Name: Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Découvrez l'imagerie à molécule unique des condensats EWS-FLI1 sur ADN pour étudier la séparation de phase des facteurs de transcription. Cette méthode révèle la dynamique de formation des condensats et leur lien avec la tumorigenèse du sarcome d'Ewing.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Comme les approches monomoléculaires sont extrêmement sensibles au contenu du système réactionnel, des efforts supplémentaires doivent être investis pour assurer la bonne qualité de tous les matériaux et solutions lors des expériences DNA Curtains, en particulier les lipides préparés dans les sections 1 et 2 et les tampons utilisés dans la section 5. Des réactifs de plus grande pureté doivent être utilisés pour préparer les tampons, et les tampons doivent être fraîchement préparés pour le dosage d’une seule molécule....

La régulation transcriptionnelle est une étape cruciale pour l’expression précise des gènes dans les cellules vivantes. De nombreux facteurs, tels que la modification chromosomique, les facteurs de transcription (TF) et les ARN non codants, participent à ce processus compliqué 1,2,3. Parmi ces facteurs, les TF contribuent à la spécificité de la régulation transcriptionnelle en reconnaissant et en se liant à des séquences d’ADN spécifiques appelées promoteurs ou amplificateurs, puis en recrutant d’autres protéines fonctionnelles pour activer ou réprimer la transcription 4,5,6,7. La façon dont ces TF parviennent à rechercher leurs sites cibles dans le génome humain et à interagir avec l’ADN recouvert d’histones et de protéines non liant l’ADN aux histones a laissé les scientifiques perplexes pendant des décennies. Au cours des dernières années, plusieurs modèles classiques pour le mécanisme de recherche de cibles des TF ont été construits pour décrire comment ils « glissent », « sautent », « sautent » ou « transfèrent entre segments » le long de la chaîne d’ADN 8,9,10,11. Ces modèles sont axés sur le comportement de recherche sur l’ADN d’une seule molécule TF. Cependant, des études récentes montrent que certains TF subissent une séparation en phase liquide-liquide (LLPS) soit seuls dans le noyau, soit avec le complexe Mediator12. Les gouttelettes observées de TF sont associées aux régions promotrices ou amplificateurs, mettant en évidence le rôle de la formation de condensats biomoléculaires dans la transcription et le génome tridimensionnel13,14,15. Ces condensats biomoléculaires sont liés à des compartiments dépourvus de membrane in vivo et in vitro. Elles sont formées via LLPS, dans lesquelles les biomacromolécules modulaires et les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) des protéines sont deux forces motrices principales des interactions multivalentes16. Ainsi, les TF non seulement recherchent l’ADN, mais fonctionnent également en synergie au sein de ces condensats 4,17,18. À ce jour, la propriété biophysique de ces condensats de transcription sur l’ADN reste incertaine.
Par conséquent, cette étude visait à appliquer une méthode à molécule unique - DNA Curtains - pour imager directement la formation et la dynamique des condensats de transcription formés par les TF sur l’ADN in vitro. DNA Curtains, une plate-forme d’imagerie in vitro à haut débit pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN, a été appliquée à la réparation de l’ADN 19,20,21, à la recherche de cibles22 et à LLPS 17,23,24. La cellule d’écoulement des rideaux d’ADN est recouverte de bicouches lipidiques biotinylées pour passiver la surface et permettre aux biomolécules de diffuser à la surface. Les motifs en zigzag nanofabriqués limitent le mouvement de l’ADN. Les substrats d’ADN lambda biotinylé peuvent s’aligner le long des bords de la barrière et être étirés par le flux tampon orienté. Les mêmes séquences de début et de fin de toutes les molécules permettent le suivi de la protéine sur l’ADN et décrivent la distribution de position des événements de liaison25,26. De plus, la combinaison de rideaux d’ADN avec la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) aide à minimiser le bruit de fond et à détecter les signaux au niveau d’une seule molécule. Ainsi, les rideaux d’ADN pourraient être une méthode prometteuse pour étudier la dynamique de la formation de condensats de transcription sur les motifs d’ADN. Cet article décrit l’exemple d’une oncoprotéine de fusion familiale FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, générée par translocation chromosomique. L’ADN lambda contenant 25× GGAA - la séquence de liaison de EWS-FLI127 - a été utilisé comme substrat d’ADN dans les expériences DNA Curtains pour observer comment les molécules EWS-FLI1 subissent LLPS sur ADN. Ce manuscrit traite en détail du protocole expérimental et des méthodes d’analyse des données.

