Name: In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Découvrez une hybridation in situ optimisée pour visualiser l'expression génique chez les larves et juvéniles de Danio rerio pendant le développement du mésonephros. Cette méthode améliore la pénétration des sondes et la visualisation rénale.

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Le financement a été fourni par la Pennsylvania Academy of Science, le Commonwealth of Pennsylvania Biologists et l’Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology et Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) a été fournie par le Dr Neil Hukriede (Université de Pittsburgh).

L’utilisation de larves et de juvéniles de poisson zèbre est approuvée par l’IUP IACUC (protocole #02-1920, #08-1920). Les détails du contenu de la solution sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Élever des larves
REMARQUE: Il faudra jusqu’à 21 jours ou plus pour élever les larves et les juvéniles au stade d’intérêt.
<ol><li>Installez le poisson-zèbre adulte pour qu’il s’accouple en ajoutant 1 poisson mâle et 1 poisson femelle dans un aquarium d’accouplement en fin d’après-midi après leur dernier repas. REMARQUE: Tous les couples de poissons ne s’accouplent pas. Commencez par mettre en place 20 paires pour déterminer le taux d’accouplement et ajustez-le en conséquence dans les expériences futures.</li>
	<li>Le lendemain, après la fin de l’accouplement des poissons (vers 13 heures), collectez les embryons avec un milieu E3 dans des plaques de Pétri.<ol>
<li>Assurez-vous qu’il n’y a pas plus de 30 embryons par plaque.</li>
		<li>Enlevez les débris (comme les matières fécales) des plaques de Petri et ajoutez 20 mL de milieu E3.</li>
		<li>Incuber à 28,5 °C pendant 1 jour.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remettez le poisson-zèbre adulte dans le système aquatique.</li>
	<li>À 1 dpf, remplacez le support E3 par du E3 frais.<ol>
<li>Incuber à 28,5 °C pendant 4 jours supplémentaires jusqu’à 5 dpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettez un écran de 400 μm dans un réservoir de 2,8 L et remplissez-le de 2 cm d’eau système.<ol>
<li>Ajouter les 5 larves dpf de 1 plaque (jusqu’à 30 larves au total).</li>
		<li>Mettez le réservoir dans le système aquatique, mais ne démarrez pas le débit d’eau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nourrissez les larves avec 4 mL de poudre deux fois par jour jusqu’à 14 dpf.</li>
	<li>À 6 dpf, commencez le débit d’eau à 1 goutte à goutte par seconde. REMARQUE: Vérifiez le débit d’eau quotidiennement et ajustez-le en conséquence.</li>
	<li>À 8 dpf, augmentez le débit d’eau à un flux lent et régulier.</li>
	<li>À 14 dpf, nourrissez des crevettes en saumure vivantes en plus de la nourriture en poudre.</li>
</ol>2. Jour 1 - 2: Fixation des larves
<ol><li>Retirez un réservoir de larves au moment souhaité.</li>
	<li>Remplissez une plaque de Petri avec 20 mL d’eau système.</li>
	<li>Utilisez un filet à mailles fines pour ramasser doucement les larves et les amener à la surface de l’eau.<ol>
<li>Coupez l’extrémité d’une pipette de transfert pour donner une ouverture plus large et transférez les larves sur la plaque de Pétri. La plus grande bouche de pipette permet le transfert de plusieurs petites larves ou de quelques plus grosses à la fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 2 mL de tricaïne (2%, pH 7 stock) pour immobiliser les larves.<ol>
<li>Une fois que les larves ont cessé de bouger, retirez la majeure partie de l’eau et ajoutez 10 ml de tricaïne. Attendez 15 min pour que les larves soient euthanasiées.</li>
