Name: Développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez l'isolation et la mesure de la respiration mitochondriale sur le terrain grâce à un laboratoire mobile. Cette méthode réduit le stress de captivité et permet d'étudier l'énergétique animale dans son contexte écologique naturel.

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Les auteurs remercient Mark Nelms et John Tennant du département de génie électrique et informatique du Samuel Ginn College of Engineering de l’Université d’Auburn pour leur aide dans l’équipement structurel et électrique de l’AU MitoMobile. De plus, les auteurs reconnaissent le financement pour équiper l’UA MitoMobile et la recherche d’une subvention de l’Université d’Auburn pour les prix présidentiels pour la recherche interdisciplinaire (PAIR).

Les sections suivantes décrivent les méthodes de laboratoire mitochondriales. Toutes les procédures de manipulation des animaux et de prélèvement de tissus ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’Auburn (#2019-3582).
1. Description des tampons utilisés pour la collecte des données
REMARQUE : Ces tampons peuvent être préparés dans un laboratoire fixe et déplacés vers le laboratoire mobile avant l’excursion sur le terrain (sauf indication contraire ci-dessous).
<ol><li>Préparer le tampon d’isolement mitochondrial du muscle squelettique avec de l’albumine sérique bovine (BSA), comme indiqué dans le tableau 1.<ol><li>Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90 % en volume), à l’exception du BSA sans acides gras. Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.</li>
		<li>Ajustez la solution à un pH de 7,5 tout en maintenant la température à 4 °C.</li>
		<li>Ajoutez le BSA sans acides gras et augmentez le volume à 100%. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le tampon d’isolement mitochondrial du muscle squelettique sans BSA, comme indiqué dans le tableau 1.<ol><li>Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% du volume). Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.</li>
		<li>Ajustez la solution à un pH de 7,5 tout en maintenant la température à 4 °C.</li>
		<li>Augmentez le volume à 100 %. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le tampon de remise en suspension des muscles squelettiques comme indiqué dans le tableau 1.<ol><li>Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% du volume). Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.</li>
		<li>Ajustez la solution à un pH de 7,4 tout en maintenant la température à 4 °C.</li>
		<li>Augmentez le volume à 100 %. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le tampon de respiration des muscles squelettiques comme indiqué dans le tableau 2.<ol><li>Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% en volume) à l’exception du BSA sans acides gras. Chauffez le tampon jusqu’à ce que la température atteigne 37 °C.</li>
		<li>Ajustez la solution à un pH de 7,0 tout en maintenant la température à 37 °C.</li>
		<li>Ajoutez le BSA sans acides gras et augmentez le volume à 100%. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez les substrats respiratoires comme indiqué dans le tableau 2.<ol><li>S’assurer que ces substrats sont frais le jour de la collecte des données dans 100 mM de Tris-HCl, pH 7,4. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation. REMARQUE : Les valeurs fournies sont pour obtenir une solution suffisamment concentrée pour qu’un substrat suffisant soit absorbé par les mitochondries. Les concentrations finales des substrats sont de 2 mM de pyruvate, 2 mM de malate, 10 mM de glutamate et 5 mM de succinate.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Réalisation de l’isolement mitochondrial (Figure 2)
REMARQUE : L’isolement mitochondrial et les mesures de la respiration mitochondriale sont effectués dans la zone de la paillasse du laboratoire mobile, et toutes les solutions doivent être conservées à 4 °C, sauf indication contraire.
<ol><li>Garez le laboratoire mobile sur un terrain plat. Allumez le générateur et mettez le véhicule à niveau. Déployez la glissière et installez l’équipement.</li>
	<li>Décongeler les quantités désirées de tampons. REMARQUE : En règle générale, 30 mL de tampon d’isolement des muscles squelettiques et 10 mL de tampon d’isolation des muscles squelettiques sans BSA sont nécessaires par muscle.</li>
	<li>Installez et calibrez les chambres de respiration mitochondriale à la température souhaitée des expériences et à la pression barométrique actuelle selon les instructions du fabricant. Voir le tableau des matériaux pour les chambres spécifiques utilisées dans les expériences.</li>
	<li>Euthanasier l’animal par décapitation. REMARQUE : La présente étude a utilisé la décapitation pour l’euthanasie. Certains gaz, tels que le dioxyde de carbone et l’isoflurane, affectent la fonction mitochondriale18,19,20 ; Ces effets doivent être pris en compte lors du choix de la meilleure méthode d’euthanasie pour chaque étude. La méthode à appliquer pour chaque étude sera déterminée par la question scientifique posée.</li>
	<li>Exciser le muscle squelettique, couper rapidement la graisse et le tissu conjonctif, peser et placer le muscle dans un tampon d’isolement du muscle squelettique avec du BSA (au moins 1/10 p/v) (par exemple, 1 g de muscle squelettique pour 10 mL de tampon).</li>
	<li>Hachez le muscle squelettique avec des ciseaux sur de la glace.</li>
	<li>Transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 5 ml. Homogénéisez-le à l’aide d’une lame (voir le tableau des matériaux) à 50% de puissance pendant 5 s. Ajouter la protéase (5 mg/g de muscle humide) et digérer pendant 7 min, en mélangeant la solution toutes les 30 s. Terminez la réaction en ajoutant un volume égal de tampon d’isolement avec BSA.</li>
