Name: Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez la visualisation des extrémités plus des microtubules par transfection de plasmide EB3 dans des fibroblastes cutanés primaires humains. Cette méthode permet d'étudier l'influence de la huntingtine mutante sur la dynamique des microtubules dans la maladie de Huntington.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été financée par le ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention n ° 075-15-2019-1669 (transfection de fibroblastes), par la Fondation russe pour la science, subvention n ° 19-15-00425 (tous les autres travaux sur la culture de fibroblastes in vitro). Il a été partiellement soutenu par le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou PNR5.13 (imagerie et analyse). Les auteurs reconnaissent le soutien du Centre d’excellence Nikon de l’Institut de biologie physico-chimique A. N. Belozersky. Nous tenons à remercier tout particulièrement Ekaterina Taran pour son aide en doublage. Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.

Ce protocole suit les directives du Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine de la Federal Medical Biological Agency datées du 8 septembre 2015.
REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole.
1. Obtention d’une culture primaire de fibroblastes cutanés humains (Figure 2)
<ol><li>Administrer la biopsie à un laboratoire en quelques heures dans le milieu Modifié Eagle Media (DMEM) de Dulbecco complété par 50 μg/mL de pénicilline et 50 U/mL de streptomycine. REMARQUE: Une biopsie cutanée doit être effectuée dans des conditions stériles par un médecin après qu’un patient a signé un consentement éclairé.</li>
	<li>Placez le tissu de biopsie dans une boîte de Petri de 6 cm avec une petite quantité du milieu.</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel stérile, coupez l’échantillon de biopsie en morceaux d’environ 0,5 à 1 mm. Placez 1-2 fragments obtenus dans une boîte de Petri de 3,5 cm et placez un couvercle stérile sur les morceaux de biopsie. Ajouter lentement 1,5 mL d’un milieu de croissance à la composition suivante : DMEM, 50 U/mL de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).</li>
	<li>Cultivez des fibroblastes dans le milieu de croissance à l’intérieur d’un incubateur à CO2 maintenu à5%de CO2, 37 °C, 80% d’humidité. REMARQUE: Après 4-7 jours, les premiers kératinocytes, puis les fibroblastes, commencent à migrer du tissu vers le fond du plat.</li>
</ol>2. Entreposage, congélation et décongélation de la culture primaire
<ol><li>Retirer les cellules de la boîte de culture (voir points 3.2-3.4).</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 200 x g. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 900 μL de FBS refroidi.</li>
	<li>Transférer dans un tube de cryoconservation goutte à goutte et ajouter 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).</li>
	<li>Placer la cryosonde dans un congélateur à basse température à -80 °C. Vingt-quatre heures plus tard, transférer le cryovial dans l’azote liquide (−196 °C) pour un stockage à long terme.</li>
	<li>Pour décongeler les cellules cryoconservées, retirer le cryovial du stockage d’azote et, en 1 min, transférer 1 mL du contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL du milieu de transport préchauffé à 37 °C.</li>
	<li>Remettre soigneusement en suspension puis centrifuger le tube pendant 5 min à 200 x g. Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans le volume requis du milieu de croissance et placez-les sur une boîte de Pétri du diamètre requis.</li>
</ol>3. Culture cellulaire
<ol><li>Couvrir le fond du plat avec une solution de gélatine autoclavée à 0,1% préparée dans de l’eau distillée. Incuber pendant 15 min. REMARQUE: Pour la visualisation de la transfection, des plats à fond de verre (plats confocaux d’une épaisseur de verre de 170 μm) doivent être utilisés.</li>
	<li>Préparer un milieu de culture ayant la composition suivante : DMEM complété par 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 50 U/mL pénicilline-streptomycine. Bien mélanger et conserver à 4 °C. Réchauffer le milieu à 37 °C avant de l’ajouter aux cellules.</li>
	<li>Évaluez la culture au microscope. Retirez le milieu et lavez les fibroblastes avec la solution phosphate-sel (DPBS) de Dulbecco.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de trypsine préchauffée à 0,25 % aux cellules. Vérifiez les cellules au microscope si elles se détachent complètement du substrat. Désactiver la trypsine avec 1 mL du milieu de culture.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre la pastille de cellule dans 1 mL du milieu de culture.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules. Calculer le nombre requis de cellules pour les ensemencer avec une densité de 8-15 x10 3/cm2 et les remettre en suspension dans 2 mL du milieu de culture.</li>
	<li>Retirer la solution de gélatine de la boîte de culture et ajouter immédiatement 2 mL de la suspension cellulaire. Cultivez des fibroblastes à 37 °C dans un incubateur à CO2.</li>