		<li>Facultatif: Pour les juvéniles de plus de 8 mm, coupez la tête et la queue avec une lame de rasoir (après euthanasie) sous un microscope à dissection pour améliorer la pénétration de la solution de fixation. Assurez-vous d’enregistrer la longueur totale de chaque animal avant de couper la tête et la queue et d’isoler chacun dans sa propre plaque de Pétri. Reportez-vous à l’étape 3 pour savoir comment mesurer les animaux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplacer la tricaïne par 20 mL de solution fixatrice (4% de paraformaldéhyde, 1% de DMSO). Remettez le couvercle sur la plaque de Petri et basculez lentement dans une hotte. REMARQUE: Il est important d’utiliser une plate-forme à bascule. Une plate-forme tremblante avec un mouvement circulaire entraînera la courbure de l’axe de l’animal. Utilisez uniquement une solution de fixation fraîche (non congelée préfabriquée). ATTENTION: La solution de fixation contient du paraformaldéhyde, qui est un cancérogène probable. Utilisez une hotte (ou un masque) et des gants pour mesurer la poudre.</li>
	<li>Après 30 min, remplacez la solution de fixation par une nouvelle solution de fixation.<ol>
<li>Recueillir la solution de fixation utilisée dans un conteneur à déchets séparé pour une élimination appropriée.</li>
		<li>Transférer les larves dans un tube de 50 mL contenant 25 mL de solution de fixation fraîche.</li>
		<li>Assurez-vous que le bouchon est serré et basculez lentement à 4 °C pendant 2 jours. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Jour 3 : Mesure des larves
<ol><li>Dans une hotte, remplacer la solution de fixation par 20 mL de PBST.</li>
	<li>Transférer les larves dans une plaque de Pétri.</li>
	<li>Placez une règle plate sur un microscope à dissection et placez la plaque de Petri sur la règle.</li>
	<li>Utilisez un manipulateur de cils pour déplacer chaque larve sur la règle afin de mesurer sa longueur totale (du museau à l’extrémité de la nageoire caudale) (Figure 1).</li>
	<li>Combiner plusieurs larves de longueurs similaires (p. ex. 5,0 mm et 5,1 mm) en un flacon en verre de 5,5 mL, jusqu’à 10 larves par flacon.</li>
</ol>4. Jour 3 - 4: Déshydratation
<ol><li>Remplacez le PBST par 4 mL de méthanol à 100 %. Faire basculer le flacon pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remplacer le méthanol par du méthanol frais et de la roche pendant 5 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Conserver le flacon à -20 °C pendant 2 jours. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.</li>
</ol>5. Jour 5 : Réhydratation
<ol><li>Réchauffer le flacon à température ambiante.</li>
	<li>Remplacer le méthanol par 4 mL de 75 % de méthanol/25 % de PBST. Rocher pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remplacer la solution à l’étape 5.2 par 4 mL de méthanol à 50 % /50 % de PBST et de la roche pendant 5 min.</li>
	<li>Remplacer la solution à l’étape 5.3 par 4 mL de méthanol à 25 % /75 % de PBST et de la roche pendant 5 min.</li>
	<li>Remplacez la solution à l’étape 5.4 par 4 mL de PBST et de la roche pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
</ol>6. Jour 5 : Digestion de la protéinase K
<ol><li>Remplacer le PBST par 2 mL de la solution de protéinase K (20 μg/mL, concentration finale de DMSO à 1 % dans le PBST) et la roche à température ambiante pendant 30 min. REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm auront besoin d’un temps d’incubation plus long et / ou d’une concentration plus élevée de protéinase K. Le temps exact et la concentration devront être déterminés empiriquement. Commencez par une augmentation de 10 minutes du temps d’incubation pour chaque 0,5 mm de plus de 6 mm.</li>
	<li>Remplacer la solution de protéinase K par 4 mL de PBST et de roche pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Remplacer le PBST par 4 mL de solution de fixation fraîche et de la roche pendant 1 h. Il est possible d’incuber plus longtemps à 4 °C pour plus de commodité.</li>
</ol>7. Jour 5 : Blanchiment
<ol><li>Remplacer la solution de fixation par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Transférer les larves dans une plaque de 6 puits (jusqu’à 10 larves par puits).</li>
	<li>Remplacez le PBST par 3 mL de solution de blanchiment fraîche.</li>
