Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

L’affichage des phages nous aide non seulement à étudier les caractéristiques de liaison des enzymes cliniquement importantes, mais aussi à développer des modulateurs pour ces enzymes et les maladies correspondantes. L’affichage des phages peut être utilisé pour développer de nouveaux liants pour un large éventail de protéines cibles et est également plus facile à réaliser que d’autres méthodes d’affichage conventionnelles. Cette procédure impliquait beaucoup d’actions répétitives, la clé est donc de ne pas piloter automatiquement et de rester concentré tout au long.

Commencez par inoculer 30 millilitres de bouillon de tétracycline 2YT avec 200 microlitres de la culture de graines. Incubez-le pendant environ trois heures à 37 degrés Celsius avec des secousses orbitales de 200 tr / min jusqu’à ce que les bactéries soient dans la phase médiane logarithmique. Jetez la solution de revêtement de la plaque dans un évier.

Séchez-le doucement avec des serviettes en papier. Ajoutez ensuite 200 microlitres de tampon PB à chaque puits revêtu. Jetez le tampon PB de la plaque et séchez-le sur des serviettes en papier.

Ajoutez 200 microlitres supplémentaires de tampon PB à chaque puits revêtu de la plaque. Incuubez-le à température ambiante pendant une heure avec une secousse orbitale de 300 tr / min. Décongelez la bibliothèque de phages sur de la glace, puis diluez-la à 100 fois la diversité de la bibliothèque dans PBS.

Ajouter la solution de chlorure de sodium de polyéthylène glycol à un cinquième du volume dilué de la bibliothèque et incuber la solution sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez la solution à 11 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et centrifugez-le pendant encore deux minutes pour tirer le surnageant restant et concentrer la pastille de phage.

Remettez doucement en suspension la pastille de phage dans un millilitre de tampon PBT par protéine cible à analyser, généralement quatre au total. Ajoutez 100 microlitres de bibliothèque de phages à chaque puits enduit dans la plaque de contrôle. Incuubez-le à température ambiante pendant une heure avec une secousse orbitale de 300 tr / min.

Jetez le tampon PB de la plaque cible dans l’évier et séchez la plaque sur des serviettes en papier. Transférez les 100 microlitres de la bibliothèque de phages de la plaque de commande vers chaque puits revêtu de la plaque cible. Incuubez-le à température ambiante pendant une heure avec une secousse orbitale de 300 tr / min.

Ensuite, retirez la bibliothèque de phages de la plaque et lavez les puits enduits quatre fois avec un tampon PT. Inversez la plaque et tapotez sur une serviette en papier pour retirer les dernières gouttes de tampon. Ajouter 100 microlitres d’acide chlorhydrique 0,1 molaire à chaque puits enrobé pour éluer le phage.

Incuber la plaque à température ambiante pendant cinq minutes avec une secousse orbitale de 300 tr / min. Après cela, neutralisez le pH en ajoutant 12,5 microlitres de pH 11 un chlorhydrate de tris molaire à chaque puits enduit. Transférer le phage élué des huit puits dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Pipette de haut en bas pendant le transfert pour rendre les solutions homogènes et aspirer tout le liquide des puits. Ajouter 10%BSA au phage élué pour obtenir la concentration finale 1%Stocker le tube de microcentrifugation à quatre degrés Celsius. Il s’agit de la sortie du premier tour.

Préparer une culture de semences pour la culture de l’apport de phages pour la prochaine ronde de sélection en inoculant cinq millilitres de culture de graines de tétracycline 2YT avec une colonie isolée d’E. coli à partir d’une plaque d’agar. Incubez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une secousse orbitale de 200 tr / min. Diluer la protéine cible dans les tubes ronds deux et trois avec une quantité appropriée de PBS.

Prenez la moitié du contenu des tubes des tours deux et trois et recouvrez quatre puits par protéine cible dans une plaque de liaison de 96 puits pour le tour suivant. Ensuite, utilisez la moitié de la sortie de la première ronde pour inoculer trois millilitres de cellules de phase mi-logarithmique. Incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec une secousse orbitale de 200 tr / min.

Ajouter le phage auxiliaire M13KO7 à une concentration finale de 10 milliards de PFU par millilitre. Incubez-le à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une heure avec une secousse orbitale de 200 tr / min. Après une heure, transférer les trois millilitres entiers de culture à 30 millilitres de solution de carbenicilline kanamycine 2YT.

Croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses orbitales de 200 tr / min. Les résultats représentatifs pour une sélection de variante de l’ubiquitine par rapport à UBE4B sont présentés ici. Les UVU ont été commandés de la fréquence la plus élevée à la plus basse.

Les séquences représentent la région diversifiée de l’ubiquitine dans l’UBV avec tous les résidus randomisés. L’affinité de liaison relative des liants à la protéine cible de type sauvage, à la protéine cible mutée, ainsi qu’aux protéines hors cible est mesurée par des tests immuno-enzymatiques ou ELISA. Toutes les absorbances ELISA ont été normalisées par rapport à 96 scores ELISA BSA moyens et 96 scores ELISA GST moyens.

Le vert plus foncé représente la liaison relative la plus forte. La TPS a été incluse comme témoin de la liaison non spécifique parce que la protéine cible est marquée GST. Les résultats ELISA sont présentés graphiquement ici.

L’axe des x représente les UUB et l’axe des y représente l’absorbance normalisée correspondante. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de ne pas jeter la solution dans la plaque après avoir ajouté l’acide chlorhydrique. Les phages sont maintenant suspendus en solution et vous souhaitez les conserver afin de pouvoir effectuer des analyses finales d’enrichissement ultérieures ou les deux.

Après cette procédure, le séquençage doit être effectué pour déterminer les fréquences UBV. Les tests ELISA et IC50 peuvent être effectués pour déterminer les efficacités de liaison et les efficacités inhibitrices respectivement et aussi pour aider à déterminer quels UUV caractériser davantage.