Name: Imagerie vasculaire profonde dans l’œil avec ultrasons améliorés par flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez l'imagerie vasculaire oculaire profonde en 3D par ultrasons améliorés par flux, une méthode non invasive sans agent de contraste. Cette technique permet de visualiser les structures rétiniennes pigmentées chez les vertébrés à érythrocytes nucléés comme le poisson rouge.

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Ce travail a reçu un financement de la Fondation Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), la Fondation Lundbeck (R324-2019-1470; R346-2020-1210), les Fondations Velux (00022458), la Fondation A.P. Møller pour l’avancement des sciences médicales, le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie (n° 754513) et la Fondation pour la recherche de l’Université d’Aarhus.

Le protocole ci-dessous a été réalisé avec l’autorisation de l’Inspection danoise de l’expérimentation animale au sein du ministère danois de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche, administration vétérinaire et alimentaire danoise (numéro de permis 2016-15-0201-00835).
1. Anesthésie et milieu échographique
<ol><li>Anesthésier l’animal de recherche. REMARQUE: Le type et la dose d’anesthésie appropriée dépendent fortement de l’espèce. En général, les anesthésiques à base d’immersion tels que le MS-222 (acide 3-aminobenzoate d’éthyle méthanesulfonique), la benzocaïne (4-aminobenzoate d’éthyle) et le propofol (2,6-diisopropylphénol) sont utiles chez les poissons et les amphibiens qui absorbent facilement l’anesthésique sur les branchies ou la peau (par exemple, 0,05 mg· L-1 benzocaïne dans la truite arc-en-ciel). Une gamme de composés dissous qui peuvent être administrés par voie intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale est disponible pour les amniotes, tout comme les anesthésiques à base de gaz. Alfaxalon administré par voie intramusculaire est utile chez les reptiles (p. ex., 30 mg·kg-1 chez les lézards), et l’isoflurane administré sous forme de gaz est utile chez les oiseaux (p. ex., 2 % dans l’air pour les pigeons). Reportez-vous à la littérature publiée30,31,32 pour un aperçu complet des anesthésiques disponibles pour toutes les espèces.</li>
	<li>Testez les réflexes chez l’animal pour confirmer un niveau optimal d’anesthésie. Assurez-vous que l’animal est complètement immobile pendant la procédure, car la procédure d’échographie améliorée par le flux est sensible au bruit de mouvement.<ol>
<li>Une anesthésie trop profonde peut modifier les schémas de circulation sanguine, alors effectuez une titration de dose dans la phase de démarrage d’une expérience.</li>
		<li>Augmentez la dose d’anesthésie par étapes et observez le flux sanguin dans l’œil aidé par une échographie en mode de luminosité simple (mode B). REMARQUE: Un niveau optimal d’anesthésie est obtenu lorsque l’animal est immobile (sauf la respiration) avec un flux sanguin oculaire visible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si le type ou la dose d’anesthésique n’est pas permissif pour les mouvements respiratoires, assurez-vous d’une ventilation adéquate de l’animal, par exemple en utilisant une pompe à air pour oxygéner l’eau pour les espèces aquatiques ou un ventilateur pour les espèces respirant de l’air.</li>
	<li>Positionnez l’animal dans une posture qui permet un accès direct d’en haut à l’œil. REMARQUE: Selon les espèces, cela peut être en position couchée ou latérale. Il peut être utile de construire un dispositif de maintien simple à l’aide d’un petit morceau de métal non réactif (p. ex., acier inoxydable) et d’élastiques lâches (voir la figure 1).</li>
	<li>Placez un milieu échographique approprié sur l’œil de l’animal. Si des paupières écailleuses (imperméables aux ultrasons) recouvrent l’œil, déplacez-les doucement avec un coton-tige. REMARQUE: Pour les espèces aquatiques, le meilleur milieu ultrasonique est l’eau propre du réservoir dans lequel l’animal vit habituellement. Pour les espèces terrestres, une quantité généreuse de gel à ultrasons assure des mouvements libres et l’imagerie du transducteur à ultrasons (c.-à-d. sonde linéaire) sur toute la surface de l’œil. Une pommade vétérinaire sur l’œil controlatéral est nécessaire pour les espèces terrestres.</li>
</ol>2. Acquisition d’images échographiques oculaires 2D et 3D
<ol><li>Positionner le transducteur d’échographie médial à l’œil dans une orientation dorsale/ventrale ou rostrale/caudale selon l’orientation souhaitée de l’image.</li>
	<li>En mode B, avec une profondeur de champ maximale, imagez la partie médiale et la plus profonde de l’œil et assurez-vous que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image. REMARQUE: Chez certaines espèces, le cristallin occupe une proportion relativement importante de l’humeur vitrée, qui peut absorber les ultrasons, en particulier à des fréquences plus élevées.</li>