	<li>Rafraîchissez le milieu tous les 2-4 jours. REMARQUE: Pour les expériences, utilisez les cellules de 4 à 11 passages.</li>
</ol>4. Transfection
<ol><li>Remplacer le milieu de culture par un milieu de culture frais 24 h avant la transfection. REMARQUE: La confluence cellulaire doit être de 70 à 80%.</li>
	<li>Préparez un complexe ADN-lipide en fonction de la surface et de la densité de l’ensemencement cellulaire. Utilisez un agent de transfection à base de liposomes. REMARQUE: Utilisez la densité d’ensemencement cellulaire comme 1 x10 4 cellules / cm2.</li>
	<li>Ajouter 3 μL de réactif de transfection commercial à 125 μL de milieu essentiel minimal optimal (Opti-MEM) ne contenant aucun antibiotique, sans toucher les parois du tube. Remettez en suspension doucement.</li>
	<li>Diluer l’ADN plasmidique (GFP-EB3) en ajoutant 1 μg d’ADN plasmidique à 125 μL d’Opti-MEM. Remettez en suspension doucement. REMARQUE: L’encodage vectoriel d’expression GFP-EB311 a été reçu comme un cadeau aimable du Dr I. Kaverina (Université Vanderbilt, Nashville) avec la permission du Dr A. Akhmanova (Université Erasmus, Rotterdam)11.</li>
	<li>Ajouter de l’ADN plasmidique dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué (1:1). Incuber pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter le complexe ADN-lipide à la boîte de Petri de 6 cm contenant des cellules et mélanger avec une balançoire cruciforme pendant 30 s. Incuber les cellules avec un agent de transfection pendant 24 h, puis passer à un milieu frais. Analyser l’efficacité de la transfection après 24 h et 48 h. REMARQUE: 24 h après la transfection, l’efficacité était de 10-15%, et après 48 h jusqu’à 40%.</li>
</ol>5. Préparation à l’imagerie
<ol><li>Avant l’imagerie vivante des cellules, changez le milieu de culture en un milieu sans colorant indicateur de pH pour réduire l’autofluorescence.</li>
	<li>Appliquez soigneusement l’huile minérale sur la surface du milieu pour couvrir complètement le milieu, en l’isolant de l’environnement extérieur pour réduire la pénétration de l’O2 et l’évaporation du milieu.</li>
	<li>Utilisez une lampe au mercure et un objectif à immersion dans l’huile 60x ou 100x avec une ouverture numérique élevée pour prendre les images. REMARQUE: Pour les observations in vivo, le microscope doit être équipé d’un incubateur pour maintenir les conditions nécessaires aux cellules, y compris le chauffage de la table d’objets et de la lentille à +37 ° C, une chambre fermée avec alimentation en CO2 et un support du niveau d’humidité. Utilisez de l’eau distillée double pour créer de l’humidité. Vérifiez le niveau d’eau double distillée avant de filmer.</li>
	<li>Placez la boîte confocale avec les cellules dans le support du microscope avant l’imagerie. Assurez-vous que la parabole et l’appareil photo sont solidement fixés au support pour éviter de dériver lors de la prise d’images.</li>
</ol>6. Définition des paramètres d’imagerie
<ol><li>Choisissez les faibles valeurs d’exposition, car la lumière induit des espèces réactives de l’oxygène (ROS) endommageant les cellules. NOTE: Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes de la peau humaine, une exposition de 300 ms a été sélectionnée.</li>
	<li>Concentrez-vous sur l’objet d’intérêt. REMARQUE: Pour l’imagerie time-lapse à long terme, utilisez le système de stabilisation automatique de la mise au point pour compenser un éventuel décalage le long de l’axe z.</li>
	<li>Choisissez les conditions d’imagerie optimales en fonction de la photosensibilité des cellules et du taux de décoloration du fluorochrome. REMARQUE: Étant donné que les microtubules sont des structures très dynamiques, un intervalle de temps raisonnablement court peut être sélectionné et la fréquence d’images doit être suffisamment élevée. Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés, nous avons utilisé à une fréquence de 1 image/ s pendant 3-5 min.</li>
	<li>Lorsque vous sélectionnez l’objet suivant pour obtenir l’image, éloignez-vous de la zone déjà imagée. Comme cette zone était sous l’influence de la lumière, il y aura un photo-blanchiment notable. REMARQUE: Comme une fréquence d’imagerie relativement élevée a été utilisée, l’obturateur ne s’est pas fermé entre les images et la lampe a été allumée pendant toute la période d’imagerie, ce qui explique pourquoi la décoloration a augmenté.</li>
	<li>Choisissez la vidéo optimale pour étudier visuellement la dynamique des microtubules, en tenant compte de la qualité de la transfection, de la qualité des images des microtubules (rapport signal/bruit optimal) et de l’absence de dérive dans le cas de la cellule analysée(Figure 3).</li>
	<li>Utilisez les vidéos sélectionnées pour étudier la dynamique des extrémités plus des microtubules en les traçant dans le programme ImageJ ou Fiji (Figure 4). REMARQUE : Pour obtenir des instructions d’analyse quantitative, voir la figure supplémentaire 2 et le dossier supplémentaire 1.</li>
</ol>