	<li>Centrifuger l’homogénat à 500 × g pendant 10 min. Transvaser le surnageant à travers une étamine à double couche à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 5 ml dans un tube à centrifuger propre de 50 ml. Centrifuger le surnageant à 3 500 × g pendant 10 min pour précipiter une pastille mitochondriale brune.</li>
	<li>Versez le surnageant restant. Ajoutez le même volume de tampon d’isolement avec BSA dans le tube de centrifugation. Remettez en suspension la pastille mitochondriale à l’aide d’un grattoir flexible (policier) en faisant glisser doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger. Centrifuger à 3 500 × g pendant 10 min.</li>
	<li>Versez le surnageant restant. Ajoutez le même volume de tampon d’isolement sans BSA dans le tube de centrifugation. Remettez la pastille mitochondriale en suspension en la faisant sortir doucement des parois du tube de centrifugation avec un policier propre. Centrifuger à 3 500 × g pendant 10 min.</li>
	<li>Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille mitochondriale dans un tampon de remise en suspension en travaillant doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger avec un policier propre. REMARQUE : Le volume du tampon de remise en suspension dépendra de la taille de la pastille de mitochondries.</li>
	<li>Transférez les mitochondries remises en suspension dans un homogénéisateur Dounce à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 mL. À l’aide de l’homogénéisateur Dounce, homogénéisez soigneusement la suspension en 4 à 5 passages.</li>
	<li>Placer la suspension mitochondriale dans un tube de microcentrifugation étiqueté de 2 mL à l’aide d’un autre embout de pipette coupé de 1 mL.</li>
</ol>3. Mesures de la respiration mitochondriale (Figure 3)
<ol><li>Substrats complexes I<ol><li>Ajouter 945 μL de tampon respiratoire dans la chambre. Assurez-vous que l’agitateur tourne et que la température tampon est maintenue à 37 °C. Lancez l’enregistrement de la collecte de données.</li>
		<li>Une fois que la concentration d’oxygène s’est stabilisée, ajoutez 20 μL de mitochondries et placez le couvercle sur la chambre. Dans le logiciel, indiquez que des mitochondries ont été ajoutées à la chambre.</li>
		<li>Ajouter 10 μL de glutamate 1 M, 10 μL de malate 200 mM et 10 μL de pyruvate 200 mM dans la chambre avec des seringues individuelles et attendre que le signal se stabilise. Dans le logiciel, indiquez que des substrats ont été ajoutés. REMARQUE : Ces substrats sont généralement utilisés pour mesurer la respiration induite par les glucides. Pour d’autres combinaisons de substrats à utiliser pour mesurer la respiration induite par les graisses, voir21.</li>
		<li>Ajouter 5 μL d’ADP à l’aide d’une seringue séparée et observer la consommation rapide d’oxygène (état 3). Dans le logiciel, indiquez qu’ADP a été ajouté. REMARQUE : Après la phosphorylation de l’ADP ajouté, le taux de consommation d’oxygène plafonnera à l’état 4.</li>
		<li>Après 4 min de collecte des données de l’état 4, terminez l’enregistrement. Enregistrez le fichier de données.</li>
	</ol></li>
	<li>Substrats complexes II<ol><li>Ajouter 963 μL de tampon respiratoire dans la chambre. Assurez-vous que l’agitateur tourne et que la température tampon est maintenue à 37 °C. Lancez l’enregistrement de la collecte de données.</li>
		<li>Une fois la concentration d’oxygène stabilisée, ajoutez 20 μL de mitochondries et placez le couvercle sur la chambre. Dans le logiciel, indiquez que des mitochondries ont été ajoutées à la solution.</li>
		<li>Ajouter 2 μL de roténone à 4 μg/μL puis 10 μL de succinate à 500 mM dans la chambre à l’aide de seringues séparées et attendre que le signal se stabilise. Dans le logiciel, indiquez que des substrats ont été ajoutés.</li>
		<li>Ajouter 5 μL d’ADP à l’aide d’une seringue séparée et observer la consommation rapide d’oxygène (état 3). Dans le logiciel, indiquez qu’ADP a été ajouté. REMARQUE : Après la phosphorylation de l’ADP ajouté, le taux de consommation d’oxygène plafonnera à l’état 4.</li>
		<li>Après 4 min de collecte des données de l’état 4, terminez l’enregistrement. Enregistrez le fichier de données.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration%2C+mitochondria%2C+and+the+yellow-rumped+warbler%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler.</a> Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).</li>
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<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+and+ATP+synthase+mediate+membrane+depolarization+and+matrix+acidification+by+isoflurane+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria.</a> European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).</li>
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<li>Calisi, R. M., Bentley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+and+field+experiments%3A+Are+they+the+same+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Lab and field experiments: Are they the same animal.</a> Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le laboratoire mobile de physiologie mitochondriale permet aux chercheurs d’isoler les mitochondries et de mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales dans les 2 heures suivant le prélèvement de tissus sur des sites de terrain éloignés. Les résultats présentés ici suggèrent que les mesures de la respiration mitochondriale effectuées dans l’UA MitoMobile sont comparables aux mesures effectuées dans un laboratoire de recherche universitaire. Plus précisément, les valeurs pour l’état 3, l’état 4 et le RCR pour ...