	<li>Rock à température ambiante et surveillez la pigmentation sous un microscope à dissection toutes les 5 minutes. Recherchez la disparition de la pigmentation le long du mésonéphros (dorsale à la vessie natatoire et à l’intestin). REMARQUE: Pour les larves jusqu’à 6 mm de long, il faudra jusqu’à 20 minutes pour blanchir la pigmentation entourant les mésonéphros. Ne blanchissez pas plus longtemps que nécessaire pour préserver l’intégrité des larves.</li>
	<li>Transférez les larves dans un flacon en verre.</li>
	<li>Remplacer la solution de blanchiment par 4 mL de PBST. Rock pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Remplacer le PBST par 4 mL de solution de fixation fraîche et de la roche pendant 1 h. Il est possible d’incuber plus longtemps à 4 °C pour plus de commodité.</li>
</ol>8. Jour 5 : Préhybridisation
REMARQUE: Pour les étapes effectuées à 70 ° C, il est important de travailler rapidement pour minimiser le refroidissement du flacon.
<ol><li>Remplacer la solution de fixation par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Remplacer le PBST par 4 mL de la solution Hyb- et la roche à température ambiante pendant 10 min. ATTENTION: Les solutions Hyb-, Hyb+ et sonde contiennent du formamide, qui peut irriter la peau. Utilisez des gants pour manipuler ces solutions.</li>
	<li>Remplacez l’Hyb- par 4 mL d’Hyb- frais et de roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.<ol>
<li>Collectez les solutions Hyb-, Hyb+ et sonde usagées dans un conteneur à déchets séparé pour une élimination appropriée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplacez le Hyb- par 4 mL de la solution Hyb+.</li>
	<li>Incuber le flacon à 70 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Diluer la sonde EGFP-fluorescéine 1:100 dans 500 μL d’Hyb+ et l’incuber O/N à 70 °C. REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour la synthèse de la sonde.</li>
</ol>9. Jour 6 : Hybridation de sonde
<ol><li>Remplacer la solution Hyb+ dans le flacon par la sonde préchauffée et incuber à 70 °C pendant la nuit. REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm ont besoin de 2 jours d’incubation.</li>
	<li>Préchauffez le tampon de lavage, 2x SSCT et 0,2x SSCT solutions à 70 °C pendant la nuit.</li>
</ol>10. Jour 7 : Lavage de la sonde
<ol><li>Remplacer la sonde par 4 mL de tampon de lavage préchauffé et incuber à 70 °C pendant 30 min.<ol>
<li>Recueillir la sonde usagée dans un conteneur à déchets séparé pour une élimination appropriée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplacer le tampon de lavage par 4 mL de tampon de lavage frais et incuber à 70 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Remplacez le tampon de lavage par 4 mL de la solution préchauffée 2x SSCT et incubez-le à 70 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 50 mL de SSCT 0,2x préchauffé dans un tube de 50 mL.<ol>
<li>Insérez une passoire à cellules (100 μm) dans le haut du tube. Assurez-vous que la passoire cellulaire est poussée jusqu’à ce qu’elle s’arrête.</li>
		<li>Transférez les larves du flacon en verre dans la passoire cellulaire. Assurez-vous que les larves sont immergées dans le tampon et incubent à 70 °C pendant 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez un nouveau tube contenant 50 mL de SSCT 0,2x préchauffé.<ol>
<li>Transférer la crépine de l’étape 10.4.2 dans le nouveau tube de 0,2x SSCT et incuber à 70 °C pendant 2 h.</li>
		<li>Répétez l’étape 10.5 une fois de plus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. Jour 7 : Blocage
<ol><li>Transférer les larves dans un nouveau flacon en verre et les refroidir à température ambiante.</li>
	<li>Remplacez le SSCT 0,2x par 4 mL de 67% 0,2x SSCT /33% MABT et de la roche à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacer la solution à l’étape 11.2 par 4 mL de 33% 0.2x SSCT/67% MABT et roche pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacer la solution de l’étape 11.3 par 4 mL de MABT et de roche pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacer le MABT par 4 mL de MABT frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Remplacer le MABT par 4 mL de la solution bloquante et incuber à 4 °C pendant la nuit. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.</li>
