Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Un test de lecture de plaque robuste comme le nôtre est très utile pour le dépistage initial des inhibiteurs potentiels de la méthyltransférase. La possibilité de collecter des données en temps réel est un grand avantage du test continu couplé à l’endonucléase. Commencez par préparer 600 microlitres des conditions d’essai contenant 20 composés micromolaires et 50 composés micromolaires séparément dans les tubes de microcentrifugation sur glace.

Pour ce faire, ajoutez de l’eau distillée double et un tampon de méthylation 5X à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 1X tampon de méthylation. Ensuite, ajoutez 3,15 microlitres de 20 milligrammes par millilitre d’albumine sérique bovine, ou BSA, à chaque échantillon. Ensuite, ajoutez deux microlitres de substrat d’ADN en épingle à cheveux de 3,15 micromolaires et 1,33 microlitres de S-adénosylméthionine 4,75 micromolaires, ou SAM, à chaque échantillon.

Ajouter l’inhibiteur aux échantillons appropriés pour obtenir une concentration finale de 21 micromolaires ou 52,5 micromolaires et une quantité équivalente de diméthylsulfoxyde, ou DMSO, dans un échantillon témoin avant de mélanger les solutions en tourbillonnant à 3 000 rotations par minute pendant trois secondes. Ensuite, faites tourner les échantillons pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table à 1, 200 fois G pour vous assurer que la solution est recueillie au fond du tube. Aliquote 95 microlitres de chaque solution d’essai dans six puits consécutifs dans une plaque noire de 96 puits.

Préparer 75 microlitres de solution enzymatique Gla I ou DNMT1 plus Gla I dans les tubes de microcentrifugation comme décrit précédemment jusqu’à une concentration finale de tampon unique. Ensuite, ajoutez 1,2 microlitre de 10 unités par microlitre Gla I à chaque solution pour obtenir une concentration finale de 0,16 unité par microlitre. Ajouter 0,6 microlitre de DNMT1 sans RFTS micromolaires à la solution DNMT1 plus Gla I pour une concentration finale de 40 nanomolaires.

Après un mélange doux, faire tourner les échantillons pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table à 1, 200 G pour s’assurer que la solution est recueillie au fond du tube. Ensuite, aliquote 12 microlitres de chaque solution enzymatique dans six puits dans une plaque conique de 96 puits. Pour le test de méthylation de l’échantillon d’ADN, préchauffer le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius.

Ensuite, insérez la plaque noire contenant les solutions de dosage dans le lecteur de plaques. Après avoir secoué la plaque à 425 CPM, mesurer la fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 528 nanomètres. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Retirez la plaque de dosage du lecteur de plaques et ajoutez cinq microlitres de la solution enzymatique à chaque puits, puis mélangez la solution en pipetant de haut en bas. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques et secouez la plaque avant d’enregistrer la fluorescence toutes les 53 secondes pendant 30 minutes. Obtenir la fluorescence moyenne des essais de contrôle Gla I triplicate pour chaque condition et soustraire la moyenne des plateaux de réaction de contrôle contenant Gla I des traces triplicates obtenues en présence de DNMT1 dépourvu de RFTS.

Ensuite, déterminez la moyenne et l’erreur-type de la moyenne pour les répétitions corrigées. Tracez la trace de réaction corrigée moyenne et ajustez la partie linéaire initiale à une ligne pour déterminer la vitesse initiale. Déterminer le pourcentage d’activité en divisant la vitesse observée en présence d’un composé par la vitesse observée dans le DMSO contenant la réaction de contrôle et en multipliant par 100.

Les résultats d’un essai discontinu couplé à l’endonucléase ont montré que l’ADN du produit entièrement méthylé est protégé du clivage, confirmant que le DNMT1 dépourvu de RFTS est actif et capable de méthyler l’ADN du substrat hémiméthylé. Dans le test basé sur la fluorescence, en l’absence de Gla I, l’ajout de DNMT1 ou de tampon seul n’a pas affecté la fluorescence de fond. L’ajout ultérieur de Gla I à tous les essais a entraîné la génération de fluorescence uniquement dans les essais contenant DNMT1.

L’ajout simultané de DNMT1 et de Gla I dépourvus de RFTS à trois essais a permis une génération de fluorescence robuste. L’ajout de Gla I seul n’a produit aucune fluorescence. Pour dépister les inhibiteurs potentiels, l’activité de méthylation de l’ADN du DNMT1 dépourvu de RFTS a été examinée en présence de DMSO, composé un, composé deux ou composé trois à des concentrations micromolaires de 20 et 50.

Les composés qui réduisent la génération de fluorescence dans ce test couplé doivent être validés davantage. S’assurer que les composés n’inhibent pas l’enzyme de couplage est une prochaine étape importante.