Name: Reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez la reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes fonctionnels en utilisant seulement trois facteurs de transcription : Mitf, Sox10 et PAX3. Cette méthode optimisée offre une efficacité élevée et une stabilité accrue pour la médecine régénérative.

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Cette étude a été partiellement soutenue par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82070638 et 81770621) et de la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (BK20180281).

Ce travail a été approuvé par le Comité de gestion et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université du Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Les expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les normes établies par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Il n’y a pas eu d’expériences impliquant des humains, donc ce travail n’a pas eu besoin de l’approbation du comité d’éthique de la recherche humaine. Reportez-vous à la Table des matériaux pour plus de détails sur les réactifs.
1. Construction d’un système d’emballage de lentivirus concentré pour les facteurs de transcription
<ol><li>Production du virus concentré (Figure 1A, B)<ol>
<li>Plaque 1,5 × 10 cellules6 HEK-293T dans une cuve de 60 mm et cultiver ces cellules avec un milieu normal (voir tableau 1) à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. REMARQUE: Si le virus doit être emballé par lots, une boîte de culture cellulaire de 100 mm peut être utilisée (pour plus de détails, voir le tableau 2).</li>
		<li>Après 24 h, assurez-vous que les cellules HEK-293T ont atteint 80-90% de confluence le jour de la transduction, et remplacez le milieu par 3,5 mL de DMEM (150 μL de DMEM par 1 cm2). Laisser les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 2 h. REMARQUE: Le milieu de remplacement doit être sans sérum, de sorte que les cellules puissent être « affamées » pour une meilleure transfection plasmidique.</li>
		<li>Préparer le mélange de plasmides (mélange A) contenant 3 μg des plasmides cibles de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2; 1 μg du plasmide d’emballage PMD2. G et 2 μg du plasmide d’emballage PSPAX2. Porter le volume du mélange A à 150 μL avec du DMEM sans sérum. Préparer le mélange du réactif de transfection (mélange B) en ajoutant 12 μL du réactif de transfection (le volume est le double de la masse totale de tous les plasmides), et composer le volume du mélange B à 150 μL avec du DMEM sans sérum. REMARQUE: Lors de la préparation des mélanges, il est important d’ajouter du liquide lentement pour éviter les bulles d’air.</li>
		<li>Mélanger le mélange A et le mélange B après les avoir laissés reposer pendant 5 min à température ambiante. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20-30 min pour former le complexe de transfection.</li>
		<li>Sortez les cellules HEK-293T de l’incubateur, remplacez le milieu par du DMEM + 2% FBS, ajoutez le mélange de l’étape 1.1.4 dans le sens des gouttes et mélangez doucement le liquide.</li>
		<li>Après 8 h, changer le milieu avec 3,5 mL de milieu normal. Après avoir changé le milieu, collectez le surnageant du virus toutes les 24 h et 48 h.</li>
		<li>Mélangez les surnageants du virus collectés à deux moments différents. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. Passez le surnageant à travers des filtres de 0,45 μm et collectez-le dans un tube conique stérile de 50 mL. REMARQUE: Le virus collecté à 24 h peut être stocké à 4 °C et mélangé avec le virus collecté à 48 h.</li>
		<li>Concentrer le surnageant du virus par centrifugation à 6000 × g à 4 °C pendant la nuit (~16 h). Assurez-vous que la pastille virale est visible au fond du tube conique après la centrifugation.</li>
		<li>Versez le surnageant lentement. Dissoudre la pastille virale dans un volume de milieu normal qui représente 1/100ème du volume du surnageant du virus. À l’aide d’une micropipette P1000, pipettez doucement de haut en bas jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène. Divisez le virus concentré en tubes de microcentrifugation au besoin. Conserver à −80 °C. REMARQUE: Le virus est concentré 100x avec cette méthode. Le virus concentré (100x) peut être conservé pendant >1 an à −80 °C. Évitez la congélation et la décongélation répétées du virus.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection du titre de virus concentré (Figure 1C)<ol>
