Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines

La zone est considérée comme intéressant pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation que cette culture a formé. Nous avons décrit notre stratégie d’encapsulation qui conduit à la formation reproductible de sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines. Une fois encapsulés, ces sphéroïdes de cellules souches se prêtent à la culture, soit dans des plaques multi-puits, soit dans des bioréacteurs agités.

Notre stratégie d’encapsulation consiste à optimiser la capacité de survie à la peste et la haute efficacité de la formation de sphéroïdes. Les sphéroïdes encapsulés sont protégés contre le cisaillement ou l’énergie mécanique associée à l’agitation ou au balancement. Le développement de cellules souches dérivées de la thérapie cellulaire dépend en partie de la capacité à générer le produit cellulaire souhaité de manière évolutive, efficace et rentable.

La technologie d’encapsulation décrite ici représente un pas dans cette direction. La technologie d’encapsulation décrite ici sera probablement applicable à la culture 3D de divers types de cellules, d’autres cellules à d’autres cellules souches pluripotentes. Commencez par préparer 30 millilitres de solution mère de deux fois le noyau en mélangeant 4,8 grammes de PEG de 35 kilodaltons, 10,2 millilitres de milieux à gradient de densité et 19,8 millilitres de milieux DMEM/F-12.

Ensuite, filtrez cette solution de base à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Ensuite, préparez 50 millilitres d’huile minérale avec 3% de tensioactif en mélangeant 48,5 millilitres d’huile minérale et 1,5 millilitre de tensioactif. Ensuite, stérilisez la solution en la faisant passer à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre.

Ensuite, préparez 1 TNT molaire, 1 solution molaire de TEA et 1% de PF127, comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, préparez une émulsion de réticulation en mélangeant 4,5 millilitres d’huile minérale avec 3% de tensioactif et 300 microlitres de 1 molaire DTT. Après avoir vortexé la solution pendant deux minutes, soniquer pendant 45 à 60 minutes dans un bain à ultrasons à 20 degrés Celsius et charger dans une seringue de 5 millilitres avec une aiguille de calibre 27.

Ensuite, préparez une solution d’huile de protection en chargeant l’huile minérale avec 0,5% de tensioactif dans une seringue de 5 millilitres avec une aiguille de calibre 27. Pour préparer la solution de coquille, ajouter 32 milligrammes de maléimide PEG4 dans 400 microlitres de DPBS. Ensuite, ajoutez 6 microlitres de 1 molaire TEA.

Vortex la solution pendant 2 minutes et centrifugez-la à travers un filtre à rotation. Conservez la solution dans l’obscurité sur la bascule pendant 30 minutes avant de la charger dans une seringue de 1 millilitre avec une aiguille de calibre 27. Enfin, préparez la solution de base finale en re-suspendant 20 millions de hPSC dans 200 microlitres et mélangez avec 30 microlitres de 1% PF127 et 200 microlitres de solution de noyau 2X.

Insérez une petite barre d’agitation dans une seringue de 1 millilitre. Ensuite, chargez la solution de noyau contenant la cellule dans la seringue avec une aiguille de calibre 27. Commencez par placer le dispositif de gouttelettes PDMS collé, 4 pièces de 20 centimètres de long et 1 pièce de microtubes d’entrée de 5 centimètres de long, 1 pièce de tube de sortie de 10 centimètres et 6 pièces de tubes d’ajustement de 0,5 centimètre sous la source de lumière germicide pendant 30 minutes pour la stérilisation.

Maintenant, insérez les 4 pièces de microtubes d’entrée de 20 centimètres de long dans la coque, l’huile, l’émulsion de réticulation et les entrées de dispositif de dissociation à l’aide de pinces. Ensuite, insérez l’extrémité opposée des tubes dans l’aiguille de la seringue avec la solution correspondante. Pendant ce temps, connectez l’entrée du noyau des dispositifs microfluidiques et la sortie des dispositifs de dissociation avec un microtube de 5 centimètres.