</ol>12. Jour 8 - 9: Incubation d’anticorps
<ol><li>Diluer l’anticorps anti-fluorescéine 1:5 000 dans une solution bloquante de 500 μL.</li>
	<li>Remplacer la solution bloquante par la solution d’anticorps et incuber à 4 °C pendant 2 jours. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité.<ol>
<li>Faire tourbillonner le flacon deux fois par jour pour agiter les larves. REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm ont besoin de 1 à 2 jours d’incubation supplémentaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Jour 10 - 11: Lavage des anticorps
<ol><li>Remplacer la solution d’anticorps par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Transférer les larves dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 40 mL de PBST2. Posez le tube sur le côté et basculez à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Remplacez le PBST2 par 40 mL de PBST2 frais et faites basculer à 4 °C pendant la nuit. Il est possible d’incuber plus longtemps pour plus de commodité. REMARQUE: Les larves de plus de 6 mm ont besoin de 1 à 2 jours de lavage supplémentaires.</li>
</ol>14. Jour 12 : Coloration
<ol><li>Transférer les larves dans une assiette de 6 puits.</li>
	<li>Remplacez le PBST2 par 3 mL de tampon de coloration et de roche à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Remplacez le tampon de coloration par 3 mL de tampon de coloration frais et de roche pendant 5 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Remplacez le tampon de coloration par 3 mL de la solution de coloration. Couvrez avec du papier d’aluminium et surveillez la coloration au cours des prochaines heures.<ol>
<li>Pour les sondes à signal faible, incuber à 4 °C pendant la nuit et remplacer la solution de coloration par une solution de coloration fraîche une fois entre les deux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lorsque l’intensité de coloration souhaitée est atteinte, remplacez la solution de coloration par 3 mL de la solution d’arrêt et de la roche pendant 30 min.</li>
	<li>Remplacer la solution d’arrêt par 3 mL de solution d’arrêt fraîche et de roche pendant 30 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Transférer les larves dans un nouveau flacon en verre et remplacer la solution d’arrêt par 4 mL de solution de fixation fraîche et incuber pendant 1 h à température ambiante. Il est possible d’incuber plus longtemps à 4 °C pour plus de commodité.</li>
	<li>Conservez les larves dans la solution fixatrice dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à un an.</li>
</ol>15. Jour 12 : Imagerie
<ol><li>Remplacer la solution de fixation par 4 mL de PBST et de roche à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Transférer les larves dans une assiette de 6 puits.</li>
	<li>Remplacez le PBST par 4 mL de PBST frais et de la roche pendant 10 min. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Remplacer le PBST par 3 mL de glycérol à 50 % (dans le PBST) et de la roche pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacer la solution à l’étape 15.4 par 3 mL de glycérol à 100% sans bascule pendant 10 min.</li>
	<li>Utilisez un microscope à dissection pour imager les larves directement dans la plaque à 6 puits ou transférez les larves dans une lame de dépression à l’image sous un microscope composé. Utilisez un manipulateur de cils pour orienter les larves.</li>
</ol>

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<li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li>
<li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li>
<li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

La méthode d’hybridation in situ décrite ici vise à étudier le développement du mésonéphros. Cependant, il peut être appliqué pour étudier le développement d’autres tissus et organes pendant la métamorphose, tels que l’intestin, le système nerveux, les écailles et la pigmentation14. Des sondes peuvent être générées pour des gènes endogènes ou des marqueurs fluorescents dans des lignées transgéniques.