<li>La plaque 1 × 10 cellules HEK-293T de5 dans un puits d’une plaque de 6 puits. N’oubliez pas d’en ajouter un comme contrôle négatif. Cultiver ces cellules avec un milieu normal à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.</li>
		<li>Ajouter 0,1 μL ou 0,2 μL de virus fluorescent concentré (100x) à chaque puits après 24 h, et ajouter 4 ng/μL du réactif de transfection polymère cationique à chaque puits. Environ 8-12 heures après l’infection, remplacez le milieu par un milieu normal. REMARQUE: Pour assurer la précision et l’efficacité de la détection de fluorescence, le taux d’infection doit être de 10 à 30%. L’ajout de 0,1 μL ou 0,2 μL du virus concentré fluorescent peut maintenir l’efficacité de l’infection dans cette plage. Le titre de virus concentré peut atteindre au moins 1 × 108 unités de transduction (UT)/mL.</li>
		<li>Environ 48 heures après l’infection, laver la vaisselle avec 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules mortes.</li>
		<li>Trypsiniser ces cellules en utilisant 250 μL de 0,05% de trypsine-EDTA par puits dans une plaque de 6 puits pendant 1 min à température ambiante. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C puis retirer le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de PBS, ajouter la suspension à un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL et détecter l’efficacité de l’infection de la fluorescence du virus (protéine fluorescente verte, GFP+) à l’aide de la cytométrie en flux.</li>
		<li>Calculer le titre de virus concentré à l’aide de la formule suivante : 105 (volume cellulaire) × taux d’infection (GFP+%)/volume de virus ajouté (0,1 μL ou 0,2 μL).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes (Figure 2A)
<ol><li>Enduire un puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec 1 mL de solution de gélatine à 0,1% à température ambiante pendant 15-30 min. Assurez-vous que le puits est complètement recouvert de la solution de gélatine à 0,1%. Aspirer la solution de gélatine à 0,1% après revêtement. REMARQUE: Préparer une solution de gélatine à 0,1% (100 mL) comme suit: 0,1 g de poudre de gélatine est dissous dans 100 mL d’eau ultrapure dans un flacon en verre autoclavé, puis conservé à 4 ° C pendant 2 mois au maximum.</li>
	<li>La plaque 5 × 104 MEF dans un puits d’une plaque de 6 puits recouverte de 0,1% de gélatine (comme à l’étape 2.1), et cultiver ces cellules avec un milieu normal à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant la nuit.</li>
	<li>Après 24 h, confirmez que les MEF ont atteint 40-50% de confluence. Remplacez le milieu par un milieu normal.</li>
	<li>Le jour 0, retirez le virus concentré du congélateur et faites fondre le virus sur la glace. Calculer le volume du virus à ajouter à l’aide de l’égalisation (1). Ajouter le virus concentré pour les six facteurs de transcription, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 et Snai2 (voir tableau des matériaux) à chaque puits en fonction du volume calculé, puis ajouter 4 μg/mL de l’agent de transfection polymère cationique. Nombre de cellules (5 × 104) × 30 (multiplicité de l’infection, MOI)/titre de virus (1)</li>
	<li>Le jour 1, 8 à 12 h après l’infection, retirer le milieu contenant le virus et le remplacer par un milieu normal frais tout en ajoutant 0,5 μg/mL de puromycine pour dépister les lignées cellulaires infectées stables.</li>
	<li>Le jour 2, 48 h après l’infection, remplacez progressivement le milieu surnageant par le milieu de reprogrammation. Tout d’abord, changez 1/4ème du volume moyen total et ajoutez 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Du jour 3 au jour 7, selon l’état des cellules, changez progressivement le milieu en le remplaçant par une proportion plus élevée de milieu de reprogrammation (voir tableau 1) et passez au milieu de reprogrammation complet dans les 5 jours. REMARQUE: Pendant cette période, la puromycine et le CHIR99021 doivent être utilisés tous les jours. De nombreuses cellules mortes apparaîtront le premier et le deuxième jour du changement de support de reprogrammation. Ceci est normal car les cellules s’adaptent progressivement à la transformation. Par conséquent, le milieu doit être modifié progressivement pour assurer la prolifération saine des cellules.</li>
