Name: Un système Explant pour les études d’imagerie time-lapse de l’assemblage de circuits olfactifs chez la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez l'imagerie time-lapse de l'assemblage des circuits olfactifs chez Drosophila melanogaster au niveau de l'axone unique. Cette méthode d'explant permet d'observer le développement neural en temps réel.

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Nous remercions N. Özel et R. Hiesinger pour leurs conseils sur la culture des explants; M. Wagner pour l’aide technique de la microscopie à deux photons; D.J. Luginbuhl pour la génération de mouches transgéniques; D. Friedmann pour des suggestions d’analyse de logiciels fidjiens; Y. Ge pour l’assistance au travail à la volée; C. McLaughlin et K.K.L. Wong pour leurs commentaires sur le manuscrit. L.L. est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute. Ce travail a été soutenu par les subventions 1K99DC01883001 (à T.L.) et R01-DC005982 (à L.L.).

1. Préparation des réactifs
REMARQUE: Toutes les étapes de ce protocole sont effectuées à température ambiante (20-25 ° C), sauf indication contraire.
<ol><li>Pour préparer la boîte de culture à l’immobilisation de l’explante lors de l’imagerie en accéléré, posez le Sylgard de 0,5 cm d’épaisseur (mélangez soigneusement deux composants liquides au rapport 10:1 avant utilisation) sur la surface inférieure d’une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm et laissez-la durcir pendant 48 h à température ambiante (Figure 2A, appelée plaque de Sylgard dans le texte suivant).</li>
	<li>Pour préparer les microbroches à l’immobilisation de l’explantation sur cette plaque, utilisez une paire de pinces pour coller plusieurs microbroches sur une bande avec les extrémités tranchantes alignées d’un côté (Figure 2B). Utilisez une paire de ciseaux pour couper ~2 mm des extrémités pointues des micro-broches (Figure 2B'). Utilisez des pinces pour maintenir les micro-broches coupées et insérez dans la couche Sylgard une plaque Sylgard préfabriquée (Figure 2C). Deux micro-broches sont utilisées pour immobiliser une explantation.</li>
	<li>Utilisez une brosse pour recueillir les nymphes blanches, qui forment du puparium en 1 h, de hsFLP, pebbled-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 génotype et transférez-les dans de nouveaux flacons. Choc thermique au bain-marie à 37 °C pendant 40 min pour induire des clones ORN clairsemés de types aléatoires. Après un choc thermique, mettre les flacons à 25 °C pendant 30 h, ce qui donne des nymphes vieillies à 30 h après la formation du puparium (APF).</li>
	<li>Pour préparer le milieu de culture pour l’explantation, ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) à 500 mL de milieu drosophila de Schneider. Filtrer le milieu et faire des aliquotes de 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL. Le milieu peut être conservé à 4 °C pendant 1 à 2 mois.</li>
	<li>Le jour de l’imagerie, prélever un tube de 45 mL de milieu drosophila de Schneider et ajouter 5 mL de sérum fœtal bovin (10 % v/v), 125 μL de solution mère d’insuline humaine de 4 mg/mL (concentration finale de 10 μg/mL), 50 μL de solution mère de 20-hydroxyecdysone de 1 mg/mL dissoute dans de l’éthanol (concentration finale de 1 μg/mL). Bien mélanger et transférer 15 mL de milieu plein dans un nouveau tube conique de 50 mL. Le reste du milieu complet peut être conservé à 4 °C pendant une semaine. Le sérum fœtal bovin, la solution mère d’insuline humaine et la solution mère de 20-hydroxyecdysone sont alicités et conservés à -20 °C.</li>
	<li>Oxygéner le milieu plein de 15 mL en pompant des bulles d’oxygène d’une bouteille d’oxygène sous la surface du liquide à travers une pointe de pipette stérile de 5 mL à raison d’une bulle / s pendant 20-30 min. Utilisez un film de paraffine pour couvrir l’ouverture du tube pendant ce processus.</li>
	<li>Stériliser la surface du puits de dissection et la plaque Sylgard (avec des micro-broches insérées sur la couche Sylgard, préparées par étapes A1 et A2) avec 70% d’éthanol. Laissez-les sécher avant utilisation.</li>
</ol>2. Dissection explant
<ol><li>Utilisez une brosse pour transférer les pupes APF (30 h après la formation du puparium) sur un mouchoir en papier et séchez la surface externe des nymphes pendant 5 min.</li>
	<li>Mettez un morceau de ruban adhésif double face sur une lame de verre. Fixez soigneusement les pupes séchées sur la surface collante du ruban adhésif avec la face dorsale tournée vers le haut. Appuyez doucement sur les nymphes à l’aide d’une brosse pour aider la face ventrale des nymphes à bien se fixer au ruban adhésif (Figure 3A). N’endommagez pas la nymphe.</li>
