Name: Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Découvrez la reconstitution de l'activité d'extraction Msp1 avec des composants purifiés dans des protéoliposomes définis. Cette méthode simplifiée permet d'étudier le contrôle qualité des protéines membranaires.

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MLW a développé une partie de ce protocole pendant ses études postdoctorales avec le Dr Robert Keenan à l’Université de Chicago.
Ce travail est financé par la subvention NIH 1R35GM137904-01 à MLW.

Le bon fonctionnement mitochondrial dépend d’un système robuste de contrôle de la qualité des protéines. En raison des limites inhérentes à la fidélité des voies de ciblage de la protéine TA, les protéines TA mal localisées sont une source constante de stress pour les mitochondries. Un composant clé du réseau de protéostasie mitochondriale est Msp1, qui est une ATPase AAA+ ancrée dans la membrane qui élimine les protéines TA mal localisées de l’OMM. Ici, nous avons décrit comment préparer des protéoliposomes, co-reconsti...

La fonction cellulaire appropriée dépend d’un processus appelé protéostasie, qui garantit que les protéines fonctionnelles sont à la concentration et à l’emplacement cellulairecorrects 1. Les défaillances de la protéostase entraînent une altération de la fonction des organites et sont associées à de nombreuses maladies neurodégénératives2,3,4. Les protéines membranaires présentent des défis uniques pour le réseau de protéostasie car elles doivent être ciblées sur la membrane correcte tout en évitant l’agrégation des domaines transmembranaires hydrophobes (TMD)5. Par conséquent, des machines spécialisées ont évolué pour protéger le TMD hydrophobe du cytosol et faciliter le ciblage et l’insertion dans la membrane cellulaire appropriée6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Les mitochondries sont le centre métabolique de la cellule et sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que: la phosphorylation oxydative, la génération d’amas fer-soufre et la régulation apoptotique16,17. Ces organites endosymbiotiques contiennent deux membranes, appelées membrane mitochondriale interne (IMM) et membrane mitochondriale externe (OMM). Plus de 99% des 1 500 protéines mitochondriales humaines sont codées dans le génome nucléaire et doivent être transloquées sur une ou deux membranes différentes18,19. La fonction mitochondriale appropriée dépend donc d’un réseau de protéostasie robuste pour corriger toute erreur dans le ciblage ou la translocation des protéines.
Notre laboratoire se concentre sur un sous-ensemble de protéines membranaires mitochondriales appelées protéines ancrées dans la queue (TA), qui ont un seul domaine transmembranaire au terminus C20,21,22,23,24. Les protéines TA sont impliquées dans un certain nombre de processus essentiels, tels que l’apoptose, le transport des vésicules et la translocation des protéines25. La topologie unique des protéines TA nécessite une insertion post-traductionnelle, qui se produit dans le réticulum endoplasmique (ER) par l’entrée guidée des voies DU complexe protéique membranaire (CEM) ancrées dans la queue (GET) ou du réticulum endoplasmique ou dans l’OMM par une voie mal caractérisée20,26,27,28. Les propriétés biophysiques du TMD sont nécessaires et suffisantes pour guider les protéines TA vers la membrane correcte29. La reconnaissance de caractéristiques biophysiques plutôt que d’un motif de séquence défini limite la fidélité des voies de ciblage5. Ainsi, la mauvaise localisation des protéines TA est un stress commun pour les réseaux de protéostasie. Le stress cellulaire, tel que l’inhibition de la voie GET, provoque une augmentation de la mauvaise localisation des protéines à l’OMM et un dysfonctionnement mitochondrial à moins que ces protéines ne soient rapidement éliminées30,31.
Un thème commun dans la protéostasie membranaire est l’utilisation de protéines AAA+(ATPase Associée avec des ctivités cellulaires A)pour éliminer les protéines anciennes, endommagées ou mal localisées de la bicouche lipidique1,32,33,34,35,36,37,38 . Les protéines AAA+ sont des moteurs moléculaires qui forment des anneaux hexamériques et subissent des mouvements dépendants de l’ATP pour remodeler un substrat, souvent par translocation à travers un pore axial étroit39,40. Bien que de grands efforts aient été consacrés à l’étude de l’extraction des protéines membranaires par les AAA+ ATPases, les reconstitutions sont complexes ou impliquent un mélange de lipides et de détergent41,42, ce qui limite le pouvoir expérimental d’examiner le mécanisme d’extraction du substrat de la bicouche lipidique.
Msp1 est une ATPase AAA+ hautement conservée ancrée dans l’OMM et les peroxysomes qui joue un rôle essentiel dans la protéostasie membranaire en éliminant les protéines TA mal localisées43,44,45,46,47. Il a également été récemment démontré que Msp1 soulageait le stress lié à l’importation de protéines mitochondriales en éliminant les protéines membranaires qui calent lors de la translocation à travers l’OMM48. La perte de Msp1 ou de l’homologue humain ATAD1 entraîne une fragmentation mitochondriale, des échecs dans la phosphorylation oxydative, des convulsions, une augmentation des blessures après un accident vasculaire cérébral et une mort prématurée31,49,50,51 ,52,53,54,55,56.
Nous avons montré qu’il est possible de co-reconstituer des protéines TA avec Msp1 et de détecter l’extraction de la bicouche lipidique57. Ce système simplifié utilise des protéines entièrement purifiées reconstituées en liposomes définis qui imitent l’OMM (Figure 1)58,59. Ce niveau de contrôle expérimental peut répondre à des questions mécanistes détaillées d’extraction de substrat qui sont expérimentalement insolubles avec des reconstitutions plus complexes impliquant d’autres protéines AAA +. Ici, nous fournissons des protocoles expérimentaux détaillant nos méthodes de préparation des liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction. Nous espérons que ces détails expérimentaux faciliteront l’étude plus approfondie du processus essentiel mais mal compris de la protéostasie membranaire.