	<li>Pour passer les cellules, ajouter 500 μL de 0,05% de trypsine-EDTA pour digérer les cellules pendant 3 min à température ambiante. Lorsque ~ 60% des cellules ont flotté, arrêtez la digestion en ajoutant un milieu normal 2x le volume de l’enzyme digestive. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL, centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant, remettre la pastille cellulaire avec le milieu de reprogrammation et plaquer les cellules dans une parabole stérile de 60 mm à une densité de 3 × 104/cm2. Cultivez ces cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 . REMARQUE: Du jour 8 au jour 21, ces cellules sont sous-cultivées tous les 3-5 jours et cultivées dans des plats stériles de 60 mm pour se dilater. Ils peuvent être cultivés pour atteindre au moins le passage 5.</li>
</ol>3. Optimisation pour la reprogrammation directe et l’identification
<ol><li>Dépistage des facteurs de transcription optimisés<ol>
<li>Répétez les étapes 2.1 à 2.7, en réduisant l’un des six facteurs de transcription à chaque fois. Infecter les MEF avec le virus avec des combinaisons de cinq facteurs de transcription.</li>
		<li>Sept jours après l’infection, extraire l’ARN de ces cellules16 et analyser les niveaux d’expression de leurs gènes mélanocytaires à l’aide de la PCR à transcription inverse (RT-PCR)17 pour dépister les facteurs de transcription ayant le plus grand impact sur la conversion en mélanocytes en les enlevant un par un (Figure 3A).</li>
		<li>Utilisez les trois principaux facteurs de transcription ayant un impact sur la conversion en mélanocytes pour infecter les MEF. Répétez les étapes 2.1 à 2.7. REMARQUE : Sept jours après l’infection, les gènes mélanocytaires devraient être détectables dans ces cellules transformées (figure 3B). Les informations d’introduction pour la caractérisation des iMels sont incluses dans le tableau 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Identification des mélanocytes induits (iMels)<ol>
<li>Utilisez la coloration par immunofluorescence18 pour vérifier que les iMels expriment des protéines mélanocytaires, y compris TYRP-1 et DCT (Figure 4A).</li>
		<li>Coloration de la 3,4-dihydroxyphénylalanine (DOPA) spécifique à la mélanine (figure 4B)<ol>
<li>Préparer le paraformaldéhyde à 4 % (10 mL) comme suit : dissoudre 0,4 g de poudre de paraformaldéhyde dans 10 mL de PBS. Placer la solution dans un four à 56 °C pendant 2 h pour favoriser la dissolution. REMARQUE: La solution peut être conservée à 4 ° C pendant un mois au maximum.</li>
			<li>Cultivez les iMels dans un plat de 30 mm et lavez le plat deux fois avec du PBS préchauffé. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pour fixer les cellules pendant 20 min, et laver la vaisselle 3 fois avec du PBS.</li>
			<li>Préparer une solution de coloration à 0,1 % de DOPA (10 mL) juste avant utilisation en dissolvant 0,01 g de poudre de L-DOPA dans 10 mL de PBS. Placer la solution au bain-marie à 37 °C pendant 30 min; secouez-le plusieurs fois pour favoriser la dissolution.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de solution de coloration DOPA à 0,1 % fraîchement préparée. Incuber dans un four à 37 °C pendant 2-5 h. S’il n’y a pas de particules brun-noir, continuer à incuber à 37 °C pendant encore 2 h, mais pas pendant >5 h. Vérifiez les échantillons toutes les 30 minutes.</li>
			<li>Lavez le plat 3 fois avec PBS pendant 1 min à chaque fois. Tacher le noyau avec 1 mL de solution de coloration à l’hématoxyline pendant 2 min.</li>
			<li>Pour un stockage à long terme, déshydrater les échantillons à l’aide d’éthanol à 95 % pendant 3 min, puis d’éthanol à 100 % pendant 5 min. Scellez le plat avec du xylène et du baume neutre.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloration Masson-Fontana spécifique à la mélanine (Figure 4B)<ol>
<li>Plaque iMels dans un plat de 30 mm et fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 20 min; laver la vaisselle 3 fois avec PBS.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de solution A (solution d’ammoniac et d’argent) du kit de coloration Masson-Fontana (voir Tableau des matériaux), placer le plat dans une boîte sombre et placer la boîte sombre dans un four à 56 °C pendant 15-40 min. REMARQUE: Si les particules brun-noir ne sont pas visibles après 15 min dans le four, retourner les échantillons au four à 56 °C pour continuer l’incubation mais pas pendant >40 min. Un peu d’eau peut être ajoutée à la boîte sombre pour éviter le dessèchement.</li>
			<li>Aspirer la solution A et laver le plat 5-6 fois avec de l’eau distillée, 1-2 min à chaque fois.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de solution B (hypo solution) du kit de coloration Masson-Fontana et laisser le plat à température ambiante pendant 3-5 min.</li>