	<li>Utilisez une pince pour enlever le boîtier nymphal brun recouvrant la face dorsale de la tête (Figure 3A,B). Insérez une pointe pointue de la pince entre le boîtier de la nymphe brune et la nymphe du côté latéral et cassez soigneusement la tige de la nymphe brune à travers une ligne jusqu’à l’extrémité postérieure de la nymphe (Figure 3B, C). Ouvrez le boîtier nymphal brun. Utilisez une paire de pinces pour tenir doucement la nymphe et transférez-la au puits de dissection avec 1 mL de milieu plein oxygéné. Immergez la nymphe flottante sur la surface moyenne pour l’aider à couler au fond du puits (Figure 3D). REMARQUE: N’insérez pas la pointe de la pince trop profondément à l’intérieur de l’étui à nymphe brune pour éviter de blesser la nymphe avec la pince.</li>
	<li>Pour disséquer l’explantation antenne-cerveau de la nymphe, utilisez une pince pour tenir doucement la nymphe d’une main et utilisez une paire de microcissives pour couper un petit trou du côté postérieur de la nymphe de l’autre main (Figure 3E). Ce petit trou libère la haute pression à l’intérieur de la nymphe.</li>
	<li>Coupez à travers la ligne médiane ventrale de la nymphe du trou jusqu’au cou (la structure étroite qui relie la tête et le thorax) avec les microcisseurs (Figure 3F). Ensuite, coupez à travers la circonférence du cou pour détacher la tête du corps de la nymphe (Figure 3G). Retirez le corps et placez-le dans un puits différent. REMARQUE: Ne coupez pas le cou directement du côté dorsal / ventral de la nymphe, ce qui peut presser le cerveau.</li>
	<li>Coupez la cuticule transparente qui recouvre la face dorsale du cerveau (Figure 3H). Cela exposera le corps gras sur le dessus du cerveau. Gardez une cuticule à laquelle la rétine et les antennes s’attachent. Répétez la même procédure sur le côté ventral du cerveau. REMARQUE: N’insérez pas la lame des ciseaux trop profondément sous la cuticule, car cela provoquerait une coupure des nerfs antennes reliant les antennes et le cerveau (Figure 3H').</li>
	<li>Utilisez une pipette P10 pour laver doucement le corps gras qui recouvre le cerveau et les antennes en pipetachant le milieu vers les régions ouvertes des côtés dorsal et ventral de la tête (Figure 3I). REMARQUE: Soyez très doux lorsque vous pipetez le milieu car le cerveau peut facilement être détaché de la cuticule. Assurez-vous que tout le corps gras est enlevé au cours de cette étape. Le développement arrêté des axones ORN a été observé lorsque le corps gras n’était pas bien nettoyé, probablement en raison d’un mauvais accès à l’oxygène du milieu.</li>
	<li>Pour étudier l’interaction des axones ORN bilatéraux ou des axones ORN avec le ciblage de la dendrite PN, couper un ou deux nerfs antennes avec les microscisseurs au cours de cette étape8 (Figure 3J). Placez soigneusement les lames des ciseaux entre la cuticule et le cerveau et coupez les nerfs antennes intéressés.</li>
	<li>Pour transférer l’explante disséquée dans la plaque de Sylgard, placez une gouttelette de milieu plein oxygéné (~200 μL) sur la surface de Sylgard. Enduisez la surface interne d’une pointe de pipette de 200 μL de large avec le corps gras du tronc disséqué (étape 1.6) en pipetant le corps gras plusieurs fois, ce qui empêche les explants de coller la pointe de la pipette pendant le transfert. Ensuite, utilisez cette pointe de pipette à pointe large pour transférer l’explante du puits de dissection vers la gouttelette moyenne sur la plaque de culture (Figure 3K).</li>
	<li>Utilisez une pince pour épingler l’explantation sur la couche de Sylgard dans les deux lobes optiques (Figure 3L). Positionnez délicatement la plaque Sylgard sur la station d’imagerie et immobilisez la plaque avec des bandes. Ajouter lentement 10 mL de milieu plein oxygéné à la plaque Sylgard à l’aide de la pipette P1000. REMARQUE: Évitez de perturber l’explantation lors de l’ajout du milieu à la plaque de Sylgard.</li>
</ol>3. Imagerie en direct basée sur la microscopie à deux photons
<ol><li>Pour effectuer une imagerie time-lapse, utilisez un microscope à deux photons, un laser Ti:Sapphire, un objectif d’immersion dans l’eau 20x (1.0 NA) et un logiciel d’imagerie. Utilisez la longueur d’onde d’excitation à 920 nm pour l’imagerie des protéines GFP. Réglez le temps de séjour des pixels à 10 μs.</li>
	<li>Ajustez la position de la station d’imagerie de sorte que les explants soient à peu près sous l’objectif. Utilisez 70 % d’éthanol pour stériliser la lentille avant l’imagerie. Abaissez lentement l’objectif sous le milieu proche des explants. Vérifiez s’il y a une bulle sur l’objectif de l’objectif.<ol>
<li>Si c’est le cas, soulevez l’objectif au-dessus du support et répétez-le jusqu’à ce que la bulle ait disparu. Trouvez les explants à l’aide de l’oculaire et centrez une explantation dans le champ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour garantir une explantation avec quelques ORN peu étiquetés pour l’imagerie en accéléré, disséquez ~10 explants à chaque fois et alignez-les sur l’axe y sur la plaque de culture. Examinez toutes les explantes en déplaçant l’objectif le long de l’axe y et choisissez une explante dans laquelle quelques axones ORN uniques viennent d’atteindre le lobe de l’antenne pour l’imagerie (Figure 4A).<ol>
