DUCT: Double coulée de résine suivie d’une micro-tomodensitométrie pour l’analyse 3D du foie

Cette méthode nous permet d’analyser, de visualiser et de quantifier l’architecture des systèmes vasculaires et biliaires du foie en 3D. Nous pouvons maintenant mieux comprendre les aspects spatiaux de la maladie du foie et de la régénération. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne repose pas sur l’existence d’anticorps ou d’imagerie par fluorescence.

Il permet également de visualiser directement quels réseaux sont correctement éclairés. Cette méthode convient à l’analyse des systèmes tubulaires, c’est pourquoi la recherche des vaisseaux sanguins, des voies biliaires et des voies respiratoires sont des zones idéales. Nous avons utilisé DUCT pour comprendre les changements structurels liés à la régénération biliaire.

Avant d’injecter de la résine dans le système biliaire de la souris, commencez à déplacer l’intestin et le pancréas vers le côté gauche de la souris, en utilisant un coton-tige mouillé avec du PBS pour exposer le canal biliaire commun et la veine porte. Ensuite, faites une petite incision transversale dans la veine cave inférieure. Retournez la face ventrale du foie vers le cœur pour exposer la surface viscérale et la région hilaire, et localisez le canal biliaire commun qui va de la région hilaire à travers le pancréas et dans l’intestin au niveau du sphincter d’Oddi.

Utilisez la pince droite pour dégager la zone tissulaire environnante d’environ cinq millimètres du canal biliaire commun. Ensuite, en plaçant un fil de suture en soie sous le canal biliaire commun, nouez un nœud lâche autour du canal biliaire commun. Tenez les ciseaux à ressort à plat contre le canal biliaire commun pour faire une incision oblique au canal biliaire commun à l’endroit où le canal biliaire commun pénètre dans le pancréas et l’intestin à côté du sphincter d’Oddi.

Ensuite, mélangez un millilitre de la résine jaune avec 50 microlitres de l’agent de durcissement MV et remplissez une seringue luer d’un millilitre avec le mélange d’agent de durcissement de résine. Connectez la seringue remplie avec le jeu de tubes et appuyez sur le piston pour remplir le tube jusqu’à ce que le mélange d’agent de durcissement de la résine s’écoule de l’extrémité du tube. Utilisez la pince pour redresser la zone autour de l’incision commune des voies biliaires.

Avant d’insérer le tube dans l’ouverture du canal biliaire commun avec le bord le plus long de la pointe biseautée vers le bas vers la face dorsale du canal biliaire. Ensuite, serrez le nœud du fil de soie pour fixer le tube à l’intérieur du canal biliaire commun. Après avoir injecté la résine dans le canal biliaire commun, observez la vésicule biliaire et les lobes hépatiques individuels.

Massez le foie avec un coton-tige mouillé par PBS pour aider à répartir la résine de manière égale. Les branches terminales des voies biliaires remplies de résine seront faiblement visibles à la surface du foie. Arrêtez d’injecter la résine lorsque des points de résine apparaissent à la surface du foie ou lorsque la résistance est rencontrée.

Ensuite, retirez le tube en tirant hors du canal biliaire commun et serrez rapidement le nœud de soie à l’aide d’une pince pour empêcher la résine de s’échapper. Coupez les extrémités lâches de la suture de soie, de sorte qu’elles n’interfèrent pas avec l’injection de la veine porte. Avant d’injecter la résine dans la veine porte, dégagez la veine porte de son tissu environnant à environ deux centimètres de son entrée dans le foie, à l’aide d’une pince droite.

Placez ensuite le fil de suture en soie sous la zone dégagée de la veine porte pour nouer un nœud lâche à la main. Dans la veine porte distale au foie, faites une incision longitudinale avant de nouer le nœud. Ensuite, préparez le mélange d’agent de durcissement de résine verte dans la seringue et remplissez le tube avec le mélange comme démontré précédemment.

Utilisez la pince pour redresser la veine porte en tirant le tissu environnant vers le côté de la queue avant d’insérer le tube avec le bord le plus long de la pointe biseautée vers la face dorsale du vaisseau. Serrez le fil de soie pour fixer le tube dans la veine porte. Après avoir injecté la résine dans la veine porte, observez les vaisseaux sanguins se remplir de résine et massez le foie avec un coton-tige mouillé par PBS pour aider à répandre la résine.

Lorsque tous les vaisseaux sanguins sont remplis, retirez le tube de la veine porte et resserrez rapidement le nœud de soie à l’aide d’une pince pour empêcher la résine de s’échapper. Pour la micro-tomodensitométrie ou la scintigraphie MicroCT du foie disséqué de la souris, placez le lobe hépatique médian droit dans un tube conique de 15 millilitres et remplissez le tube avec du gel d’agarose à 1% à environ deux tiers du volume total du tube pour minimiser le mouvement indésirable de l’échantillon pendant la mesure MicroCT. Montez le tube conique de 15 millilitres avec l’échantillon sur l’étage de rotation d’un appareil de tomodensitométrie.