			<li>Aspirer la solution B et laver la vaisselle avec de l’eau du robinet 3 fois, 1 min à chaque fois.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de solution C (colorant rouge neutre) du kit de coloration Masson-Fontana et laisser le plat à température ambiante pendant 3-5 min.</li>
			<li>Aspirer la solution C et laver le plat 3 fois avec de l’eau distillée, 1 min à chaque fois.</li>
			<li>Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % pour une déshydratation rapide et aspirer l’éthanol après 3 min. REMARQUE: Les échantillons colorés peuvent être conservés longtemps après avoir été scellés avec du xylène et du baume neutre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li>
<li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011(2015).</li>
<li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%3A+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li>
<li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo+management%3A+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li>
<li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+therapies+for+vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li>
<li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509(2018).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+achievements%2C+hurdles%2C+and+new+roads+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li>
<li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807(2014).</li>
<li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891(2016).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La qualité du virus est cruciale pour le succès de la reprogrammation directe en mélanocytes dans ce protocole. La méthode d’emballage et de concentration des virus dans ce protocole est simple et facile à répéter et ne repose sur aucun autre réactif concentré auxiliaire. Ce protocole peut être suivi avec succès dans la plupart des laboratoires. Pour garantir la qualité du virus concentré, les points suivants nécessitent une attention particulière. L’un est le statut cellulaire de HEK-293T. Bien que les cellules HEK-293T...

Le vitiligo est une maladie de la peau qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Pour diverses raisons, y compris les anomalies métaboliques, le stress oxydatif, la génération de médiateurs inflammatoires, le détachement cellulaire et la réponse auto-immune, les mélanocytes fonctionnels sont perdus et la sécrétion de mélanine est arrêtée, conduisant au développement du vitiligo 1,2. Cette condition se produit largement et est particulièrement problématique sur le visage. Le traitement principal est l’utilisation systémique de corticostéroïdes et d’immunomodulateurs. La photothérapie peut être utilisée pour des maladies systémiques ou locales, et il existe des traitements chirurgicaux, tels que la greffe de peau perforée et la greffe de mélanocytesautologues 3,4,5. Cependant, les patients qui utilisent la pharmacothérapie et la photothérapie sont sujets aux rechutes, et ces traitements ont de faibles effets thérapeutiques à long terme. Le traitement chirurgical est traumatisant et n’est que modérément efficace 2,6. Par conséquent, une nouvelle stratégie thérapeutique efficace est nécessaire pour le vitiligo.
La reprogrammation des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) inverse ces cellules de leur état terminal à un état pluripotent, un processus médié par les facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc7. Cependant, en raison de la possibilité de tumorigénicité et du long temps de production, cette technologie a été accueillie avec scepticisme lorsqu’elle est appliquée à des contextes cliniques8. La reprogrammation directe est une technologie qui transforme un type de cellule terminale en un autre type de cellule terminale9. Ce processus est réalisé par des facteurs de transcription appropriés. Diverses cellules ont déjà été directement reprogrammées avec succès, notamment les cardiomyocytes10, les neurones11 et les cellules ciliées cochléaires12. Certains chercheurs ont même reprogrammé des tissus cutanés directement in situ, qui peuvent être utilisés pour la réparation des plaies13. Les avantages de la reprogrammation directe comprennent la réduction des temps d’attente et des coûts, la réduction du risque de cancer, la réduction des problèmes éthiques et une meilleure compréhension du mécanisme sous-jacent à la détermination du devenir cellulaire9.