<li>Reconnaître le lobe de l’antenne par sa forme ovale et les axones ORN qui commencent à le contourner. Imagez une zone d’environ 150 μm x 150 μm dans le plan xy (zoom 3x avec l’objectif 20x). Estimer la limite des deux lobes d’antenne et les centrer dans la zone d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez une région d’imagerie initiale le long de l’axe z en définissant la section inférieure et la section supérieure de la numérisation. Configurez la zone d’imagerie le long de l’axe z. Définissez la section la plus profonde avec des signaux axonaux ORN comme première séance d’imagerie et la session 100 μm au-dessus (côté plus superficiel) comme dernière session d’imagerie (Figure 4B). REMARQUE: Cela laisse certaines sections sur le dessus (côté superficiel) des axones ORN et évite le déplacement des axones ORN vers le haut en dehors de la zone d’imagerie en raison de la croissance du cerveau pendant la culture.<ol>
<li>Image à des intervalles de 2 μm. Réglez la numérisation automatique de l’imagerie à la fréquence de toutes les 20 minutes à l’aide d’un logiciel d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déplacez la région d’imagerie de 20 μm vers le haut le long de l’axe z après la première imagerie de 4 h et de 20 μm vers le haut le long de l’axe z après 16 h d’imagerie. Cela peut être réalisé en définissant un script et différentes piles z dans le logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Cultiver l’explante pendant une période supplémentaire après l’imagerie (jusqu’à 24 h ex vivo) avant la fixation et la coloration avec la N-cadhérine, un marqueur neuropil, pour révéler l’identité génétique de chaque ORN par le glomérule qu’il cible.</li>
</ol>4. Traitement d’image
<ol><li>Pour traiter les images de la pile z des séries de sections prises à chaque point temporel à l’aide du logiciel Fidji, ouvrez la série de sections d’images, cliquez sur Image | Piles | Projet Z [/].</li>
	<li>Pour corriger la dérive latérale de l’échantillon pendant la culture, installez TurboReg Plugin aux Fidji.<ol>
<li>Ouvrez une série d’images de pile z et une seule image de pile z de la série. Ouvrir les plugins | | d’inscription TurboReg.</li>
		<li>Sélectionnez la série d’images de pile z dans Source et l’image de pile z unique dans Target | Traduction. Cliquez sur le bouton Batch pour enregistrer toutes les images de la série d’images z stack ouverte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour maximiser l’utilité des échantillons imagés, séparez les axones simples peu étiquetés les uns des autres à proximité les uns des autres des images de la pile z suivant les sections d’image 3D.<ol>
<li>Pour extraire des axones ORN uniques de quelques axones dans la même image, ouvrez la série de sections d’images, cliquez sur Plugins | | de segmentation Éditeur de segmentation [/]. Sélectionnez l’outil pinceau et masquez l’axone ORN intéressé dans la fenêtre de travail de l’éditeur de segmentation à l’aide des boutons Sélectionner « + » ou « - » sur chaque section d’image.</li>
		<li>Cliquez sur Process | Calculateur d’image [/]. Sélectionnez « Image X » dans l’image 1, « Multiplier » dans Opération, « Image X. étiquettes » dans l’image 2, [/]. Cela génère un nouveau fichier de série d’images avec l’axone intéressé uniquement. Effectuez l’étape 4.1 pour traiter l’image de la pile z. Répétez cette étape pour tous les points temporels afin de générer un fichier image de série chronologique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour pseudocolorer différents axones à partir de la même image, effectuez d’abord l’étape 4.3 pour générer le fichier image de série chronologique de chaque axone séparément. Ouvrez les fichiers image de série chronologique pour différents axones uniques à partir de la même image de données brutes. Cliquez sur image | | de couleur Fusionner les canaux. Sélectionnez différents fichiers image de séries chronologiques dans différentes couches de couleur et cliquez sur OK.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’explante cerveau antennes-drosophiles conserve un ciblage normal du circuit olfactif. Nous avons remarqué que le développement est 2 fois plus lent ex vivo par rapport à in vivo. Il est à noter que le système explant ne retient pas le palpe maxillaire, qui héberge six types d’ORN. Pour assurer un développement normal récapitulé ex vivo, l’étirement des nerfs antennels doit être évité pendant la dissection explant. Au cours de la culture ex vivo, la croissance des bactéries p...