	<li>Traduisez lentement le transducteur de chaque côté tout en inspectant les images en temps réel. Assurez-vous que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image; sinon, passez à un transducteur avec une fréquence plus basse et une plus grande profondeur de champ. REMARQUE: Les fréquences centrales suivantes permettent la profondeur de champ maximale suivante: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (voir tableau 1). Cependant, ces valeurs maximales de profondeur de champ peuvent être nettement inférieures si l’œil contient des structures calcifiées ou imperméables aux ultrasons.</li>
	<li>Ajustez la profondeur de l’image, le décalage de profondeur (distance entre le haut de l’image et la structure d’intérêt), la largeur de l’image, ainsi que le nombre et la position des zones focales pour couvrir la région d’intérêt souhaitée dans les trois dimensions spatiales (par exemple, 1 cm de profondeur de profondeur, 2 mm de décalage de profondeur, 1 cm de largeur d’image, une zone focale). REMARQUE: Bien que la dénomination spécifique des boutons qui ajustent ces paramètres puisse varier d’un système à ultrasons à l’autre, la plupart des systèmes auront des boutons avec des noms logiques pour ces ajustements. Ces paramètres d’image affectent généralement la plage de résolutions temporelles possibles de l’acquisition par ultrasons.</li>
	<li>Définissez la fréquence d’images dans la plage de 50 à 120 images·s-1. REMARQUE : La résolution temporelle (c.-à-d. l’intervalle de temps entre les balayages B successifs) doit être suffisante pour afficher une grande variabilité de l’intensité des pixels dans les vaisseaux sanguins imagés, c’est-à-dire que la résolution temporelle ne doit pas être trop élevée. D’autre part, pour compléter un enregistrement 3D complet de l’œil dans un délai raisonnable, la résolution temporelle ne peut pas être trop faible. Une résolution temporelle allant de 50 à 120 images·s-1 est généralement adéquate pour la procédure d’amélioration de l’écoulement chez la plupart des espèces. Sur certains systèmes à ultrasons, cette résolution temporelle souhaitée peut être obtenue en basculant entre les modes « imagerie générale » (haute résolution spatiale / basse résolution temporelle) et « cardiologie » (basse résolution spatiale / haute résolution temporelle).</li>
	<li>Ajustez le gain 2D à un niveau (~ 5 dB), de sorte que les structures anatomiques ne soient que juste visibles dans l’acquisition en mode B pour augmenter le rapport signal/bruit dans la reconstruction ultérieure améliorée par le flux.</li>
	<li>Pour acquérir une image 2D améliorée par flux à une position de tranche unique, traduisez le transducteur à cette position et passez à l’étape 3.1.</li>
	<li>Pour acquérir un enregistrement 3D d’une région entière d’intérêt, par exemple la rétine, traduisez le transducteur à un extrême de la région d’intérêt.<ol>
<li>Pour déterminer la position exacte de l’extrémité de la région d’intérêt, augmentez brièvement le gain 2D.</li>
		<li>Une fois le placement correct du transducteur terminé, réduisez le gain 2D avant l’enregistrement pour assurer un rapport signal/bruit maximal lors de la reconstruction ultérieure améliorée du débit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour chaque étape (tranche) de l’enregistrement 3D, acquérez ≥ 100 images (≥1000 images de manière optimale).</li>
	<li>À l’aide d’un micromanipulateur ou d’un moteur de transducteur intégré, traduisez le transducteur dans toute la région d’intérêt par étapes, par exemple 25 μm ou 50 μm (n’oubliez pas de noter la taille du pas) et répétez l’acquisition de ≥100 images pour chaque étape.</li>
	<li>Euthanasier l’animal de recherche selon les directives de soins aux animaux de l’institution.</li>
</ol>3. Reconstruction d’image améliorée par flux
<ol><li>Exportez les enregistrements au format de fichier DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) (little-endian).</li>
	<li>Pour produire une image à flux unique améliorée basée sur un enregistrement ciné de ≥100 images (T), calculez l’écart-type au niveau des pixels (STD(x,y)) à l’aide de la formule suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62986/62986eq01.jpg"> Où It(x,y) est l’intensité du pixel à la coordonnée du pixel (x,y) au temps t, et Īt(x,y) est la valeur moyenne arithmétique de I au fil du temps.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.2 pour chaque tranche de l’enregistrement 3D.</li>
	<li>Pour automatiser le processus de calcul STD et de reconstruction d’image pour plusieurs tranches dans un enregistrement 3D, effectuez cette opération en mode batch en utilisant, par exemple, ImageJ et le script de macro supplémentaire (fichier supplémentaire 1).</li>
	<li>Combinez toutes les tranches reconstruites en une seule pile d’images (commande Images to Stack dans ImageJ).</li>
	<li>Spécifiez l’épaisseur de la tranche à partir de la taille d’étape utilisée lors de l’acquisition (commande Propriétés dans ImageJ).</li>
	<li>Enregistrez la pile d’images en tant que fichier TIF 3D. REMARQUE: Des enregistrements tridimensionnels pondérés en fonction du débit des vaisseaux sanguins oculaires peuvent ensuite être utilisés pour créer des rendus de volume et construire des modèles anatomiques numériques et physiques des structures vasculaires de l’œil. Ces options de traitement d’image ne relèvent pas du champ d’application de ce protocole ; reportez-vous aux articles publiés précédemment pour plus de détails33,34,35.</li>
</ol>