Bien que la méthode de reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe actuellement aucune méthode précise pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes, en particulier en raison des nombreux facteurs de transcription à considérer14,15. Les facteurs de transcription, Mitf, Sox10 et Pax3, ont été utilisés pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes14. En revanche, la combinaison de MITF, PAX3, SOX2 et SOX9 a également été utilisée pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes humains dans une autre étude15. Dans ce protocole, malgré l’utilisation d’une méthode de dépistage différente, le même résultat a été obtenu avec la combinaison de Mitf, Sox10 et Pax3 pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes comme décrit précédemment14. Le développement d’un système pour générer des mélanocytes à partir d’autres cellules de la peau peut fournir un schéma pour transformer d’autres cellules cutanées de patients atteints de vitiligo en mélanocytes. Par conséquent, il est crucial de construire une méthode simple et efficace pour cette reprogrammation directe afin de générer des mélanocytes avec succès.

<table><tbody><tr><td>0,05 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>0,45 &mu ; Filtre</td><td>M Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyrène tube à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95 %/100 % éthanol</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>Stocké chez RT</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Concentration stock 40 mg/mL Concentration finale 24 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Chèvre anti-souris IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>Dilution de 1:500 pour l’utilisation d’antibiotiques</td></tr><tr><td>(Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Anticorps anti-TRP1/TYRP1</td><td>Millipore</td><td>MABC592</td><td>Hôte/Isotype : Souris IgG2a Réactivité de l’espèce : Souris/Humain Dilution de 1:200 pour utiliser l’anticorps</td></tr><tr><td>anti-TRP2/DCT</td><td>Abcam</td><td>ab74073</td><td>Hôte/Isotype : Lapin IgG Réactivité de l’espèce : Souris/Humain Dilution de 1:200 pour utiliser</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Concentration de stock 10 mM Final Concentration 3 &mu ; M</td></tr><tr><td>Toxine cholérique</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>Concentration stock 0,3 mg/mL Concentration finale 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 Chèvre anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td><td>Dilution de 1:500 pour utiliser</td></tr> le <tr><td>DMEM (High glucose)</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>stocké chez RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>stocké à -20 &deg ; C Inactivé à la chaleur avant utilisation</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Stocké dans les</td></tr><tr><td>plasmides RT GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2)</td><td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>Stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>Stocké à RT</td></tr><tr><td>Human EDN3</td><td>American-Peptide</td><td>88-5-10A</td><td>Concentration de stock 100 &mu ; M Concentration finale 0,1 &mu ; M</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Concentration de stock 100 &micro ; g/mL Concentration finale 0,5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>Stocké à RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Réactif de transfection, stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Masson-Fontana kit de coloration</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Baume neutre</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Stocké chez RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Stocké chez RT</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (TPA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td>Concentration de stock 1 mM Concentration finale 200 nM</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>réactif de transfection polymérique cationique ; Concentration du stock 8 &mu ; g/&micro ; L Concentration finale 4 ng/&micro ; L</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>BFGF humain recombinant</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Concentration de stock 4 &mu ; g/mL Concentration finale 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Insuline humaine recombinante</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>I3536</td><td>Concentration de matière première 10 mg/mL Concentration finale 5 & micro ; g/mL</td></tr> de <tr><td>FCC humain recombinant</td><td>R& D</td><td>255-SC-010</td><td>Concentration du stock 200 &mu ; g/mL Concentration finale 100 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>stocké chez RT</td></tr></tbody></table>

reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

La perte de fonction des mélanocytes conduit au vitiligo, qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace à long terme pour le vitiligo. Par conséquent, il est impératif de développer un traitement pratique et efficace pour le vitiligo. La technologie de médecine régénérative pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes semble être un nouveau traitement prometteur du vitiligo. Cela implique la reprogrammation directe des cellules de la peau du patient en mélanocytes fonctionnels pour aider à améliorer la perte de mélanocytes chez les patients atteints de vitiligo. Cependant, cette méthode doit d’abord être testée sur des souris. Bien que la reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe pas de protocole clair pour la reprogrammation directe en mélanocytes. De plus, le nombre de facteurs de transcription disponibles est écrasant. 