Les neurones sont précisément interconnectés pour former des circuits essentiels au bon fonctionnement du cerveau. Depuis plus de 100 ans, les neuroscientifiques tentent de comprendre comment les neurites s’étendent vers leurs cibles intermédiaires et finales avec une extrême précision. En conséquence, ils ont identifié des gènes importants qui codent des signaux de guidage pour le développement de processus neuronaux1. Le système olfactif de la drosophile fournit un excellent modèle pour étudier ce processus puisque les neurones récepteurs olfactifs (ORN, les neurones sensoriels primaires) projettent à 50 glomérules identifiables avec une taille, une forme et une position relative stéréotypées, où ils forment des connexions synaptiques avec des dendrites à partir de 50 types de neurones de projection (NP) de second ordre, chacun envoyant des dendrites à l’un des 50 glomérules2 (Figure 1A ). Par conséquent, il est relativement facile d’identifier des phénotypes mutants à résolution synaptique (glomérulaire) dans le système olfactif de la mouche. Cela a conduit à la découverte de gènes importants qui régulent l’assemblage du circuitolfactif 3.
L’assemblage du circuit olfactif de la mouche repose sur des processus de développement coordonnés temporellement et spatialement3. Les ORN et les NP acquièrent des destins cellulaires distincts, ce qui met en place le programme pour leurs spécificités de câblage. Ensuite, les dendrites PN prémodèlent le lobe de l’antenne (Figure 1B). Les axones des ORN font ensuite le tour du lobe de l’antenne ipsilatérale et traversent la ligne médiane du cerveau pour atteindre le lobe de l’antenne controlatérale. Par la suite, les axones ORN envahissent les lobes antennes ipsi- et controlatéral et forment des synapses avec des dendrites de leurs PN partenaires dans des glomérules spécifiques. Ce modèle grossier pour l’assemblage de circuits olfactifs a été proposé sur la base de la caractérisation d’échantillons fixes à partir de points temporels intermédiaires au cours du développement. La mauvaise résolution temporelle et l’incapacité à suivre les mêmes processus neuronaux tout au long du développement à partir de tissus fixes limitent la compréhension mécaniste du processus d’assemblage de circuits.
Il est techniquement difficile de vivre des processus ORN et PN d’image in vivo, car le processus de câblage se produit dans la première moitié du stade nymphal lorsque le lobe de l’antenne est entouré d’un corps gras opaque à l’intérieur du boîtier nymphal. Il est donc impossible d’imager directement le circuit olfactif en développement à partir de pupes intactes. Les tissus disséqués cultivés ex vivo peuvent contourner l’opacité tissulaire et ont été utilisés avec succès pour étudier le développement neuronal 4,5,6. Le défi d’utiliser une stratégie de culture explant ex vivo similaire pour étudier le câblage neuronal dans le cerveau nymphal est de savoir s’il récapitule le ciblage précis des neurones dans une condition de culture. Sur la base d’une condition de culture ex vivo précédemment rapportée pour le complexe œil-cerveau de la mouche7, une explante qui contient l’ensemble du cerveau nymphal, les antennes et les nerfs antennenaires de connexion intacts a été récemment développée, qui conserve un ciblage précis du circuit olfactif et peut être soumise à une imagerie en direct basée sur la microscopie à deux photons jusqu’à 24 h à la fréquence de toutes les 20 min8 . Ici, un protocole détaillé de la culture et de l’imagerie des explants est décrit. Le système explant fournit une méthode puissante pour étudier l’assemblage du circuit olfactif et potentiellement d’autres circuits dans le cerveau central.