Il est essentiel que les larves restent intactes afin d’obser...

L’embryon de poisson-zèbre est un modèle important pour étudier le développement tissulaire en raison de sa petite taille, de sa transparence, des outils disponibles et de sa survie sans se nourrir jusqu’à cinq jours1,2. Il a grandement contribué à la compréhension du développement des reins et à la conservation entre le poisson-zèbre et les mammifères3,4,5. Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des fluides, la filtration du sang et l’excrétion des déchets6. Le néphron, l’unité fonctionnelle du rein, comprend un filtre sanguin relié à un long tubule. Chez le poisson-zèbre, deux structures rénales se forment tout au long de sa vie. Le pronephros (le rein embryonnaire temporaire) se forme d’abord au cours du développement précoce. Il se compose de deux néphrons courant le long de l’axe antérieur-postérieur et devient fonctionnel environ 2 jours après la fécondation (dpf). L’utilité du pronephros réside dans sa simplicité, n’ayant que deux néphrons qui sont pour la plupart linéaires et faciles à visualiser (bien que le tubule alambiqué proximal commence à s’enrouler à trois dpf)3. Cela a facilité non seulement l’étude de son développement précoce à partir du mésoderme intermédiaire, mais aussi le modèle de segmentation et la réparation des tubules7,8.
L’utilité du poisson-zèbre devient limitée après cinq dpf, lorsque le jaune est diminué et que les larves dépendent de l’alimentation du système aquatique9. Vers l’âge de 2 semaines, les larves subissent une métamorphose en juvéniles, où de nouveaux tissus se forment et d’anciens tissus sont perdus et/ou réorganisés9. C’est aussi à ce moment-là que le mésonéphros (le rein adulte permanent) se forme10,11,12. Le premier néphron adulte se forme près de la sixième somite et fusionne avec le tubule distal précoce du pronephros. Des néphrons supplémentaires sont ajoutés postérieurs à cette position dans un premier temps, mais aussi vers l’avant plus tard. Les néphrons primaires de cette première onde fusionnent avec les tubules des pronephros et partagent une lumière commune pour déposer leurs déchets. Les néphrons secondaires se forment dans l’onde suivante et fusionnent avec les néphrons primaires. Ce processus répétitif crée un mésonéphros ramifié, un peu semblable au rein de mammifère. Vraisemblablement, le pronephros finit par perdre son identité de tubule et devient deux canaux collecteurs majeurs où tous les néphrons drainent leurs déchets13.
Avant la formation du premier néphron adulte, des cellules progénitrices uniques commencent à apparaître chez les larves d’environ 4 mm (longueur totale) (~ 10 dpf). Ces cellules, qui sont marquées dans la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), adhèrent aux pronéphros et semblent migrer vers de futurs sites de néphrogenèse. Les cellules individuelles fusionnent en grappes, qui se différencient en nouveaux néphrons12. On ne sait pas où résident ces cellules ou quels gènes elles expriment avant le début de la mésonéphrogenèse.