<ol><li>Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+the+vertebrate+retina+from+the+Cambrian+to+the+Tertiary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary.</a> Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).</li>
<li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).</li>
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<li>Buttery, R. G., Hinrichsen, C. F. L., Weller, W. L., Haight, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+thick+should+a+retina+be%3F+A+comparative+study+of+mammalian+species+with+and+without+intraretinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">How thick should a retina be? A comparative study of mammalian species with and without intraretinal vasculature.</a> Vision Research. 31 (2), 169-187 (1991).</li>
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<li>Damsgaard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+evolution+of+oxygen+secreting+mechanism+in+the+fisheye%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840(2021).</li>
<li>Damsgaard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+acidification+mechanism+for+greatly+enhanced+oxygen+supply+to+the+fish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+rete+mirabile+of+the+fish+eye.+II.+Distribution+and+relation+to+the+pseudobranch+and+to+the+swimbladder+rete+mirabile%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile.</a> Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).</li>
<li>Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+rete+mirabile+of+the+fish+eye.+I.+Oxygen+secretion+and+structure%3A+comparison+with+the+swimbladder+rete+mirabile%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile.</a> Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).</li>
<li>Berenbrink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+reconstructions+of+evolving+physiological+complexity%3A+O2+secretion+in+the+eye+and+swimbladder+of+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes.</a> Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).</li>
<li>Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+oxygen+secretion+in+fishes+and+the+emergence+of+a+complex+physiological+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system.</a> Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).</li>
<li>Keane, P. A., Sadda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+imaging+in+the+twenty-first+century%3A+State+of+the+art+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions.</a> Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).</li>
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<li>Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+size%2C+cell+size%2C+and+the+evolution+of+enucleated+erythrocytes+in+attenuate+salamanders%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology%22%5BJournal%5D)">Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders.</a> Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).</li>
<li>Greis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+microvascular+blood+flow+by+contrast-enhanced+ultrasound+%28CEUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).</li>
<li>Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast-enhanced+plane-wave+ultrasound+imaging+of+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye.</a> Experimental Eye Research. 193, 107986(2020).</li>
<li>Walls, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+GL+%22The+vertebrate+eye+and+its+adaptive+radiation%22">The vertebrate eye and its adaptive radiation</a>. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’existe aucun intérêt complet.

L’imagerie vasculaire utilisant l’échographie améliorée par flux fournit une nouvelle méthode d’imagerie non invasive de la vascularisation de l’œil qui offre plusieurs avantages par rapport aux techniques actuelles, mais qui a ses limites intrinsèques. Le principal avantage de l’échographie à flux amélioré est la capacité de générer des angiographies oculaires avec une profondeur de champ qui dépasse l’épithélium pigmentaire rétinien, ce qui limite la profondeur de champ dans les techniques optiques. En imagerie par ult...