À ce jour, les études conçues pour mesurer l’énergie mitochondriale ont été limitées aux animaux de laboratoire ou aux animaux capturés à proximité de laboratoires de physiologie établis, ce qui a empêché les scientifiques d’effectuer des études bioénergétiques mitochondriales dans des tissus prélevés sur des animaux au cours d’activités telles que la migration, la plongée et l’hibernation 1,2,3,4,5,6 . Bien que de nombreux chercheurs aient réussi à mesurer les taux métaboliques de base et de pointe et les dépenses énergétiques quotidiennes des animaux sauvages7,8, la capacité des chercheurs à mesurer la performance des mitochondries est restée limitée (mais voir 1,4,9). Cela est dû en partie au besoin de tissus frais pour isoler les mitochondries et d’une installation de laboratoire pour effectuer les isolements dans les 2 heures environ suivant l’obtention du tissu frais. Une fois les mitochondries isolées, les mesures de la respiration mitochondriale doivent également être effectuées dans un délai de ~1 h.
Les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont généralement effectuées en mesurant la concentration d’oxygène dans un récipient scellé connecté à une électrode Clark. La théorie qui sous-tend cette méthode est fondée sur l’observation fondamentale que l’oxygène est le dernier accepteur d’électrons de la respiration mitochondriale pendant la phosphorylation oxydative. Par conséquent, lorsque la concentration d’oxygène diminue au cours d’une expérience, on suppose que la production d’adénosine triphosphate (ATP) se produit10. L’oxygène consommé est un indicateur de l’ATP produit. Les chercheurs peuvent créer des conditions expérimentales spécifiques en utilisant différents substrats et initier une respiration stimulée par l’adénosine diphosphate (ADP) (état 3) en ajoutant des quantités prédéterminées d’ADP dans la chambre. Suite à la phosphorylation de l’ADP exogène en ATP, le taux de consommation d’oxygène diminue, et l’état 4 est atteint et peut être mesuré. De plus, l’ajout d’inhibiteurs spécifiques permet d’obtenir des informations sur la respiration par fuite et la respiration non couplée10. Le rapport entre l’état 3 et l’état 4 détermine le rapport de contrôle respiratoire (RCR), qui est l’indicateur du couplage mitochondrial global10,11. Des valeurs plus faibles de RCR indiquent un dysfonctionnement mitochondrial global, tandis que des valeurs de RCR plus élevées suggèrent une plus grande étendue de couplage mitochondrial10.
Comme indiqué précédemment, le prélèvement de matériel biologique, l’isolement mitochondrial et la mesure de la fréquence respiratoire doivent être effectués dans les 2 heures suivant l’obtention du tissu. Pour accomplir cette tâche sans transporter les animaux sur de grandes distances vers des laboratoires établis, un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale a été construit pour être transporté sur le terrain où ces données peuvent être recueillies. Un véhicule récréatif Jayco Redhawk 2018 a été converti en laboratoire mobile de physiologie moléculaire et nommé MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU) (figure 1A). Un véhicule récréatif a été choisi en raison du réfrigérateur, du congélateur, du réservoir de stockage d’eau et de la plomberie intégrés, de l’électricité alimentée par des batteries de 12 volts, de la génératrice de gaz, du réservoir de propane et du système d’autonivellement. De plus, le véhicule récréatif permet de passer la nuit sur des sites éloignés pour recueillir des données. L’avant du véhicule n’a pas été modifié et sert de poste de conduite et de couchage (figure 1B). Les commodités de la chambre à coucher (lit, téléviseur et armoire) précédemment installées à l’arrière du véhicule et sur la cuisinière ont été retirées.