<table><tbody><tr><td>Laser à semi-conducteurs 488 nm diodepompé</td><td>Cohérent</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>Laser à semi-conducteurs 561 nm Cohérent</td><td></td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>biotinylé DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>Le revêtement protecteur conducteur</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I bovin</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Packing Extracts</td><td>Epicentre</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Broth</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, LACTATE D’ÉTHYLE 4 %</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOLE 2 %</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Caméra CMOS SCIENTIFIQUE</td><td>PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Lame en verre de silice</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vanne d’injection à six voies</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>Dilué avec ddH2O</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard</td><td>Apparatus11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Iodure (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>Dilué avec DMSO</td></tr></tbody></table>

imagerie à molécule unique de condensats ews-fli1 assemblés sur de l’adn

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Les gènes de fusion résultant de la translocation chromosomique ont été trouvés dans de nombreuses tumeurs solides ou leucémies. EWS-FLI1, qui appartient à la famille des oncoprotéines de fusion FUS/EWS/TAF15 (FET), est l’un des gènes de fusion les plus fréquemment impliqués dans le sarcome d’Ewing. Ces protéines de fusion de la famille FET hébergent généralement un domaine de faible complexité (LCD) de la protéine FET à leur extrémité N et un domaine de liaison à l’ADN (DBD) à leur extrémité C. Il a été confirmé que EWS-FLI1 forme des condensats biomoléculaires à ses loci de liaison cibles en raison des interactions LCD-LCD et LCD-DBD, et ces condensats peuvent recruter l’ARN polymérase II pour améliorer la transcription des gènes. Cependant, la façon dont ces condensats sont assemblés sur leurs sites de liaison reste incertaine. Récemment, une méthode biophysique à molécule unique, DNA Curtains, a été appliquée pour visualiser ces processus d’assemblage des condensats EWS-FLI1. Ici, le protocole expérimental détaillé et les approches d’analyse des données sont discutés pour l’application des rideaux d’ADN dans l’étude des condensats biomoléculaires assemblés sur l’ADN cible.

Le schéma des rideaux d’ADN est illustré à la figure 1A, à la figure 1B et à la figure 1D. La séquence cible clonée contenant 25 répétitions ininterrompues de GGAA se trouve dans le promoteur NORB1 dans le sarcome d’Ewing. Cette séquence cible est cruciale pour le recrutement EWS-FLI128. Les molécules EWS-FLI1 ont été visualisées en détectant les signaux EWS-FLI1 marqués mCherry obtenus avec un laser...

Ici, nous décrivons l’utilisation de la méthode d’imagerie à molécule unique, les rideaux d’ADN, pour étudier le mécanisme biophysique des condensats EWS-FLI1 assemblés sur l’ADN.

Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Nous fournissons un test à molécule unique pour observer la séparation de phase des facteurs de transcription sur l’ADN Cette technique permet la réalisation en temps réel du processus dynamique d’assemblage des facteurs de transcription sous forme de gouttelette liquide sur l’ADN. EWS-FL1 est l’un des gènes de fusion les plus fréquemment impliqués dans la tumorigenèse du sarcome d’Ewing. Notre recherche a pu identifier la relation entre le nombre de motifs d’ADN et la formation de condensat EWS-FL1 qui est associée à une transcription génique stérile dans les cellules tumorales, et peut-être utile pour le pronostic.Cette méthode pourrait être appliquée pour étudier n’importe quel condensat ou complexe de transcription in vitro, comme P53 et MED1. Pour préparer une cellule d’écoulement avec des barrières nanofabriquées en zigzag pour une expérience de rideau d’ADN, connectez les tubes d’entrée et de sortie dans la bonne direction. Ensuite, lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon lipidique à l’aide de deux seringues de trois millilitres, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulle dans la cellule d’écoulement.Retirez la seringue de la sortie et injectez un millilitre de solution liposomique trois fois avec une incubation de cinq minutes entre chaque injection. Pour la guérison, relavez lentement la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon lipidique et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, préparer le tampon BSA comme mentionné dans le manuscrit du texte.Ensuite, après 30 minutes de guérison, lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon BSA du côté de la sortie. Ensuite, injectez 800 microlitres de tampon de streptavidine dans la cellule d’écoulement du côté de l’entrée en deux étapes avec une incubation de 10 minutes après chaque étape. Ensuite, lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 millilitres de tampon BSA pour éliminer toutes les molécules de streptavidine libres.Ensuite, diluez l’ADN lambda de biotine avec des motifs clonés à l’aide d’un tampon BSA et injectez-le quatre fois lentement à intervalles de cinq minutes. Pendant l’injection, allumez le microscope dans le système scientifique complémentaire à semi-conducteur à oxyde métallique. Ensuite, lavez le tube avec 10 millilitres d’eau distillée double et rincez le prisme et le connecteur de tuyauterie avec de l’eau, un nettoyant cuvette liquide à 2% et de l’éthanol à 99%.Ensuite, aspirez au moins 20 millilitres du tampon d’imagerie dans une seringue de 30 millilitres. Installez la cellule d’écoulement sur la platine du microscope et connectez-la au système microfluidique. En utilisant un débit de 0,03 millilitre par minute, rincer les molécules d’ADN à la barrière pendant 10 minutes.Ensuite, éteignez le système microfluidique et incuber pendant 30 minutes. avec l’écoulement arrêté, permettant à l’ADN de diffuser latéralement. Pour imager la formation de condensation EWS-FLI1 sur des rideaux d’ADN, ouvrez le logiciel d’imagerie et recherchez et marquez les positions des neuf motifs en zigzag sous fond clair.Ensuite, allumez le flux à 0,2 millilitre par minute pour colorer l’ADN avec un colorant ADN double brin pendant 10 minutes. Ensuite, diluez la protéine mCherry EWS-FLI1 avec le tampon d’imagerie à une concentration de 100 nanomoles dans 100 microlitres. Ensuite, chargez l’échantillon de protéines à travers la valve avec une seringue en verre de 100 microlitres et modifiez le débit à 0,4 millilitre par minute.Après avoir allumé le laser de 488 nanomètres, pré-balayez chaque région pour vérifier l’état de distribution de l’ADN et sélectionner la région dans laquelle les molécules d’ADN se répartissent uniformément. Réglez ensuite la puissance laser sur 10% pour le laser 488 nanomètres et 20% pour le laser 561 nanomètres. Et à l’aide du capteur de puissance, mesurez la puissance réelle du laser près du prisme.Commencez à acquérir des images à intervalles de deux secondes avec des lasers de 488 et 561 nanomètres simultanément. Ensuite, passez le mode manuel au mode injection pour laisser le tampon d’imagerie rincer l’échantillon de protéines dans la cellule d’écoulement après 60 secondes. Pour retirer l’EWS-FLI1 libre, continuez à laver la cellule d’écoulement avec le tampon d’imagerie pendant cinq minutes avec seulement le laser 561 nanomètres allumé.Ensuite, arrêtez l’écoulement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après 10 minutes, activez le débit à 0,4 millilitre par minute pour laisser l’ADN s’étendre et acquérir des images à deux secondes d’intervalle entre différentes images pour obtenir des données à haut débit de la formation de condensats EWS-FLI1. Les molécules EWS-FLI1 ont été visualisées en détectant les signaux EWS-FLI1 marqués mCherry obtenus avec un laser de 561 nanomètres.La formation in vitro du condensat EWS-FLI1 sur le site des 25 répétitions GGAA dans le substrat d’ADN a pu être directement visualisée. La spécificité du mCherry EWS-FLI1 utilisé dans les rideaux d’ADN a été confirmée par un test de décalage de mobilité électrophorétique utilisant un modèle d’ADN avec et sans les 25 répétitions GGAA séparément. Lorsque la concentration d’EWS-FLI1 a été titrée de 20 à 500 nanomoles, l’intensité d’EWS-FLI1 a considérablement augmenté.Alors que le changement dans l’intensité de la DBD d’un FLI était négligeable lorsque les protéines étaient saturées pour couvrir les répétitions GGAA, ce qui suggère que EWS-FLI1 a formé des condensats sur l’ADN. L’injection doit être très lente et douce afin que le liposome et l’ADN puissent se répartir uniformément sur la cellule d’écoulement. Il est important d’effectuer une MSA pour confirmer qu’un facteur de transcription purifié se lie spécifiquement à la séquence cible in vitro.Cette technique permet aux gens d’explorer si le condensat facilitera la recherche cible des facteurs de transcription et son effet sur la transcription.

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