Laissez le tube s’adapter thermiquement à la chambre de mesure pendant au moins une heure. Lorsque l’échantillon est adapté thermiquement, centrez-le dans le champ de vision ou FOV, puis optimisez les distances de l’échantillon source et du détecteur d’échantillon, ou SSD et SDD pour atteindre une résolution voxel suffisante. Une fois les paramètres définis, démarrez une mesure CT.

Utilisez un logiciel de reconstruction tomographique dédié pour reconstruire les données CT. Pour analyser les données CT, chargez les fichiers en sélectionnant fichier, importer et commander. Utilisez la fonction de détermination de surface sur le panneau supérieur pour segmenter la résine dans les données à l’aide du seuil global.

Dans la fenêtre de dialogue, déterminez la valeur seuil avec l’évaluation de l’histogramme en définissant la position de la ligne d’isovaleur rouge pour segmenter uniquement les récipients remplis de résine. Dans le panneau de gauche, sélectionnez le module Créer un retour sur investissement à partir du volume, de la CAO ou du maillage pour créer une région d’intérêt ou un retour sur investissement des récipients remplis de résine. Dans la fenêtre de dialogue, utilisez l’option Créer des retours sur investissement à partir de solid pour sélectionner et confirmer le nom du volume traité.

Éliminez la segmentation erronée des grappes de bruit dans la région d’arrière-plan de ce retour sur investissement. Marquez le retour sur investissement sur le panneau de droite en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant le retour sur investissement fractionné du module. Dans la fenêtre de dialogue, définissez le paramètre voxel de volume minimum pour exclure toutes les particules de bruit.

La valeur du paramètre dépend de l’expérience et des données, et est optimisée pour chaque échantillon à analyser. Sur le panneau de gauche, utilisez le module de lissage pour créer des masques de canal lisses, continus et solides sans artefacts, comme la présence de bulles d’air ou de fuites de résine dans le retour sur investissement du coût de la résine. Créez un retour sur investissement distinct comme décrit précédemment pour le système rempli de la résine la plus absorbante comme la résine jaune utilisée pour l’injection courante des voies biliaires avec des valeurs d’intensité plus élevées dans les données CT.

Marquez et masquez la résine du nouveau retour sur investissement en cliquant avec le bouton droit de la souris avant de sélectionner les rois de soustraction, puis en soustrayant le nouveau retour sur investissement du masque de résine pour créer un nouveau retour sur investissement pour le système tubulaire restant. Exportez les retours sur investissement résultants pour les deux systèmes tubulaires dans différents formats en fonction des références de l’opérateur pour un traitement ultérieur dans différents logiciels. Traitez ensuite les retours sur investissement résultants dans un logiciel graphique de volume pour exporter la visualisation finale sous la forme d’une image ou d’une vidéo.

Dans cette étude, une double injection de résine réussie a été obtenue avec des voies biliaires intrahépatiques bien remplies et une vascularisation veineuse porte. L’analyse représentative illustre le résultat des données segmentées d’un foie bien injecté pour une souris P15 et une souris adulte où la résine est visible dans les branches latérales. Dans l’exemple typique d’une injection infructueuse, des dommages physiques au foie pendant l’intervention chirurgicale ont entraîné une fuite de résine.

De plus, le durcissement prématuré de la résine dans l’aiguille ou la pointe du tube avant l’injection et la perfusion transcardique insuffisante ont provoqué un sous-remplissage du système. La fuite mineure de résine pourrait être corrigée manuellement lors de la segmentation des données MicroCT. Une pression d’injection élevée pourrait rompre les récipients ou les conduits et endommager de manière irréversible le récipient ou l’architecture des conduits.

De plus, les bulles étaient un autre artefact d’injection très commun qui a conduit au remplissage clairsemé des réseaux tubulaires. Lorsque de la résine fraîchement ouverte a été utilisée, une nette différence dans le contraste entre les voies biliaires injectées de résine jaune et les veines portes injectées de résine verte a été observée. Après trois mois de stockage, le contraste était suffisant pour distinguer la veine porte du canal biliaire.

Cependant, les précipitations ont affecté le mélange des deux résines, ce qui était visible sous la forme d’une opacité hétérogène dans la veine porte remplie. Lorsque la résine avait plus de six mois, le contraste se dégradait à un point tel qu’il était impossible de distinguer le canal biliaire injecté en jaune de la veine porte injectée en vert, en fonction de leur seul contraste. Il est crucial de faire une incision oblique dans le canal biliaire commun.

Sinon, il sera très difficile d’insérer le tube. La technique DUCT éclaire de nouveaux mécanismes architecturaux de régénération biliaire dans un modèle cliniquement pertinent avec des caractéristiques distinctes dans les régions du lobe hilaire et périphérique.