Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés
10 août 2021
Nous présentons ici un protocole détaillé pour la reconstitution de l’activité d’extraction msp1 avec des composants entièrement purifiés dans des protéoliposomes définis.
L’utilisation des AAA-ATPases pour éliminer les protéines d’une bicouche lipidique est un thème commun dans le contrôle de la qualité des protéines. Une compréhension mécaniste de ce processus essentiel nécessite un système reconstitué. Les reconstitutions précédentes avec des AAA-ATPases étaient complexes et hétérogènes.
Notre système est simple et entièrement défini. Cela nous permet de manipuler l’AAA-ATPase Msp1, le substrat et l’environnement lipidique. Pour commencer, ajoutez un tampon de reconstitution préalablement préparé, des protéines et des liposomes Msp1 et TA purifiés dans un tube PCR, puis incubez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes.
Pendant l’incubation, coupez l’extrémité d’une pipette P200 à environ 1/8 de pouce de diamètre. Ensuite, vortexez soigneusement le tube contenant bioBeads pour obtenir un mélange uniforme. Ensuite, retirez rapidement le couvercle et utilisez la pointe de pipette P200 coupée pour transférer un volume approprié des billes dans un tube PCR vide.
Une fois l’incubation de 10 minutes pour la reconstitution terminée, à l’aide d’une pointe de pipette non coupée, retirez tout le liquide des BioBeads. Ensuite, transférez 100 microlitres de la reconstitution dans le tube avec les BioBeads et laissez-le tourner sur une roue pendant 16 heures. Le lendemain, faites tourner le tube dans un PicoFuge pour granuler les billes, puis transférez le matériau reconstitué dans un tube PCR propre et maintenez le tube sur la glace.
Pour éliminer les protéines qui n’ont pas réussi à se reconstituer dans les liposomes, équilibrez les colonnes de spin du glutathion avec un tampon d’extraction, ce qui implique généralement trois cycles de lavage avec 400 microlitres de tampon, suivis d’une centrifugation pour éliminer le tampon. Ensuite, ajoutez cinq micromoles de chaque chaperon au matériau reconstitué, suivis de 100 microlitres de tampon d’extraction, ce qui porte le volume à 200 microlitres. Ajoutez ce mélange aux colonnes de spin de glutathion équilibrées, puis branchez les colonnes de spin et faites-les pivoter pendant 30 minutes, permettant aux chaperons de se lier à la résine.
Après la rotation, faites tourner brièvement les colonnes. Recueillir le flux traversant, qui est le matériau pré-nettoyé appauvri en protéines agrégées. Placez-le sur de la glace et passez directement au test d’extraction.
Préparez les tubes pour l’analyse SDS-PAGE. Ajoutez 45 microlitres d’eau distillée double au tube d’entrée, 40 microlitres d’eau au tube d’écoulement et 16,6 microlitres de tampon de chargement 4X SDS-PAGE à chaque tube. Pour le test d’extraction, préparez la réaction d’extraction et portez le volume final à 200 microlitres avec le tampon d’extraction.
Ensuite, préchauffer le test d’extraction dans un bloc thermique de 30 degrés Celsius pendant deux minutes. Pour initier le test, ajoutez de l’ATP à une concentration finale de deux millimoles. Faites tourner le tube pendant cinq secondes dans un PicoFuge et incubez-le à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pendant l’incubation, prélever un échantillon de cinq microlitres de la réaction et l’ajouter au tube d’entrée. De plus, équilibrez une colonne de spin de glutathion pour chaque échantillon dans le test d’extraction, comme démontré précédemment. Une fois l’incubation de 30 minutes terminée, ajoutez 200 microlitres de tampon d’extraction au tube, ce qui porte le volume total à 400 microlitres.
Ensuite, ajoutez cette réaction à la résine de glutathion équilibrée et laissez-la tourner pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la rotation, faites tourner les colonnes pour recueillir l’écoulement, puis prélevez un échantillon de 10 microlitres pour le tube traversant. Lavez la résine deux fois avec 400 microlitres de tampon d’extraction, en éliminant le flux après chaque lavage.