<ol><li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-associated+Protein+1+%28HAP1%29+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+dynein%2Fdynactin-mediated+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li>
<li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li>
<li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li>
<li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Huntington%27s+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li>
<li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manifestation+of+Huntington%27s+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polymerization+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li>
<li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li>
<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo%3A+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li>
<li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li>
<li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li>
<li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li>
<li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+neuronal+development%2C+plasticity%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li>
<li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li>
<li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+MTs%3A+persistent+growth+in+the+cell+interior%2C+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des résultats de meilleure qualité pour l’analyse de la dynamique des microtubules peuvent être obtenus à partir d’images microscopiques de haute qualité. Il est important d’observer toutes les conditions nécessaires à l’imagerie time-lapse des cellules vivantes et d’ajuster correctement les paramètres d’imagerie. L’utilisation de plats de culture cellulaire spéciaux avec un fond en verre (plats confocaux) est importante, car le verre a un indice de réfraction de la lumière différent de celui du plastique. L’épaisseur du...

La maladie de Huntington (MH) est une pathologie neurodégénérative incurable causée par un gène mutationnaire codant pour la protéine de lahuntingtine (HTT). HTT est principalement associé aux vésicules et aux microtubules et est probablement impliqué dans les processus de transport dépendants des microtubules1,2. Pour étudier l’influence de l’HTT mutant sur la dynamique des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vitro de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en liant et en stabilisant les extrémités plus en croissance. Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, une transfection plasmidique a été appliquée. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes obtenue à partir de la biopsie cutanée des patients MH pour cette étude.
La mutation du gène de la protéine HTT entraîne l’allongement du tractus de la polyglutamine3. HTT a un rôle dans des processus cellulaires tels que l’endocytose4, le transport cellulaire1,2, la dégradation des protéines5, etc. Une partie substantielle de ces processus implique divers éléments du cytosquelette cellulaire, y compris les microtubules.
Les cellules primaires humaines sont le meilleur modèle pour reproduire le plus fidèlement possible les événements qui se produisent dans les cellules des patients. Pour créer de tels modèles, il faut isoler des cellules à partir de matériel de biopsie humaine (par exemple, à partir d’échantillons chirurgicaux). La lignée cellulaire primaire résultante convient à l’étude de la pathogenèse à l’aide de diverses méthodes génétiques, biochimiques, moléculaires et de biologie cellulaire. En outre, les cultures de cellules primaires humaines servent de précurseur pour la création de diverses cultures transdifférenciées ettransgéniques 6.
Cependant, contrairement aux cultures cellulaires immortalisées, l’inconvénient significatif des cellules primaires est leur capacité de passage limitée. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des cellules au stade des premiers passages (jusqu’à 15). Les cultures plus anciennes dégénèrent très rapidement, perdant leurs propriétés uniques. Ainsi, les cellules primaires nouvellement obtenues doivent être conservées congelées pour un stockage à long terme.
Les cultures cellulaires primaires sont sensibles aux conditions de culture. Par conséquent, ils nécessitent souvent des approches uniques et une optimisation des conditions de croissance. En particulier, les fibroblastes primaires de la peau humaine utilisés dans nos expériences sont exigeants sur le substrat. Par conséquent, nous avons utilisé divers revêtements supplémentaires (par exemple, de la gélatine ou de la fibronectine) en fonction du type d’expérience.
Le cytosquelette cellulaire détermine la forme, la mobilité et la locomotion de la cellule. La dynamique du cytosquelette est cruciale pour de nombreux processus intracellulaires à la fois dans l’interphase et la mitose. En particulier, les cytosquelettes polymérisés à partir de la tubuline sont des structures hautement dynamiques et polaires, permettant un transport intracellulaire dirigé médié par les protéines motrices. Les extrémités des microtubules sont en réarrangement constant, leurs phases d’assemblage alternent avec les phases de démontage, et ce comportement est appelé « instabilité dynamique »7,8,9. Diverses protéines associées modifient l’équilibre de la réaction de polymérisation, conduisant soit à la formation de polymères, soit à la formation de monomères protéiques. L’ajout de sous-unités de tubuline se produit principalement à l’extrémité supérieure des microtubules10. La famille des protéines de liaison terminale (EB) se compose de trois membres : EB1, EB2 et EB3. Ils servent de protéines de suivi des extrémités plus (+TIP) et régulent les propriétés dynamiques des microtubules en se liant et en stabilisant leurs extrémités supérieures en croissance11.
De nombreuses études utilisent la micro-injection ou la transfection de tubuline marquée par molécule fluorescente avec imagerie time-lapse et analyse vidéo pour visualiser les microtubules in vitro. Ces méthodes peuvent être invasives et nocives pour les cellules, en particulier les cellules humaines primaires. L’étape la plus difficile consiste à trouver les conditions de transfection cellulaire. Nous avons essayé d’atteindre le plus haut niveau possible de transfection sans affecter la viabilité et la morphologie cellulaire native. Cette étude applique la méthode classique pour étudier les différences dans la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés de donneurs sains et de patients atteints de la maladie de Huntington.

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera iXon DU897 EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf Corporate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternative : Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>LUNA-II Automated Cell Counte</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de microscope pour le tournage à vie</td><td>Okolab</td><td>Régulateur de température H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Régulateur de gaz CO2-O2-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>Objectif CFI Plan Apo Lambda 60x Huile 1.4 (WD 0.13)</td><td>Alternative Nikon</td><td></td><td>: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Microscope optique à fluorescence grand champ Eclipse Ti-E</td> Alternative <td>Nikon</td><td></td><td>: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td><td>Logiciel</td><td></td><td></td>de traitement d’image open source</tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternative : Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Réactifs supplémentaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale (Huile blanc clair)</td><td>MP</td><td>Plat</td> de culture cellulaire 151694<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dish de culture cellulaire</td><td>SPL Lifesciences</td><td>20035</td><td></td></tr><tr><td>Plat confocal (épaisseur du verre 170 &amp; micro ; m)</td><td>SPL Lifesciences</td><td>211350</td><td>Alternative :</td></tr><tr><td>Tube de centrifugeuse conique</td> MatTek <td>SPL Lifesciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques</td><td>Corning-Costar</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Nest</td><td>615001</td><td></td></tr><tr><td>Cultivation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>PanEko</td><td><img alt="Equation 1 » src=">135</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Media)</td><td>PanEko</td><td>C420<img alt="Equation 2 » src="></td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco’s solution de phosphate-sel)</td><td>PanEko</td><td>P060<img alt="Équation 2 » src="></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de veau (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>K053/SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine (peau de bovin)</td><td>PanEko</td><td><img alt="Equation 1 » src=">070</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>519850026</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>PanEko</td><td>A063<img alt="Equation 2 » src="></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Transfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN plasmidique avec EB3-GFP</td><td>Don aimable du Dr I. Kaverina [Université Vanderbilt, Nashville] avec la permission du Dr A. Akhmanova [Université Erasmus, Rotterdam]</td><td>Stepanova et al., 2003 DOI : 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