Des étagères en acier inoxydable sur mesure et un comptoir en quartz sur mesure soutenu par un cadre en aluminium 80/20 ont été installés à la place des commodités de la chambre et de la cuisinière (figure 1C). Les paillasses de laboratoire offrent un espace suffisant pour la collecte de données (figure 1D). La consommation d’énergie de chaque pièce d’équipement (c’est-à-dire la centrifugeuse réfrigérée, les chambres de respiration mitochondriale, les lecteurs de plaques, les ordinateurs, les homogénéisateurs, les balances, l’ultra-congélateur portatif et d’autres fournitures de laboratoire générales) a été prise en considération. Pour répondre aux exigences élevées de tension et de courant de la centrifugeuse, le système électrique a été mis à niveau pour devenir un équipement de qualité aéronautique. Un compartiment externe à l’arrière du véhicule a été converti en baie de stockage d’azote liquide, ce qui répond aux directives du ministère des Transports des États-Unis pour le stockage et le transport de l’azote liquide. Cette unité de stockage a été construite en acier inoxydable et dispose d’une ventilation appropriée pour empêcher toute fuite d’azote gazeux en expansion dans l’habitacle du véhicule.
Pour confirmer que le laboratoire mobile peut être utilisé dans des études bioénergétiques mitochondriales, les mitochondries ont été isolées et les taux de respiration mitochondriale des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris domestiques sauvages (Mus musculus) ont été mesurés. Parce que Mus musculus est un organisme modèle, les taux de respiration mitochondriale de cette espèce sont bien établis12,13,14. Bien que des études antérieures aient documenté l’isolement mitochondrial par centrifugation différentielle15,16,17, un bref aperçu des méthodes utilisées dans les méthodes mobiles de laboratoire de physiologie mitochondriale est décrit ci-dessous.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 2,0 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 50 mL</td><td>VWR</td><td>21009-681</td><td>Tube à centrifuger Nalgene Oak Ridge</td></tr><tr><td>ADP VWR</td><td></td><td>97061-104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>VWR</td><td>700009-070</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>VWR</td><td>7065-020</td><td></td></tr><tr><td>Plaque transparente à 96 puits</td><td>VWR</td><td>82050-760</td> Homogénéisateur <td>Greiner Bio-One</td></tr><tr><td>Dounce</td><td>VWR</td><td>22877-284</td><td>Corning</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>VWR</td><td>EM-4100</td><td></td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td> filtre <td>Inclus avec Hansatech OxyGraph</td></tr><tr><td>Acide gras libre BSA</td><td>VWR</td><td>89423-672</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>VWR</td><td>BDH8005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>VWR</td><td>A12919</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Seringues</td><td>VWR</td><td>60373-985</td><td>Gaslight 1700 Series Seringues</td></tr><tr><td>Hansatech OxyGraph</td><td>Hansatech Instruments Ltd</td><td></td><td>Aucun numéro de catalogue, mais peut être trouvé sous Produits --> Unités de commande d’électrodes</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>97062-350</td><td></td></tr><tr><td>Malate</td><td>VWR</td><td>97062-140</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>VWR</td><td>97061-052</td><td></td></tr><tr><td>Membrane</td><td></td><td></td><td>incluse avec Hansatech OxyGraph</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97063-152</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>80503-004</td><td></td></tr><tr><td>Policier</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td></td></tr><tr><td>Polytron</td><td>Thomas Scientific</td><td>11090044</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td>VWR</td><td>97062-366</td><td>La trypsine est couramment utilisée, mais d’autres protéases peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Acide pyruvique</td><td>VWR</td><td>97061-448</td><td></td></tr><tr><td>Dithionite de sodium</td><td>VWR</td><td>AA33381-22</td><td></td></tr><tr><td>Succinate</td><td>VWR</td><td>89230-086</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>BDH0308-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>VWR</td><td>97061-794</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl VWR</td><td></td><td>97061-258</td><td></td></tr></tbody></table>

développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain

Development of a Mobile Mitochondrial Physiology Laboratory for Measuring Mitochondrial Energetics in the Field

L’énergétique mitochondriale est un thème central de la biochimie et de la physiologie animales, les chercheurs utilisant la respiration mitochondriale comme mesure pour étudier la capacité métabolique. Pour obtenir les mesures de la respiration mitochondriale, des échantillons biologiques frais doivent être utilisés et l’ensemble de la procédure de laboratoire doit être terminée dans un délai d’environ 2 heures. De plus, plusieurs pièces d’équipement spécialisé sont nécessaires pour effectuer ces tests de laboratoire. Cela crée un défi pour la mesure de la respiration mitochondriale dans les tissus d’animaux sauvages vivant loin des laboratoires de physiologie, car les tissus vivants ne peuvent pas être conservés très longtemps après le prélèvement sur le terrain. De plus, le transport d’animaux vivants sur de longues distances induit un stress, qui peut altérer l’énergétique mitochondriale.
Ce manuscrit présente le MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU), un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale qui peut être emmené sur le terrain et utilisé sur place pour mesurer le métabolisme mitochondrial dans des tissus prélevés sur des animaux sauvages. Les caractéristiques de base du laboratoire mobile et les méthodes étape par étape pour mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont présentées. De plus, les données présentées valident le succès de l’équipement du laboratoire mobile de physiologie mitochondriale et de la réalisation de mesures de la respiration mitochondriale. La nouveauté du laboratoire mobile réside dans la possibilité de se rendre sur le terrain et d’effectuer des mesures mitochondriales sur les tissus d’animaux capturés sur place.

Le présent manuscrit a étudié la respiration mitochondriale de Mus musculus d’origine sauvage (n = 7, mâle = 5, femelle = 2 ; âge = 1,30 ± 0,2 ans) dans un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale (Figure 1). Pour mesurer la respiration mitochondriale des muscles squelettiques, l’ensemble du membre postérieur, donc les muscles aérobies et anaérobies, a été utilisé pour l’isolement mitochondrial (Figure 2). Des exemples de données brutes sur la r...

Nous avons conçu et construit un laboratoire mobile pour mesurer les taux de respiration dans les mitochondries isolées d’animaux sauvages capturés sur le terrain. Nous décrivons ici la conception et l’aménagement d’un laboratoire mitochondrial mobile et les protocoles de laboratoire associés.

Développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to ...

