’aide d’oxyde de deutérium

La lipolyse des triglycérides dans les adipocytes est un processus métabolique important entraînant la libération d’acides gras libres et de glycérol. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour mesurer la lipolyse basale et stimulée dans les adipocytes et le tissu adipeux ex vivo de souris.

Mesure du taux de lipolyse dans le tissu adipeux murin ex vivo et les préadipocytes primaires différenciés in vitro

Cet article décrit l’utilisation de cellules HepG2 induites par l’acide oléique comme modèle de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique.

Modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique

Nous proposons un protocole permettant d’identifier les acides gras sans avoir besoin de les purifier. Il combine des informations sur les temps de rétention avec les spectres de masse de trois types de dérivés d’acides gras : les esters méthyliques d’acides gras (FAME), les dérivés de 4,4-diméthyloxazoline (DMOX) et les esters de 3-pyridylcarbinyle (picolinyl).

Identification des acides gras dans<em&gt; Bacillus cereus</em

Ici, nous présentons une hydrolyse efficace et une protection Fmoc ultérieure d'un acide aminé isolé à partir d'un complexe à base de Ni-Schiff. Les conditions d'hydrolyse présentées ici sont appropriés pour une utilisation lors de la rétention des groupes protecteurs de chaîne latérale d'acide-labile est nécessaire. Cette technique peut être adaptée à une variété de substrats d'acides aminés non naturels.

Hydrolysats d&#39;un complexe Ni-base de Schiff Conditions Utilisation Convient pour le maintien de groupes protecteurs d&#39;acide labile

Découvrez la mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes de souris fraîchement isolés. Cette méthode préserve l'intégrité des organites et minimise les variations d'expression génique pour des résultats fiables.

Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés

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