La transfection avec une protéine marqueur d’intérêt marquée par fluorescence en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse est une méthode classique d’étude des propriétés dynamiques du cytosquelette. Ce protocole offre une technique de transfection des fibroblastes primaires humains, ce qui peut être difficile en raison des spécificités des conditions de culture cellulaire primaire. De plus, le maintien des propriétés dynamiques du cytosquelette nécessite un faible niveau de transfection pour obtenir un bon rapport signal/bruit sans provoquer de stabilisation des microtubules. Il est important de prendre des mesures pour protéger les cellules du stress induit par la lumière et de la décoloration des colorants fluorescents. Au cours de nos travaux, nous avons testé différentes méthodes et protocoles de transfection ainsi que différents vecteurs afin de sélectionner la meilleure combinaison de conditions adaptées aux études de fibroblastes primaires humains. Nous avons analysé les vidéos time-lapse résultantes et calculé la dynamique des microtubules à l’aide d’ImageJ. La dynamique des extrémités plus des microtubules dans les différentes parties cellulaires n’est pas similaire, nous avons donc divisé l’analyse en sous-groupes - la région centrosome, la lamelle et la queue des fibroblastes. Notamment, ce protocole peut être utilisé pour l’analyse in vitro de la dynamique du cytosquelette dans les échantillons de patients, permettant la prochaine étape vers la compréhension de la dynamique des différents développements de la maladie.

Les films GFP-EB3 produits à l’aide du protocole(Figure 1)illustrent les propriétés dynamiques des microtubules. Les microtubules sont impliqués dans différents processus cellulaires, et leurs propriétés dynamiques ont un impact sur diverses caractéristiques de vie de la culture cellulaire humaine primaire à partir du matériel de biopsie des patients (Figure 2).
Les paramètres suivants déterminent l’instabilité dynamique des microtubu...

Ce protocole est dédié à la visualisation des microtubules par transfection de la protéine EB3 afin d’étudier leurs propriétés dynamiques en culture cellulaire primaire. Le protocole a été mis en œuvre sur des fibroblastes cutanés primaires humains obtenus chez des patients atteints de la maladie de Huntington.

Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

La maladie de Huntington, MH, est une pathologie neurodégénérative incurable causée par une mutation d’un gène codant pour la protéine huntingtine. La huntingtine est principalement associée aux vésicules et aux microtubules, et probablement impliquée dans les processus de transport dépendants des microtubules. Pour étudier l’influence de la huntingtine mutante sur le dynamisme des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vivo de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en pliant et en stabilisant les extrémités positives en croissance.Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, nous avons appliqué une transfection de plasmides. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes pour obtenir à partir de la biopsie cutanée du patient EB3 pour cette étude. Administrer la biopsie au laboratoire en quelques heures en milieu DMEM, complétée par 15 microgrammes par millilitre de pénicilline et 50 unités par millilitre de streptomycine.Placez le tissu de biopsie dans une boîte de Petri de six centimètres, avec une petite quantité de milieu. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez l’échantillon de biopsie en morceaux d’environ 0,5 à un millimètre. Placez un, deux, fragments obtenus dans une boîte de Petri de 3,5 centimètres et placez un couvercle stérile sur les morceaux de biopsie.Ajouter lentement 1,5 millilitre d’un milieu de croissance. Cultiver des faisceaux de fibres dans le milieu de croissance dans un incubateur à CO2, dans 5% de CO2 soit sept centigrades, 80% d’humidité. Après quatre, sept jours, les premiers kératinocytes, puis les fibroblastes commencent à migrer du tissu vers le fond du plat.Culture cellulaire. Pour la visualisation de la transfection, des plats confocaux en verre, des plats confocaux doivent être utilisés. Couvrir le fond du plat avec une solution de gélatine autoclavée à 0,1% préparée dans de l’eau distillée.Incuber pendant 15 minutes. Préparez le support de culture. Bien mélanger, conserver haut à plus 4 centigrades.Réchauffer le milieu à plus 37 centigrades, avant de l’ajouter aux cellules. Évaluez la culture au microscope. Retirez le milieu et lavez les cellules avec un DPBS stérile.Ajouter un millilitre de solution de trypsine préchauffée à 0,25% aux cellules. Vérifiez les cellules au microscope si elles se détachent complètement du substrat. Désactiver la trypsine avec un millilitre du milieu de culture.Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 200 G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant, remettez en suspension la palette cellulaire dans un millilitre du milieu de culture.Comptez le numéro de cellule. Calculez le nombre requis de cellules. Désensemencez-les avec une densité de huit à 15, multipliée par 10 à la puissance de trois, passée d’un centimètre.Ceci est divisé en millilitres du milieu de culture. Retirer la solution de gélatine du plat de culture préparé pour l’inoculation et ajouter immédiatement deux millilitres de la suspension cellulaire. Cultivez des fibroblastes à plus 37 centigrades dans un incubateur à CO2.Rafraîchissez le médium tous les deux, quatre jours. Pour les expériences, utilisez les cellules de quatre, 11 passages. Au moment de la transfection, la confluence ne doit pas dépasser 70, 80% Remplacer le milieu de culture par un milieu frais 24 heures avant la transfection.Préparez un complexe ADN-lipide, en fonction de la surface et de la densité de l’ensemencement cellulaire. L’agent de transfection liposomale et la densité de l’ensemencement cellulaire d’un, multiplié par 10 à la puissance de quatre cellules, passée d’un centimètre ont été utilisées. Ajouter trois microlitres de réactif commercial à 125 microlitres d’Opti-MEM, ne contenant aucun antibiotique.Sans toucher les parois du tube, remettez doucement en suspension. Diluer l’ADN plasmidique, GFP-EB3, en ajoutant un