Ici, un protocole de système d’emballage de lentivirus concentré est présenté pour produire des facteurs de transcription sélectionnés pour reprogrammer les cellules de la peau en mélanocytes, y compris Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2. Des fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris ont été infectés par le lentivirus concentré pour tous ces facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des MEF en mélanocytes induits (iMels) in vitro. De plus, ces facteurs de transcription ont été examinés et le système a été optimisé pour une reprogrammation directe en mélanocytes. L’expression des marqueurs caractéristiques de la mélanine dans iMels au niveau du gène ou de la protéine a été significativement augmentée. Ces résultats suggèrent que la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique réussie pour le vitiligo et confirmer le mécanisme de développement des mélanocytes, ce qui fournira la base d’une reprogrammation directe ultérieure des fibroblastes en mélanocytes in vivo.

Cet article comprend les protocoles d’un système d’emballage de lentivirus concentré pour produire le lentivirus des facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes et les protocoles pour le dépistage des facteurs de transcription et la reprogrammation directe des mélanocytes à partir de MEF.
Le succès de la production de lentivirus concentré a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP (Figure 1A) ou pa...

Nous décrivons ici un système de reprogrammation directe optimisé pour les mélanocytes et un système d’emballage de virus concentré à haute efficacité qui assure une reprogrammation directe en douceur.

Reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Une reprogrammation directe pour générer des mélanocytes a été rapportée. Cependant, divers facteurs de transcription sont utilisés dans différentes études. Dans ce protocole, nous avons validé et réduit le nombre de facteurs de transcription toujours avec une efficacité de reprogrammation plus élevée.Nous avons établi un système de reprogrammation directe pour générer des mélanocytes en utilisant seulement trois facteurs de transcription, Mitf, Sox10 et PAX3, et modifié le système de culture pour le rendre plus stable et robuste. Comment régénérer les mélanocytes fonctionnels est une question importante qui peut aider à résoudre les limites thérapeutiques pour les maladies de dépigmentation comme le vitiligo. La bonne reprogrammation fournit une perspective Notre technique a les caractéristiques de commodité, de forte opérabilité et de stabilité, ce qui est plus facile à promouvoir et à répéter.Pour commencer la production du lentivirus concentré, plaquez 1,5 fois 10 aux 6 cellules HEK-293T dans une boîte de 60 millimètres et cultivez les cellules avec un milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures d’incubation, lorsque les cellules HEK-293T ont atteint 80 à 90% de confluence, remplacez le milieu par 3,5 mL de DMEM, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après avoir retiré les cellules de l’incubateur, remplacez le milieu par du DMEM contenant 2% de FBS et ajoutez le mélange complexe de transfection fraîchement préparé aux cellules de manière goutte à goutte.Mélanger doucement le mélange liquide. À la fin de huit heures, changez le milieu cellulaire avec 3,5 mL de milieu normal. Prélever le surnageant du virus à 24 et 48 heures.Ensuite, mélangez les surnageants du virus collectés à deux moments différents et centrifugez le mélange à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, passez le surnageant collecté à travers des filtres de 0,45 micron pour recueillir le filtrat dans un tube conique stérile de 50 mL. Concentrer le surnageant du virus filtré par centrifugation à 6 000 xg à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Une fois cela fait, assurez-vous que la pastille virale est visible au fond du tube conique. Versez le surnageant lentement. Pour dissoudre la pastille virale dans le milieu normal avec un par 100ème * volume du surnageant du virus.Utilisez une micropipette P1000 pour pipeter doucement de haut en bas jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène de virus concentré 100x. Divisez le virus concentré dans les tubes de microcentrifugation pour le stocker à 80 degrés Celsius. Plaque 1 fois 10 à la 5ème cellule HEK-293T dans un puits d’une plaque de six puits.Cultivez ces cellules avec le milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, ajouter 0,1 à 0,2 microlitre du virus concentré fluorescent 100x à chaque puits. Suivi de l’ajout de quatre nanogrammes par microlitre du réactif de transfection polymère cationique à chaque puits.Environ huit à douze heures après l’infection par le virus, remplacez le milieu par le milieu