Comprendre le développement des mésonéphros fournit des informations sur le rein des mammifères d’une manière que les pronéphros ne peuvent pas. Ceux-ci incluent la formation d’agrégats néphrogéniques à partir de cellules progénitrices uniques, l’intégration fonctionnelle de nouveaux néphrons avec les cellules existantes et la morphogenèse ramifiée. Cependant, il y a des limites à l’étude du développement postmbryonique. Les larves sont moins transparentes en raison de leur plus grande taille et de leur pigmentation. La chronologie du développement n’est pas synchrone entre les animaux individuels et dépend fortement de facteurs environnementaux, tels que l’alimentation et l’encombrement9,14. Bien qu’il existe des réactifs knockdown, ils sont moins efficaces chez les larves que chez les embryons15. Dans ce protocole, une méthode d’hybridation in situ pour déterminer l’expression des gènes au cours du développement du mésonephros du poisson-zèbre est décrite. Plusieurs étapes sont optimisées pour augmenter la visualisation des mésonéphros et la pénétration et le lavage de la sonde et de l’anticorps. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée avec une sonde pour l’EGFP pour marquer les cellules progénitrices uniques, les agrégats néphrogéniques et les tubules distaux des néphrons naissants. Cette méthode fournira une compréhension plus approfondie du développement des mésonéphros et un aperçu des thérapies régénératives.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-fluorescéine</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> de blanchiment <td>0,8 % KOH, 0,9 % H2O2 dans PBST</td></tr><tr><td>Réactif bloquant</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Utiliser pour la solution bloquante, préparer selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Passoire</td> cellulaire <td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; 22-363-549</td><td>100 &mu ; m</td></tr><tr><td>E3 moyen</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001 % bleu de méthylène</td></tr><tr><td>Manipulateur de cils</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1083208</td><td>Utilisation pour manipuler les larves</td></tr><tr><td>Solution de fixation</td><td></td><td></td><td>4 % de paraformaldéhyde, 1 % de DMSO dans PBS ; chaleur à 65&deg ; C tout en agitant jusqu’à ce que la poudre se dissolve, puis ajoutez du DMSO après refroidissement</td></tr><tr><td>Synthèse de sonde de fluorescéine Roche</td><td>/Sigma-Aldrich</td><td>11685619910</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr><tr><td>Encapsulation Hatchfry</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyb- solution</td><td></td><td></td><td>50 % formamide, 5X SSC, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>Hyb+ solution</td><td></td><td></td><td>HYB-, 5 mg/mL d’ARN de torula, 50 ug/mL d’héparine</td></tr><tr><td>MAB (10X)</td><td></td><td></td><td>1 M d’acide maléique, 1,5 M de NaCl, pH de 7,5</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>1X MAB, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td></td><td></td><td>8 % NaCl, 0,2 % KCl, 1,44 % Na2HPO4, 0,24 % KH2PO4</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>PBST2</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,2 % Tween-20</td></tr><tr><td>Nourriture en</td><td></td><td></td> poudre <td>Mélanger 2 g de chacun de spiruline et d’alevinage encapsuler dans 50 mL d’eau du système de poisson et bien agiter</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5568</td> Utiliser <td>pour perméabiliser les larves</td></tr><tr><td>Protéinase K solution</td><td></td><td></td><td>20&nbsp ; &mu ; g/mL, concentration finale de 1 % de DMSO dans la</td></tr><tr><td>poudre microfine de spiruline</td> PBST <td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 0,3 M acétate de sodium anhydre, pH 7, autoclave</td></tr><tr><td>SSCT (0,2X)</td><td></td><td></td><td>Dilué à partir de 20X SSC, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (2X)</td><td></td><td></td><td>Dilué à partir de 20X SSC, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> <td>de coloration100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>Solution de</td><td></td><td></td> coloration <td>200 &mu ; g/mL de chlorure d’iodonitrotétrazolium, 200 &mu ; g/mL de phosphate disodique de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle, dans un tampon de coloration</td></tr><tr><td>Solution d’arrêt</td><td></td><td></td><td>1 mM EDTA, pH 5,5, dans</td></tr><tr><td>l’ARN PBST Torula (levure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>2 %, pH 7</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> de lavage <td>50 % formamide, 2X SSC, 0,1 % Tween-20</td></tr></tbody></table>

in situ hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de mesonephros

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Le poisson-zèbre forme deux structures rénales au cours de sa vie. Le pronephros (rein embryonnaire) se forme au cours du développement embryonnaire et commence à fonctionner 2 jours après la fécondation. Composé de seulement deux néphrons, le pronephros sert de seul rein pendant la vie larvaire jusqu’à ce que plus de fonction rénale soit nécessaire en raison de l’augmentation de la masse corporelle. Pour faire face à cette demande plus élevée, le mésonéphros (rein adulte) commence à se former pendant la métamorphose. Les nouveaux néphrons primaires fusionnent avec les pronéphros et forment des lumens connectés. Ensuite, les néphrons secondaires fusionnent avec les néphrons primaires (et ainsi de suite) pour créer un réseau de branchement dans les mésonéphros. La grande majorité de la recherche est axée sur les pronéphros en raison de la facilité d’utilisation des embryons. Ainsi, il est nécessaire de développer des techniques pour étudier les larves et les poissons juvéniles plus âgés et plus gros afin de mieux comprendre le développement des mésonéphros. Ici, un protocole d’hybridation in situ pour l’analyse de l’expression génique est optimisé pour la pénétration de la sonde, le lavage des sondes et des anticorps, et le blanchiment des pigments pour mieux visualiser le mésonéphros. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée pour marquer les cellules progénitrices et les tubules distaux des néphrons naissants. Ce protocole comble une lacune dans la recherche sur les mésonéphros. Il s’agit d’un modèle crucial pour comprendre comment les nouveaux tissus rénaux se forment et s’intègrent aux néphrons existants et fournir des informations sur les thérapies régénératives.