microgramme de l’ADN plasmidique à 125 microlitres d’OptiMEM. Remettez en suspension doucement.Ajouter de l’ADN plasmidique dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué, rapport un pour un. Incuber pendant 30 minutes. Ajoutez le complexe lipidique DE l’ADN à la boîte de Petri de six centimètres avec des cellules.Mélanger avec une balançoire cruciforme pendant 30 secondes. Incuber les cellules avec un agent de transfection pendant 24 heures, puis changer le milieu en un fluide frais. Analysez l’efficacité après inspection en 24 et 48 heures.Préparation à l’imagerie. Avant l’imagerie en direct des cellules, changez le milieu de culture en un milieu sans colorant indicateur de pH pour réduire l’autofluorescence. Appliquez soigneusement l’huile minérale sur la phase cellulaire moyenne pour couvrir complètement le milieu, en l’isolant de l’environnement externe pour réduire la pénétration de l’O2 et l’évaporation du milieu.Utilisez une lampe macro et toutes les images dans un objectif 60 fois, 100 fois avec une ouverture numérique élevée pour prendre l’image. Car dans les observations viva, le microscope doit être équipé d’un incubateur pour maintenir les conditions nécessaires aux cellules, y compris frapper la table optique, et la lentille pour passer 37 Centigrades, une chambre fermée était l’alimentation en CO2, et le soutien du niveau d’humidité. Placez la boîte confocale avec les cellules dans le support du microscope avant l’imagerie.Assurez-vous que la parabole et l’appareil photo sont solidement fixés au support pour éviter de dériver lors de la prise d’images. Définition des paramètres d’imagerie. Choisissez les faibles valeurs d’exposition, car la lame induit des dommages aux cellules, réagit avec les espaces d’oxygène.Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes de la peau humaine, nous avons sélectionné une exposition de 300 millisecondes. Concentrez-vous sur l’objet d’intérêt. Pour l’imagerie time-lapse à long terme, le système de stabilisation automatique de la mise au point, un système de mise au point parfait est nécessaire, car il peut y avoir un décalage le long de l’axe défini et l’objet d’intérêt sera donc flou.Choisissez les conditions d’imagerie optimales, en fonction de la photosensibilité de la cellule et de la vitesse de décoloration du chrome évasé. Étant donné que les microtubules sont des structures très dynamiques, le temps est raisonnablement court et la fréquence d’images doit être suffisamment élevée. Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés, nous avons utilisé une fréquence d’une image par seconde, pendant trois, cinq minutes.Lorsque vous sélectionnez l’objet suivant pour obtenir l’image, éloignez-vous de la zone déjà imagée, car sous l’influence de la lumière, il y a un saignement photo-saignable. Comme nous avons utilisé une fréquence d’imagerie relativement élevée, l’obturateur ne s’est pas fermé entre les images et la lampe était en retard pendant toute la période d’imagerie, qui s’estompe de plus en plus. Choisissez les vidéos optimales pour étudier visuellement la dynamique des microtubules, en tenant compte de la qualité de la transfection, de la qualité des images des microtubules, du rapport signal/bruit optimal et de l’absence de dérive de la cellule analysée.Utilisez les vidéos sélectionnées pour étudier la dynamique des microtubules plus-ends, en les plaçant dans le programme Fidji. L’étape la plus critique du protocole est la transfection, assurant une expression protéique suffisante. Un bon rapport signal/bruit, aucun photoblanchiment des microtubules et l’absence de dérive cellulaire sont essentiels pour l’imagerie.La visualisation in vivo de la dynamique des microtubules fournit des informations vitales sur les propriétés de la huntingtine mutante. Notre protocole peut être appliqué à des études d’autres maladies, dont la pathologie implique des propriétés dynamiques du cytosquelette.