Le développement d’un laboratoire mitochondrial mobile permet aux physiologistes d’apporter leurs travaux sur le terrain et, par conséquent, d’évaluer une diversité fascinante de défis énergétiques que présentent les animaux. La captivité est stressante pour de nombreux animaux, c’est pourquoi avec un laboratoire mobile, nous pouvons maintenant amener le laboratoire aux animaux plutôt que de ramener les animaux au laboratoire. Avec la capacité d’isoler et de mesurer la respiration mitochondriale sur le terrain, les techniques qui étaient principalement utilisées par la biomédecine peuvent maintenant être utilisées dans un contexte écologique et évolutif.Commencez par garer le laboratoire mobile sur un terrain plat, puis allumez le générateur et mettez le véhicule à niveau. Déployez la glissière avant d’installer l’équipement. Procéder à la mise en place et à l’étalonnage des chambres de respiration mitochondriale à la température souhaitée des expériences et à la pression barométrique actuelle conformément aux instructions du fabricant.Utilisez une pointe de pipette coupée de cinq millilitres pour transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et homogénéisez le tissu avec une lame à 50 % de puissance pendant cinq secondes. Pour digérer le tissu, ajoutez cinq milligrammes de protéase par gramme de muscle humide pendant sept minutes, en mélangeant la solution toutes les 30 secondes. Terminez la réaction en ajoutant un volume égal du tampon d’isolement contenant BSA.Ensuite, centrifugez l’homogénat à 500 G pendant 10 minutes, puis transférez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette coupée de cinq millilitres à travers l’étamine à double couche dans un tube à centrifuger propre de 50 millilitres, puis centrifugez le surnageant filtré à 3 500 G pendant 10 minutes pour précipiter une pastille mitochondriale brune. Après avoir éliminé le surnageant, ajoutez le même volume de tampon d’isolement contenant du BSA dans le tube à centrifuger et remettez en suspension la pastille mitochondriale avec un grattoir flexible en travaillant doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger, puis centrifugez le tube à 3 500 G pendant 10 minutes. Remettre la pastille en suspension dans le tampon d’isolement sans BSA pour répéter l’étape de centrifugation comme décrit précédemment.Après la deuxième centrifugation, remettre en suspension la pastille mitochondriale dans le tampon de remise en suspension à l’aide d’un grattoir propre et flexible, et transférer les mitochondries remises en suspension dans un homogénéisateur Dounce avec une pointe de pipette coupée d’un millilitre. Avec l’homogénéisateur, homogénéisez soigneusement la suspension mitochondriale en quatre à cinq passages. Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre fraîchement coupée pour transférer la suspension mitochondriale homogénéisée dans un tube de microcentrifugation étiqueté de deux millilitres.Pour les mesures de la respiration mitochondriale des substrats complexes, ajoutez 945 microlitres de tampon respiratoire dans la chambre de respiration mitochondriale. Assurez-vous que l’agitateur tourne lorsque la température tampon est maintenue à 37 degrés Celsius. Scellez la chambre avec le haut, puis commencez à enregistrer la collecte de données.Une fois que la concentration d’oxygène s’est stabilisée, ajoutez 20 microlitres de suspension mitochondriale dans la chambre et placez le couvercle. Dans le logiciel, indiquez que les mitochondries ont été ajoutées à la chambre. Ajoutez 10 microlitres chacun d’une molaire de glutamate, de 200 millimolaires de malate et de 200 millimolaires de pyruvate dans la chambre avec les seringues individuelles, et attendez que le signal se stabilise avant d’indiquer les substrats ajoutés dans le logiciel.Utilisez une seringue séparée pour ajouter cinq microlitres d’adénosine diphosphate, ou ADP, dans la chambre. Indiquez l’ADP ajouté dans le logiciel et observez la consommation rapide d’oxygène de l’état trois. Une fois que la respiration de l’état trois et la consommation d’oxygène mitochondrial ont ralenti pendant quatre minutes pour indiquer la respiration de l’état quatre, terminez l’enregistrement et enregistrez le fichier de données.Pour les deux substrats complexes, répétez la procédure en ajoutant 963 microlitres de tampon respiratoire dans la chambre. Après avoir ajouté 20 microlitres de la suspension mitochondriale, ajoutez séquentiellement deux microlitres de quatre microgrammes par microlitre de roténone et 10 microlitres de succinate de 500 millimolaires dans la chambre à l’aide des seringues séparées. Lorsque le signal se stabilise, indiquez l’ajout de substrat dans le logiciel.Avec l’ajout de cinq microlitres d’ADP, observez la consommation rapide d’oxygène de l’état trois et indiquez l’ajout d’ADP dans le logiciel. Une fois que la respiration de l’état trois et la consommation d’oxygène mitochondrial ont ralenti pendant quatre minutes pour indiquer la respiration de l’état quatre, terminez l’enregistrement et enregistrez le fichier de données. Les résultats représentatifs indiquent les données brutes de la respiration mitochondriale.La pente raide de la troisième étape dans les substrats complexes représente la fréquence respiratoire maximale élevée. L’isolement réussi des mitochondries du muscle squelettique du membre postérieur a été observé par le virage serré et la stabilisation d’une nouvelle pente de l’état quatre. Un schéma similaire a pu être observé pour la respiration mitochondriale complexe à deux moteurs.Le mauvais fonctionnement des mitochondries a entraîné le couplage des mitochondries pour la respiration mitochondriale complexe. Cependant, un autre exemple typique de mauvais fonctionnement des mitochondries a montré le complexe découplé deux respirations mitochondriales avec une ligne plate après l’ajout d’ADP, et aucun tour pour produire les données de l’état quatre. Les valeurs numériques de l’état trois, de l’état quatre et du rapport de contrôle respiratoire, ou RCR, pour le complexe un et le complexe deux ont été déterminées à partir des données de mesure de la respiration Lors de la collecte, des tissus supplémentaires peuvent être surgelés afin de les utiliser à l’avenir pour mesurer la densité mitochondriale ou les dommages oxydatifs.De plus, après la procédure, des mitochondries isolées peuvent également être congelées pour mesurer les activités du transport d’électrons et des complexes de chaînes. La capacité d’isoler et de mesurer la respiration mitochondriale sur le terrain ouvrira la voie à une meilleure compréhension du rôle des mitochondries dans l’évolution de la vie complexe.

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