<table><tbody><tr><td>Biobilles</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidyl inositol de foie bovin</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td>PI</td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine d’oeuf de poule</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>PC Phosphatidyléthanolamine d’oeuf de poule</td><td>Avanti</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL Select réactif de détection western blot</td><td>GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Supports de filtre</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre</td><td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de centrifugation au glutathion</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrudeuse</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Membrane polycarbonate</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td>200 nM</td></tr><tr><td>membrane PVDF</td><td>Thermo Fisher</td><td>88518</td><td>45 & micro ; M</td></tr><tr><td>Rabbit anti-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7245</td><td></td></tr><tr><td>Synthétique 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérine</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>Synthétique 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycérol</td><td>Avanti</td><td>710335C</td><td>Seringue TOCL</td></tr><tr><td>, 1 mL</td><td>Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 1 mL, étanche aux</td> <td>gazAvanti</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution de l’activité d’extraction msp1 avec des composants entièrement purifiés

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

En tant que centre de phosphorylation oxydative et de régulation apoptotique, les mitochondries jouent un rôle vital dans la santé humaine. La fonction mitochondriale appropriée dépend d’un système de contrôle de la qualité robuste pour maintenir l’homéostasie des protéines (protéostasie). Le déclin de la protéostase mitochondriale a été lié au cancer, au vieillissement, à la neurodégénérescence et à de nombreuses autres maladies. Msp1 est une ATPase AAA+ ancrée dans la membrane mitochondriale externe qui maintient la protéostasie en éliminant les protéines mal localisées ancrées dans la queue. En utilisant des composants purifiés reconstitués en protéoliposomes, nous avons montré que Msp1 est nécessaire et suffisant pour extraire une protéine modèle ancrée dans la queue d’une bicouche lipidique. Notre système reconstitué simplifié surmonte plusieurs des barrières techniques qui ont entravé l’étude détaillée de l’extraction des protéines membranaires. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour la génération de liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction Msp1.

Pour interpréter correctement les résultats, le gel sans tache et le western blot doivent être vus ensemble. Le gel sans tache assure une charge égale sur tous les échantillons. Lors de la visualisation du gel sans taches, les accompagnateurs (GST-calmoduline et GST-SGTA) seront visibles dans les voies INPUT (I) et ELUTE (E). Vérifiez que l’intensité de ces bandes est uniforme dans tous les échantillons INPUT. De même, assurez-vous que l’intensité est uniforme dans les échantillons ELUTE. L’ELUTE est 5x plus concentré qu...