normal. Quarante-huit heures après l’infection, lavez la vaisselle avec 1 mL de PBS stérile pour éliminer les cellules mortes. Ensuite, essayez les cellules en utilisant 250 microlitres de solution de trypsine-EDTA à 0,05% par puits d’une plaque de six puits à température ambiante.Centrifugez la plaque à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans un mL de PBS et ajoutez la suspension de cellule à un tube à fond rond en polystyrène de cinq mL. Placez ensuite le tube dans le cytomètre en flux pour analyser l’échantillon.Pour la reprogrammation directe des fibroblastes, recouvrir un puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits avec 1 mL de solution de gélatine à 0,1% à température ambiante. Après 15 à 30 minutes, lorsque le puits est complètement recouvert de gélatine, aspirer une solution de gélatine à 0,1%. Ensuite, plaquez 5 fois 10 à la 4ème fibroblaste embryonnaire de souris, ou MEF, dans un puits d’une plaque de six puits recouverte de 0,1% de gélatine, et cultivez les cellules pendant la nuit avec le milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.Après 24 heures, lorsque les MEF ont atteint 40 à 50% de confluence, remplacez le milieu par le milieu normal. Ensuite, faites fondre le virus congelé et concentré sur de la glace. Calculez le volume du virus à ajouter à l’aide de l’équation, puis ajoutez le virus concentré pour les six facteurs de transcription à chaque puits, en fonction du volume calculé.Ajouter quatre microgrammes par mL de l’agent de transfection polymère cationique au puits. Considérez-le comme le jour zéro de l’infection à lentivirus. Le premier jour, après 8 à 12 heures d’infection, remplacez le milieu contenant le virus par le milieu normal frais, tout en ajoutant 0,5 microgramme par mL de puromycine pour dépister les lignées cellulaires infectées stables.Le deuxième jour, 48 heures après l’infection, remplacez progressivement le milieu surnageant par le milieu de reprogrammation. Modifiez un quart du volume moyen total avant d’ajouter trois CHIR99021 micromolaires. Du troisième au septième jour, en fonction de l’état des cellules, changez le milieu en le remplaçant progressivement par une proportion plus élevée de milieu de reprogrammation pour passer au milieu de reprogrammation complet dans les cinq jours.Ensuite, détachez les cellules avec 500 microlitres d’enzyme digestive 0,05% trypsine-EDTA pendant trois minutes à température ambiante. Lorsqu’environ soixante pour cent des cellules ont flotté, arrêtez la digestion en ajoutant le milieu normal, deux fois le volume de l’enzyme digestive. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL pour centrifuger à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant avant de suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec le milieu de reprogrammation. Lorsque vous avez terminé, plaquez les cellules re-suspendues dans un plat stérile de 60 millimètres. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone.Après quarante-huit heures d’infection à lentivirus dans les cellules HEK-293T, le succès de la production concentrée de lentivirus a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP ou par cytométrie en flux. Le titre du virus concentré s’est avéré élevé entre 10 et 8e TU/mL. Au cours de la reprogrammation directe des fibroblastes, la morphologie cellulaire a changé progressivement en synapse cellulaire allongée et en noyaux cellulaires élargis.Cependant, les cellules vieillissaient progressivement après le vingtième jour. L’élimination des facteurs de transcription, Mitf, Pax3 ou Sox10, a entraîné le silence de l’expression des gènes mélanocytaires, Tyr, Tyrp1 et Mlana, indiquant le plus grand impact sur la conversion des fibroblastes en mélanocytes. Par conséquent, l’expression des gènes mélanocytaires induits par la programmation directe avec trois facteurs de transcription était plus élevée par rapport à six facteurs de transcription.Pour identifier les mélanocytes induits par meF, ou iMels, l’expression de marqueurs mélanocytaires, TYRP1 et DCT a été détectée à l’aide d’une coloration immunofluorescente. De plus, les méthodes de coloration spécifiques à la mélanine telles que la coloration DOPA et Masson-Fontana ont montré des résultats positifs. Les cellules 293T doivent être réparties uniformément.En outre, l’ajout de mélange de transfection aux cellules doit être fait doucement pour empêcher les cellules de flotter. Le protocole est stable et pratique et peut être utilisé pour reprogrammer d’autres types de cellules. Il prévoit de fournir une référence et une stratégie pour la reprogrammation directe in vivo de la régénération des mélanocytes dans la médecine future.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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