En utilisant la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), il a été démontré que ce protocole d’hybridation in situ est efficace pour marquer les cellules progénitrices rénales et diverses structures néphroniques au cours du développement du mésonéphros. Comme prévu, le système nerveux central est également étiqueté dans cette lignée transgénique (non montré). Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 mm, dorsal au pronéphros (figure 2A), et le tubule distal de ce né...

Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.

In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Ce protocole est important car il permet de déterminer l’expression génique chez les larves et les juvéniles de poissons zèbres plus âgés lors de la métamorphose. L’avantage de cette technique est que plusieurs étapes ont été optimisées pour la pénétration de la sonde et la visualisation du rein. Pour commencer, mettez en place des poissons-zèbres adultes pour qu’ils s’accouplent en ajoutant un poisson mâle et un poisson femelle dans un aquarium d’accouplement en fin d’après-midi après leur dernier repas.Le lendemain, recueillir les embryons dans des plaques de Petri contenant du milieu E3. Cinq jours après la fertilisation, placez un écran de 400 micromètres dans un réservoir de 2,8 litres et remplissez-le de 2 centimètres d’eau système. Ajoutez ensuite la larve d’une plaque de Pétri.Pour fixer la larve, retirez un réservoir de larve au moment souhaité, puis, à l’aide d’un filet et d’une pipette de transfert avec son extrémité coupée, transférez la larve sur la plaque de Pétri. Ensuite, ajoutez deux millilitres de 2% de tricaïne pour immobiliser la larve. Après immobilisation, remplacer la tricaïne par 20 millilitres de solution de fixation.Après 30 minutes, transférer la larve dans un tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de solution fixatrice fraîche. Ensuite, en vous assurant que le bouchon est serré, secouez lentement le tube à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Le troisième jour, remplacez la solution de fixation par 20 millilitres de PBST, puis transférez la larve dans une plaque de Pétri.Pour mesurer la larve, placez la plaque de Petri au-dessus d’une règle plate sous un microscope à dissection, puis, à l’aide d’un manipulateur de cils, déplacez chaque larve sur la règle pour mesurer sa longueur totale. Après avoir mesuré toutes les larves, combinez plusieurs larves de longueurs similaires sur un flacon en verre de 5,5 millilitres avec du PBST. Pour la déshydratation, remplacez le PBST dans le flacon en verre par quatre millilitres de 100% de méthanol, puis conservez le flacon à moins 20 degrés Celsius pendant deux jours.Pour la réhydratation, remplacez le 100 % de méthanol par quatre millilitres d’une solution à 75 % de méthanol et à 25 % de PBST et faites basculer le flacon pendant cinq minutes. Ensuite, remplacez la solution de méthanol et de PBST par quatre millilitres de PBST frais et faites basculer à nouveau le flacon pendant 10 minutes. Pour la digestion de la protéinase K, remplacez le PBST par deux millilitres d’une solution de protéinase K et faites basculer le flacon à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, pour le blanchiment, transférer la larve dans une plaque de six puits et remplacer le PBST par trois millilitres de solution de blanchiment fraîche. Après la disparition complète de la pigmentation le long du mésonéphros, transférez la larve dans un flacon en verre, remplacez la solution de blanchiment par quatre millilitres de PBST et bercez le flacon pendant 10 minutes. Pour la pré-hybridation, remplacez la solution de fixation par quatre millilitres de PBST et faites basculer le flacon pendant 10 minutes, puis remplacez le PBST par quatre millilitres de solution Hyb et de roche pendant 10 