<table><tbody><tr><td>20-hydroxyecdysone</td><td>Sigma</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti :Sapphire laser</td><td>Cohérent</td><td>Cohérent MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Insuline humaine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Prairie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille</td><td>d’oxygène Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Élastomère de silicone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie à deux photons</td><td>Objectif immergé à eau Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

un système explant pour les études d’imagerie time-lapse de l’assemblage de circuits olfactifs chez la drosophile

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

Les neurones sont précisément interconnectés pour former des circuits essentiels au bon fonctionnement du cerveau. Le système olfactif de la drosophile fournit un excellent modèle pour étudier ce processus puisque 50 types de neurones récepteurs olfactifs (ORN) des antennes et des palpes maxillaires projettent leurs axones à 50 glomérules identifiables dans le lobe de l’antenne et forment des connexions synaptiques avec les dendrites de 50 types de neurones de projection de second ordre (NP). Les études précédentes se sont principalement concentrées sur l’identification de molécules importantes qui régulent le ciblage précis dans le circuit olfactif à l’aide de tissus fixes. Ici, un système d’explantation antenne-cerveau qui récapitule les étapes clés du développement de l’assemblage du circuit olfactif en culture est décrit. En disséquant la cuticule externe et en nettoyant les corps gras opaques recouvrant le cerveau nymphal en développement, des images de haute qualité de neurones uniques provenant de cerveaux vivants peuvent être collectées à l’aide de la microscopie à deux photons. Cela permet l’imagerie en accéléré d’un seul axone ORN ciblant à partir de tissus vivants. Cette approche aidera à révéler les contextes biologiques cellulaires importants et les fonctions importantes de gènes importants précédemment identifiés et à identifier les mécanismes qui sous-tendent le processus dynamique d’assemblage de circuits.