microtubule-plus-end-dynamics-visualization-huntington-s-disease

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Les fibroblastes de patients porteurs de mutations dans la maladie de Parkinson pathogènes gènes représentent une forme accessible...

L&#39;utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson

L', logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d'images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics Xenopus laevis Cônes de croissance

Les protocoles pour la culture de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), la transfection transitoire de marqueurs de croissance des microtubules marqués par fluorescence, l’imagerie de cellules vivantes et l’analyse automatisée de la dynamique de croissance des microtubules interphase sont détaillés.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

Levure bourgeonnante est un modèle avantageux pour l' étude de la dynamique des microtubules in vivo en raison de sa génétique puissante et la simplicité de son cytosquelette de microtubules. Le protocole suivant décrit comment transformer des cellules de levure et de culture, d'acquérir des images de microscopie confocale, et analyser quantitativement la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure.

L&#39;imagerie à haute résolution et d&#39;analyse de l&#39;individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

Ici nous présentons une méthode robuste et détaillée d'analyse de dynamique de microtubule dans les cellules synchronisées dans prometaphase utilisant la microscopie confocale de disque de filature de cellules vivantes et le traitement d'image MATLAB-basé.

Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Ici, un essai de reconstitution in vitro basé sur la microscopie TIRF est présenté pour quantifier et comparer simultanément la dynamique de deux populations de microtubules. Une méthode est décrite pour visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs protéines associées aux microtubules sur des faisceaux de microtubules réticulés et des microtubules simples.

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Dans cet article, nous présentons un protocole pour détecter les oligodendrocytes chargés de microtubules dans un modèle de tubulopathie grâce à une approche simple et innovante de microscopie de deuxième génération harmonique.

Optique non linéaire sans marquage pour l’étude des défauts dépendants de la tubuline dans la myéline centrale

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Dans ce rapport, nous décrivons la peau en trois dimensions de reconstruire le modèle qui imite la peau humaine dans l'architecture et la composition. La physiologie des mélanocytes, la progression du mélanome et le destin des cellules souches dermiques ont été étudiés en utilisant la peau de reconstruire le modèle. Le modèle est également utile comme outil pour l'évaluation préclinique de médicaments.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Découvrez la visualisation des extrémités plus des microtubules par transfection de plasmide EB3 dans des fibroblastes cutanés primaires humains. Cette méthode permet d'étudier l'influence de la huntingtine mutante sur la dynamique des microtubules dans la maladie de Huntington.

Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine

Explorer plus de vidéos