Insérez 1 tube de sortie dans l’orifice de sortie fluidique et placez l’extrémité opposée dans un réservoir de collecte. Ensuite, placez l’appareil sur une scène de microscope et fixez le tube pour éviter tout mouvement. Alignez et concentrez le microscope sur la buse de l’appareil pour l’inspection du débit.

Placez chaque seringue sur différentes pompes à seringue et fixez-la correctement. Programmez chaque pompe selon les protocoles du fabricant aux débits mentionnés dans le manuscrit textuel, et démarrez le débit dans toutes les pompes. Attendez que chaque fluide pénètre dans l’appareil et remplissez les canaux tout en poussant l’air restant.

Lorsque la formation de la capsule est stabilisée, placez l’extrémité opposée du tube de collecte dans un nouveau tube conique contenant 5 millilitres de milieu mTeSR. Une fois que suffisamment de capsules sont collectées, incuubez-les pendant 10 minutes. Les capsules résidant dans la phase huileuse seront en haut du tube, qui sédimente vers le bas en tapotant doucement le tube.

Pour récupérer les capsules, commencez par retirer l’huile du tube de collecte. Ensuite, placez les capsules sur une passoire cellulaire de 100 micromètres de la taille d’un pore et lavez la passoire avec de grandes quantités de support. Inverser le filtre sur le dessus d’un puits d’une plaque de culture à 6 puits et recueillir les microcapsules en faisant passer 2 millilitres de média à travers le filtre.

Incuber les capsules de cellules souches dans un plat de culture à 6 puits à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Changez le média tous les deux jours en collectant les capsules sur un filtre à tamis cellulaire, en les lavant avec un excès de média et en les remettant en suspension dans un nouveau puits dans des plaques à 6 puits avec un support de 2 millilitres. Effectuer un test de viabilité en ajoutant 4 microlitres de 2 micromolaires d’Ethidium Homodimer-1 et 1 microlitre des 4 solutions micromolaires de Calcein-AM à 2 millilitres de DPBS stérile.

Vortex pour assurer un mélange complet. Recueillir environ 100 microcapsules sur une passoire cellulaire et les rincer avec du DPBS stérile pour permettre la diffusion du milieu hors des capsules. Les recueillir à nouveau dans une plaque de culture à 12 puits en utilisant 1 millilitre de la solution préparée contenant De l’homodimère d’éthidium 1 et de la calcéine AM et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Visualisez les cellules sous un microscope à fluorescence. Les microcapsules optimales et sous-optimales fabriquées à l’aide de la génération de gouttelettes microfluidiques ont montré des différences dans la morphologie de la capsule en fonction de la teneur en PEG4-Maléimide dans la coquille. Les capsules lisses aux bords brillants sont associées à l’intégrité mécanique souhaitée.

L’agrégation des perles au centre des capsules indique que le noyau était aqueux et que les perles étaient libres de se déplacer. L’anneau fluorescent indiquait la présence d’une coquille d’hydrogel et était utilisé pour déterminer l’épaisseur de la coque. Des colorations vivantes ou mortes 6 heures après l’encapsulation des cellules H9 ont montré que les cellules atteignaient régulièrement plus de 95% de viabilité pendant les cycles d’encapsulation.

En comparant le taux de croissance et le potentiel de différenciation des sphéroïdes encapsulés par rapport aux sphéroïdes non encapsulés. Il a été déterminé que le processus d’encapsulation n’a pas d’effets néfastes sur les CSEh. N’oubliez pas qu’il est important d’établir un rapport de débit optimal entre la coque du noyau et les flux de pétrole.

Ne pas le faire peut entraîner des capsules qui ne seront pas mécaniquement solides et peuvent se rompre pendant la manipulation. Nous tenons à souligner que cette technique d’encapsulation était destinée à des types de cellules autres que les cellules souches pluripotentes humaines. Nous avons encapsulé, principalement hypothétisé, des lignées cellulaires cancéreuses et des cellules souches mésenchymateuses à l’aide d’une stratégie similaire.

Actuellement, notre équipe développe la prochaine génération de microcaptures. Ces microcaptures sont bioactives et peuvent être chargées de facteurs croisés pour la différenciation encapsulée des cellules souches.