Les axones ORN arrivent au lobe de l’antenne entre 18 h et 36 h APF. Ils naviguent ensuite dans le lobe de l’antenne, traversent la ligne médiane et innervent les glomérules. La vidéo 1 est une vidéo représentative montrant l’ensemble du processus pour plusieurs axones identifiables individuellement, prise à la fréquence de toutes les 20 minutes pendant 24 h. Avant l’enregistrement à l’aide de TurboReg, les axones présentent une certaine dérive latérale à mesure que le cerveau se développe (première moit...

Ce protocole décrit la procédure de dissection, l’état de culture et l’imagerie en direct d’un système d’explantation antenne-cerveau pour l’étude de l’assemblage du circuit olfactif.

Un système Explant pour les études d’imagerie time-lapse de l’assemblage de circuits olfactifs chez la drosophile

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

Ce protocole présente une méthode pour imager en direct, voler l’assemblage de circuits olfactifs au niveau d’un seul axone à partir d’un cerveau en développement. dissection pour nettoyer le tissu recouvrant le cerveau en développement, nous pouvons collecter des images de haute qualité du cerveau interne. Cette méthode fournit des informations précieuses sur la base biologique cellulaire du développement de circuits.Il peut être facilement modifié pour étudier le développement d’autres circuits. Il faut un certain temps pour qu’une personne effectue un contrôle stable de la main en microdissection. Plus de pratique sera utile.Pour commencer, préparez le plat de culture pour mobiliser l’explante pendant l’imagerie en accéléré en posant un Sylgard de 0,5 centimètre d’épaisseur sur la surface inférieure d’une boîte de Pétri et en le laissant durcir pendant 48 heures à température ambiante. Pour préparer les micro-broches à l’immobilisation de l’explante sur cette plaque à l’aide de pinces, collez plusieurs micro-broches sur un ruban avec les extrémités tranchantes alignées d’un côté et coupez deux millimètres d’extrémités tranchantes avec des ciseaux. Ensuite, à l’aide des pinces, insérez les micro-broches coupées dans la couche Sylgard d’une plaque Sylgard préfabriquée.À l’aide d’une brosse, collectez les nymphes blanches, qui forment du puparium en une heure et transférez-les dans un nouveau flacon. Incuber les nymphes dans le bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes pour induire des clones ORN clairsemés de types aléatoires. Après un choc thermique, placez le flacon à 25 degrés Celsius pendant 30 heures, ce qui donne des nymphes âgées de 30 heures après la formation du puparium.Ensuite, préparez le support de culture pour l’explantation comme décrit dans le manuscrit du texte et stockez à quatre degrés Celsius. Le jour de l’imagerie, ajouter le sérum fœtal bovin, la solution mère d’insuline humaine et la solution mère de 20 hydroxyecdysone se dissolvent dans l’éthanol dans un flacon de 50 millilitres contenant 45 millilitres de milieu drosophila de Schneider. Mélangez bien et transférez 15 millilitres du milieu complet dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et conservez le reste du milieu complet à quatre degrés Celsius pendant une semaine.Ensuite, couvrez l’ouverture des tubes contenant un milieu plein avec un film de paraffine et oxygénez le milieu en pompant des bulles d’oxygène sous la surface du liquide à travers une pointe de pipette stérile de cinq millilitres à raison d’une bulle par seconde pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, stérilisez la surface du puits de dissection et la plaque Sylgard préalablement préparée avec 70% d’éthanol et laissez-les sécher avant utilisation. Utilisez une brosse pour transférer 30 heures de pupe APF sur un papier de soie pour sécher la surface externe de la nymphe pendant cinq minutes.Après avoir appliqué du ruban adhésif double face sur une lame de verre, fixez soigneusement la nymphe séchée à la surface collante du ruban adhésif avec la face