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la reconstitution de l’activité d’extraction msp1 avec des composants entièrement purifiés dans des protéoliposomes définis.

Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

L’utilisation des AAA-ATPases pour éliminer les protéines d’une bicouche lipidique est un thème commun dans le contrôle de la qualité des protéines. Une compréhension mécaniste de ce processus essentiel nécessite un système reconstitué. Les reconstitutions précédentes avec des AAA-ATPases étaient complexes et hétérogènes.Notre système est simple et entièrement défini. Cela nous permet de manipuler l’AAA-ATPase Msp1, le substrat et l’environnement lipidique. Pour commencer, ajoutez un tampon de reconstitution préalablement préparé, des protéines et des liposomes Msp1 et TA purifiés dans un tube PCR, puis incubez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes.Pendant l’incubation, coupez l’extrémité d’une pipette P200 à environ 1/8 de pouce de diamètre. Ensuite, vortexez soigneusement le tube contenant bioBeads pour obtenir un mélange uniforme. Ensuite, retirez rapidement le couvercle et utilisez la pointe de pipette P200 coupée pour transférer un volume approprié des billes dans un tube PCR vide.Une fois l’incubation de 10 minutes pour la reconstitution terminée, à l’aide d’une pointe de pipette non coupée, retirez tout le liquide des BioBeads. Ensuite, transférez 100 microlitres de la reconstitution dans le tube avec les BioBeads et laissez-le tourner sur une roue pendant 16 heures. Le lendemain, faites tourner le tube dans un PicoFuge pour granuler les billes, puis transférez le matériau reconstitué dans un tube PCR propre et maintenez le tube sur la glace.Pour éliminer les protéines qui n’ont pas réussi à se reconstituer dans les liposomes, équilibrez les colonnes de spin du glutathion avec un tampon d’extraction, ce qui implique généralement trois cycles de lavage avec 400 microlitres de tampon, suivis d’une centrifugation pour éliminer le tampon. Ensuite, ajoutez cinq micromoles de chaque chaperon au matériau reconstitué, suivis de 100 microlitres de tampon d’extraction, ce qui porte le volume à 200 microlitres. Ajoutez ce mélange aux colonnes de spin de glutathion équilibrées, puis branchez les colonnes de spin et faites-les pivoter pendant 30 minutes, permettant aux chaperons de se lier à la résine.Après la rotation, faites tourner brièvement les colonnes. Recueillir le flux traversant, qui est le matériau pré-nettoyé appauvri en protéines agrégées. Placez-le sur de la glace et passez directement au test d’extraction.Préparez les tubes pour l’analyse SDS-PAGE. Ajoutez 45 microlitres d’eau distillée double au tube d’entrée, 40 microlitres d’eau au tube d’écoulement et 16,6 microlitres de tampon de chargement 4X SDS-PAGE à chaque tube. Pour le test d’extraction, préparez la réaction d’extraction et portez le volume final à 200 microlitres avec le tampon d’extraction.Ensuite, préchauffer le test d’extraction dans un bloc thermique de 30 degrés Celsius pendant deux minutes. Pour initier le test, ajoutez de l’ATP à une concentration finale de deux millimoles. Faites tourner le tube pendant cinq secondes dans un PicoFuge et incubez-le à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.Pendant l’incubation, prélever un échantillon de cinq microlitres de la réaction et l’ajouter au tube d’entrée. De plus, équilibrez une colonne de spin de glutathion pour chaque échantillon dans le test d’extraction, comme démontré précédemment. Une fois l’incubation de 30 minutes terminée, ajoutez 200 microlitres de tampon d’extraction au tube, ce qui porte le volume total à 400 microlitres.Ensuite, ajoutez cette réaction à la résine de glutathion équilibrée et laissez-la tourner pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la rotation, faites tourner les colonnes pour recueillir l’écoulement, puis prélevez un échantillon de 10 microlitres pour le tube traversant. Lavez la résine deux fois avec 400 microlitres de tampon d’extraction, en éliminant le flux après chaque lavage.Après le troisième lavage, maintenez le débit et prenez un échantillon de 50 microlitres pour le tube de lavage. Ensuite, préparez cinq millilitres de tampon d’élution en ajoutant du glutathion réduit à une concentration finale de cinq millimoles dans le tampon d’extraction. Ajouter 200 microlitres du tampon d’élution à la colonne de spin et incuber pendant cinq minutes.Ensuite, centrifugez la colonne et collectez le flux. Répétez l’étape d’élution une fois de plus. Après la deuxième élution, prélever une aliquote de 50 microlitres de l’échantillon d’élution et l’ajouter au tube d’élute.Après l’exécution d’un transfert western, l’efficacité d’extraction peut être déterminée en comparant la quantité de substrat dans la fraction élue avec la fraction d’entrée. Le signal dans le flux-through montre une certaine variabilité, mais est généralement similaire à la fraction d’entrée, et il n’y a pas de signal dans la fraction de lavage. En règle générale, il y a une efficacité d’extraction d’environ 10% pour le contrôle positif et une efficacité d’extraction de un à 2% pour le contrôle négatif.Lorsque les conditions de reconstitution ne sont pas optimisées, les niveaux d’extraction sont comparables entre les échantillons positifs et négatifs. Cette technique a permis à notre laboratoire de tester les propriétés biophysiques du substrat affectant la reconnaissance par Msp1.