minutes.Après deux incubations supplémentaires dans la solution Hyb, remplacez la solution par quatre millilitres de la solution Hyb+. Diluer simultanément la sonde de fluorescéine EGFP de un à 100 dans 500 microlitres de solution d’hybridation plus, et incuber le flacon et la sonde à 70 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, pour hybrider la sonde, remplacer la solution Hyb+ dans le flacon par la sonde préchauffée et incuber à 70 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, ajoutez 50 millilitres de SSCT préchauffé 0,2 fois dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, insérez une passoire cellulaire de 100 micromètres dans le haut du tube, transférez la larve du flacon en verre dans la passoire cellulaire et, en veillant à ce que les larves soient immergées dans le tampon, incubez le flacon à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, transférer la passoire cellulaire dans un nouveau tube contenant 0,2 fois SSCT préchauffé et incuber à nouveau à 70 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, pour le blocage, transférez la larve dans un nouveau flacon en verre et laissez-la refroidir à la température ambiante. Ensuite, remplacez la solution SSCT 0,2 fois par quatre millilitres d’une solution SSCT 67% 0,2 fois et 33% MABT et bercez le flacon à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, remplacez la solution SSCTT MABT par quatre millilitres de MABT frais et incubez le flacon sur un culbuteur pendant 10 minutes.Ensuite, remplacez le MABT par quatre millilitres de solution bloquante et incubez quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez la solution bloquante par une solution d’anticorps et incubez à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Pour le lavage des anticorps, transférez la larve dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez 40 millilitres de PBST2 et posez le tube posé sur le côté pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius.Le jour 12, après avoir transféré la lave dans une plaque de six puits, remplacez le PBST2 par trois millilitres de tampon de coloration. Après une incubation de cinq minutes sur une bascule, remplacez le tampon de coloration par trois millilitres de la solution de coloration. Lorsque l’intensité de coloration souhaitée est atteinte, remplacez la solution de coloration par trois millilitres de la solution d’arrêt et de la roche pendant 30 minutes.Ensuite, transférez la larve dans un nouveau flacon en verre, remplacez la solution d’arrêt par quatre millilitres de solution de fixation fraîche et incubez pendant une heure à température ambiante. Pour l’imagerie, remplacez la solution de fixation par quatre millilitres de PBST frais. Après une incubation de 10 minutes sur une bascule, transférez la larve dans une plaque de six puits, puis remplacez le PBST par quatre millilitres de PBST frais et secouez à nouveau la plaque pendant 10 minutes.Ensuite, ajoutez trois millilitres de glycérol à 50% dans le PBST et la roche pendant 10 minutes, puis, à l’aide d’un microscope à dissection, imagez la larve directement dans la plaque à six puits. Ce protocole d’hybridation in situ marque efficacement les cellules progénitrices rénales et diverses structures de néphrons en utilisant le développement de mésonéphros. Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 millimètres dorsal au pronephros.Des grappes de cellules progénitrices sont présentes pendant le développement du mésonéphros en plus des cellules progénitrices uniques. Chez les juvéniles plus grands, une coloration de fond peut se produire dans les somites. Dans l’ensemble, cette méthode peut être utilisée pour étudier d’autres tissus qui se forment pendant la métamorphose, en plus des organes adultes disséqués.

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