dorsale vers le haut. Appuyez doucement sur la nymphe avec une brosse pour attacher correctement la face ventrale au ruban adhésif sans endommager la nymphe. Insérez une pointe pointue de la pince entre le boîtier de la nymphe brune et la nymphe du côté latéral et cassez soigneusement l’étui de la nymphe brune à travers une ligne jusqu’à l’extrémité postérieure de la nymphe.Une fois le boîtier de nymphe brune ouvert, à l’aide de la pince, tenez doucement la nymphe et transférez-la dans le puits de dissection contenant un millilitre de milieu plein oxygéné. Immergez la nymphe dans le milieu pour l’enfoncer au fond du puits. Pour disséquer l’explantation cérébrale de l’antenne de la nymphe, tenez doucement la nymphe à l’aide d’une pince d’une main et à l’aide d’une paire de microcisseurs, créez un petit trou du côté postérieur de la nymphe, qui libère une pression élevée à l’intérieur de la nymphe.En partant du trou, coupez à travers la ligne médiane ventrale jusqu’au cou, puis coupez à travers la circonférence du cou pour détacher la tête du corps de la nymphe et placer le corps dans un puits différent. Ensuite, coupez la cuticule transparente recouvrant la face dorsale du cerveau pour exposer le corps gras sur le dessus du cerveau, en veillant à garder la cuticule à laquelle la rétine et l’antenne se fixent et de même, coupez la cuticule du côté ventral du cerveau. Pipettez le milieu vers les régions ouvertes sur les côtés dorsal et ventral de la tête à l’aide d’une pipette P10 pour laver doucement le corps gras recouvrant le cerveau et l’antenne.Pour étudier l’interaction des axones ORN bilatéraux ou des axones ORN avec le ciblage de la dendrite PN, coupez le nerf antenne pendant la scène en plaçant soigneusement les lames des microscisseurs entre la cuticule et le cerveau et coupez le nerf antenne intéressé. Pour transférer l’explante disséquée sur la plaque de Sylgard, placez environ 200 gouttelettes de microlitres du milieu complet oxygéné sur la surface de Sylgard. Pipettez le corps gras dérivé du tronc disséqué plusieurs fois à travers une pointe de pipette de 200 microlitres pour recouvrir la surface interne afin d’empêcher les explants de coller à la pointe de la pipette pendant le transfert du puits de dissection à la gouttelette moyenne sur la plaque Sylgard.Utilisez les pinces pour épingler l’explantation sur la couche de Sylgard dans les deux lobes optiques, puis positionnez soigneusement la plaque de Sylgard sur la station d’imagerie, immobilisez la plaque avec des rubans et ajoutez lentement 10 millilitres du milieu complet oxygéné à la plaque de Sylgard à l’aide d’une pipette P1000. Les axones ORN arrivent au lobe de l’antenne entre 18 heures et 36 heures APF puis naviguent dans le lobe de l’antenne, traversent la ligne médiane et innovent les glomérules. Avant l’enregistrement, les axones présentaient une certaine dérive latérale au fur et à mesure que le cerveau se développait, et après l’enregistrement, la dérive était corrigée.Les identités glomérulaires des axones ORN extraits ont été révélées par immunocoloration d’un marqueur de neuropil et de la cadhérine. En comparant à la carte du lobe interne, l’identité de chaque glomérule a pu être déterminée. Au cours de la culture ex vivo, la croissance des bactéries provoque généralement un développement reposé du circuit olfactif.Par conséquent, il est important de bien stériliser le plat culturel et les épingles avant l’imagerie et de garder la salle d’imagerie propre et isolée. Pour obtenir une résolution temporelle spatiale plus élevée, ce système d’explant peut être imagé à l’aide d’un microscope plus avancé, le microscope optique à réseau adaptatif. Bien qu’un développement de circuit d’usine ait été montré ici à titre d’exemple, ce système peut potentiellement être étendu à l’étude d’autres circuits et processus de développement dans le cerveau central en développement.

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