Après le troisième lavage, maintenez le débit et prenez un échantillon de 50 microlitres pour le tube de lavage. Ensuite, préparez cinq millilitres de tampon d’élution en ajoutant du glutathion réduit à une concentration finale de cinq millimoles dans le tampon d’extraction. Ajouter 200 microlitres du tampon d’élution à la colonne de spin et incuber pendant cinq minutes.
Ensuite, centrifugez la colonne et collectez le flux. Répétez l’étape d’élution une fois de plus. Après la deuxième élution, prélever une aliquote de 50 microlitres de l’échantillon d’élution et l’ajouter au tube d’élute.
Après l’exécution d’un transfert western, l’efficacité d’extraction peut être déterminée en comparant la quantité de substrat dans la fraction élue avec la fraction d’entrée. Le signal dans le flux-through montre une certaine variabilité, mais est généralement similaire à la fraction d’entrée, et il n’y a pas de signal dans la fraction de lavage. En règle générale, il y a une efficacité d’extraction d’environ 10% pour le contrôle positif et une efficacité d’extraction de un à 2% pour le contrôle négatif.
Lorsque les conditions de reconstitution ne sont pas optimisées, les niveaux d’extraction sont comparables entre les échantillons positifs et négatifs. Cette technique a permis à notre laboratoire de tester les propriétés biophysiques du substrat affectant la reconnaissance par Msp1.
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Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé pour la reconstitution de l'activité d'extraction de Msp1 à l'aide de composants entièrement purifiés dans des protéoliposomes définis. L'étude vise à simplifier le processus de reconstitution des AAA-ATPases, qui sont essentielles pour le contrôle de qualité des protéines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les ATPases de type AAA jouent un rôle essentiel dans l'extraction des protéines des bicouches lipidiques.
- Une compréhension mécanistique de ce processus nécessite un système reconstitué.
- Les méthodes antérieures étaient complexes et hétérogènes.
- La présente étude décrit un système de reconstitution simple et entièrement défini.
Objectif de l'étude
- Manipuler la protéine AAA-ATPase Msp1 et son substrat.
- Créer un environnement lipidique défini pour l'étude.
- Approfondir la compréhension des mécanismes d'extraction des protéines.
Méthodes utilisées
- Préparation du tampon de reconstitution.
- Utilisation des protéines Msp1 et TA purifiées.
- Incorporation de liposomes dans un tube PCR.
- Incubation du mélange sur de la glace pendant 10 minutes.
Résultats principaux
- Un protocole simple et efficace de reconstitution de Msp1 a été établi.
- Le système défini permet une meilleure manipulation des composants.
- Une compréhension accrue du processus d'extraction a été obtenue.
- Les résultats indiquent une amélioration de l'efficacité du contrôle qualité des protéines.
Conclusions
- L'étude propose une méthode simple pour l'analyse des AAA-ATPases.
- Elle contribue à la compréhension de l'extraction des protéines à partir des membranes.
- Ce protocole peut être appliqué à des recherches ultérieures sur le contrôle de qualité des protéines.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet de réduire les risques mécanistiques liés à l'extraction des protéines médiée par les AAA-ATPases, une voie de contrôle qualité conservée, impliquée dans l'homéostasie protéique mitochondriale. En fournissant un système entièrement défini et reconstitué à partir de composants purifiés, il soutient la validation des cibles et le développement de tests pour des maladies associées au dysfonctionnement mitochondrial, notamment la neurodégénérescence et le cancer. Cette approche améliore la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en isolant les variables qui influencent la reconnaissance des substrats et l'efficacité d'extraction.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier le rôle de Msp1 dans l'élimination des protéines ancrées par leur extrémité C (tail-anchored) mal localisées, contribuant ainsi à la validation fonctionnelle de cibles dans les voies de protéostasie mitochondriale.
- Valeur opérationnelle : Utilise des protéines Msp1, des protéines TA et des liposomes purifiés afin d'éliminer la complexité cellulaire, permettant une manipulation précise de l'ATPase, du substrat et de l'environnement lipidique.