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Ici, nous décrivons un protocole pour la purification de la très active Hsp104, un AAA + hexamérique protéines de la levure, qui couple l'hydrolyse d'ATP à la désagrégation des protéines. Ce schéma exploite une construction His6-marqués pour la purification d'affinité à...

Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l'incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.

Une méthode étape par étape pour la reconstitution d&#39;un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

Cette vidéo présente un protocole in vitro pour étudier l’élimination médiée par Msp1 de protéines TA mal localisées intégrées dans la bicouche lipidique des liposomes. Les protéines Msp1 et TA sont co-reconstituées en liposomes, et la translocation dépendante de l’ATP des protéines TA est confirmée par purification par affinité.

Test d’extraction Msp1 pour étudier l’élimination des protéines TA mal localisées

La protéine de nucléoïde mitochondrial de la levure, Mgm101, est une protéine de recombinaison Rad52 type qui forme des gros anneaux oligomères. Un protocole est décrit pour préparer Mgm101 recombinant soluble avec la protéine de liaison du maltose (MBP)-tagging stratégie couplée avec échange de cations et la chromatographie d'exclusion stérique.

Préparation de la recombinaison de protéines Mgm101 par la stratégie de marquage MBP basée

Une méthode est décrite pour la purification efficace de protéines de fusion bi-Strep-marqués et leurs complexes spécifiques sur streptavidine modifiée (Strep-Tactin) résine réticulé de manière covalente avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3). Le procédé présente les avantages d'une vitesse rapide, une bonne récupération de la protéine cible et de haute pureté, et est compatible avec une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

Une étape de purification de protéines Twin-Strep-marqués et leurs complexes sur Strep-Tactin résine réticulée Avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Nous fournissons un protocole pour in vitro tests d’auto-organisation de l’esprit et le mien sur une double couche lipidique pris en charge dans une chambre ouverte. En outre, nous décrivons comment placer le dosage microcompartments PDMS revêtu de lipides à reproduire in vivo des conditions de confinement de la réaction.

In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

L’insertion co-translationnelle dans des nanodisques préformés permet d’étudier des protéines membranaires synthétisées acellulaires dans des environnements lipidiques définis sans contact avec des détergents. Ce protocole décrit la préparation des composants essentiels du système et les paramètres critiques pour améliorer l’efficacité de l’expression et la qualité de l’échantillon.

Insertion co-translationnelle de protéines membranaires dans des nanodisques préformés

Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Cet article décrit une méthodologie de surexpression de Nsp15 recombinant, une nucléase toxique, dans un système d’expression C41(DE3), suivie d’une purification de la protéine marquée à l’aide de la chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique. Ces protocoles peuvent être adaptés à d’autres protéines toxiques difficiles.

Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli

Cette étude décrit la procédure de reconstitution du canal K+ sensible aux acides lié à la protéine membranaire TWIK (Task2) en nanodisques. L’assemblage réussi a été confirmé par la cryomicroscopie électron à particule unique, qui a permis de fournir des moyennes de classe bidimensionnelles bien définies.

Une technique pour stabiliser les protéines membranaires dans les nanodisques

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