- Valeur prédictive : Facilite l'analyse structure-fonction de la reconnaissance du substrat par Msp1, aidant à l'identification de composés candidats modulant l'activité d'extraction des protéines.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Établit un dosage d'extraction quantitatif dans lequel l'efficacité est mesurée en comparant les niveaux de substrat dans l'éluat et dans l'entrée par immunotransfert (Western blot).
- Valeur opérationnelle : Définit des conditions normalisées : incubation sur glace de 10 minutes pour la reconstitution, rotation de 16 heures avec des BioBeads, extraction de 30 minutes assistée par ATP à 30 °C, suivie d'une élution par glutathion.
- Préparation du dosage : Les résultats incluent l'efficacité d'extraction (généralement d'environ ~10 % pour le témoin positif, 1–2 % pour le témoin négatif), permettant la détection de hits et le criblage dose-réponse dans un système reconstitué.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence translationnelle : Relie les mécanismes de protéostasie mitochondriale à des modèles de maladies dans lesquels un dysfonctionnement de Msp1 est impliqué dans le cancer, le vieillissement et la neurodégénérescence.
- Déminage mécanistique : Isole les variables affectant l'extraction—telles que la composition lipidique et les propriétés biophysiques du substrat—afin de clarifier l'engagement de la cible et de réduire l'ambiguïté dans la validation préclinique de celle-ci.
- Continuité : Permet la transition de la validation biochimique de la cible vers le criblage phénotypique dans des systèmes pertinents pour la maladie, en définissant un module d'extraction minimal et maîtrisable.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, permettant la validation de la cible grâce à l'analyse mécanistique de l'extraction des protéines, ce qui oriente le développement de tests pour les cascades de criblage et appuie les décisions d'avancement ou d'abandon fondées sur l'engagement de la cible et la modulation de la voie.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur la manière dont l'environnement lipidique et les caractéristiques du substrat influencent l'activité ATPase de Msp1 et l'efficacité d'extraction.
- Criblage : Offre une plateforme quantitative reconstituée pour évaluer l'effet de composés sur l'extraction dirigée par l'ATPase, avec des contrôles positifs et négatifs bien définis.
- Analyse : Produit des signaux mesurables — efficacité d'extraction par comparaison des fractions éluée et initiale sur immunoblot — permettant des comparaisons statistiques entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien avec la pertinence préclinique en modélisant une voie de contrôle qualité conservée dont la perturbation est associée à des maladies humaines.
- Réutilisation inter-projets : Le système défini reconstitué avec des liposomes peut être réutilisé dans divers projets étudiant les AAA-ATPases, la spécificité des substrats ou la modulation de l'extraction dépendant des lipides.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies d'extraction des protéines grâce à un système simplifié et défini.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation par l'utilisation de composants purifiés et d'un protocole étape par étape (reconstitution, traitement par BioBead, pré-élimination par chaperon, extraction dirigée par ATP, élution par glutathion).
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision « aller/ne pas aller » en facilitant l'évaluation précoce du potentiel de modulation de la cible avant les tests cellulaires ou phénotypiques.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles dans le contrôle de qualité mitochondrial en clarifiant la responsabilité mécanistique et la faisabilité de la cible.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en purification des protéines, reconstitution dans des liposomes et conception de dosages d'ATPase.
- Dépend de l'accès à une ultracentrifugeuse ou à une PicoFuge pour la formation du culot, à des colonnes à glutathion et à des blocs chauffants à température contrôlée.
- Exige une standardisation de la composition lipidique, des rapports protéine/lipide et de la concentration en ATP entre laboratoires afin d'obtenir une efficacité d'extraction reproductible.
- L'adaptation à d'autres protéines TA ou à d'autres AAA-ATPases peut nécessiter une optimisation du tampon de reconstitution, du temps d'incubation et des étapes de délipidation des billes.
- Les limites pratiques incluent la variabilité du signal du flux sortant et la dépendance à la sensibilité du Western blot pour les substrats peu abondants, comme mentionné dans la source.