Le métabolisme élevé de la rétine des vertébrés impose un compromis intrinsèque entre deux besoins opposés; des débits sanguins élevés et un chemin de lumière dépourvu de vaisseaux sanguins. Pour éviter les troubles visuels de la perfusion des globules rouges, la rétine de tous les vertébrés reçoit de l’oxygène et des nutriments via une feuille de capillaires derrière les photorécepteurs, les choriocapillaires1,2,3. Cependant, cette source unique de nutriments et d’oxygène impose une limitation de diffusion à l’épaisseur de la rétine4,5, de sorte que de nombreuses espèces visuellement actives possèdent une variété de réseaux vasculaires élaborés pour fournir un apport sanguin supplémentaire à cet organe métaboliquement actif6. Ces lits vasculaires comprennent des vaisseaux sanguins perfusant les couches internes de la rétine chez les mammifères et certains poissons4,7,8,9,10, des vaisseaux sanguins sur la face interne (orientée vers la lumière) de la rétine que l’on trouve chez de nombreux poissons, reptiles et oiseaux4,11,12,13, et des arrangements vasculaires à contre-courant de la choroïde du poisson, la choroïde rete mirabile, qui permet la génération de pressions partielles d’oxygène super-atmosphérique14,15,16,17,18,19,20. Bien que ces voies non choroïdiennes supplémentaires pour l’apport en nutriments rétiniens jouent un rôle essentiel dans l’alimentation des besoins métaboliques d’une vision supérieure4, l’anatomie tridimensionnelle de ces structures vasculaires est mal comprise, ce qui limite notre compréhension de l’évolution morphologique de l’œil des vertébrés.
Traditionnellement, l’approvisionnement en sang rétinien a été étudié à l’aide de techniques optiques, telles que l’ophtalmoscopie du fond d’œil. Cette catégorie de techniques fournit des informations non destructives à haut débit sur l’anatomie des vaisseaux sanguins non choroïdiens en haute résolution21 et est donc facilement utilisée dans le diagnostic clinique des anomalies de la structure des vaisseaux rétiniens22. Cependant, l’épithélium pigmentaire rétinien absorbe la lumière transmise et limite la profondeur de vue dans ces techniques optiques, fournissant des informations réduites sur la structure et la fonction choroïdiennes sans l’utilisation d’agent de contraste21. Des limites de profondeur similaires sont rencontrées dans la tomographie par cohérence optique (OCT). Cette technique peut générer des angiographies de fond d’œil à haute résolution en utilisant des ondes lumineuses au détriment technique de la pénétration en profondeur23, tandis que l’OCT d’imagerie en profondeur améliorée peut visualiser la choroïde au détriment de la qualité de l’imagerie rétinienne24. L’imagerie par résonance magnétique surmonte les limites optiques de l’ophtalmoscopie et de l’OCT et peut cartographier les couches vasculaires de la rétine, bien qu’à faible résolution25. L’histologie et la microtartographie (μCT) maintiennent la haute résolution des techniques optiques et fournissent des informations sur la morphologie vasculaire de l’œil entier4, mais les deux techniques nécessitent un prélèvement oculaire et ne sont donc pas possibles en clinique ou chez les espèces rares ou menacées. Pour surmonter certaines des limites de ces techniques d’imagerie rétinienne établies, l’étude présente ici un protocole d’échographie sur des animaux anesthésiés, où le mouvement du sang est cartographié in silico sur une série d’échographies bidimensionnelles également espacées couvrant un œil entier en appliquant une technique comparable à celle décrite précédemment pour l’imagerie embryonnaire et cardiovasculaire26,27, 28 et en angiographie octodique29. Cette approche permet de générer des angiographies oculaires profondes tridimensionnelles non invasives sans utiliser d’agent de contraste et ouvre de nouvelles voies pour cartographier la distribution du flux sanguin dans l’œil entre les espèces.

<table><tbody><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaïne</td><td>Sigma</td><td>E-1501</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>B Braun</td><td> 12260470_0320</td><td></td></tr><tr><td>Alfaxalon</td><td>Jurox</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>50019100</td><td></td></tr><tr><td>Échographe</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie vasculaire profonde dans l’œil avec ultrasons améliorés par flux

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

La rétine dans l’œil est l’un des tissus les plus énergivores du corps et nécessite donc des taux élevés d’apport d’oxygène à partir d’un apport sanguin riche. La lame capillaire de la choroïde tapisse la surface externe de la rétine et est la source dominante d’oxygène dans la plupart des rétines vertébrées. Cependant, ce lit vasculaire est difficile à imager avec les techniques optiques traditionnelles en raison de sa position derrière la rétine très absorbant la lumière. Nous décrivons ici une technique d’échographie à haute fréquence avec une amélioration ultérieure du débit pour imager les lits vasculaires profonds (0,5-3 cm) de l’œil avec une résolution spatio-temporelle élevée. Cette méthode non invasive fonctionne bien chez les espèces avec des globules rouges nucléés (modèles animaux non mammifères et fœtaux). Il permet la génération d’angiographies tridimensionnelles non invasives sans l’utilisation d’agents de contraste, et il est indépendant des angles de flux sanguin avec une sensibilité plus élevée que les techniques d’imagerie par ultrasons basées sur Doppler.

La technique d’échographie améliorée par écoulement pour imager les lits vasculaires de l’œil peut être appliquée à diverses espèces et a actuellement été utilisée chez 46 espèces de vertébrés différentes (figure 1, tableau 1). La présence de globules rouges nucléés chez les vertébrés de mammifères non adultes offre un contraste positif entre le sang qui coule et les tissus statiques dans les enregistrements cinétiques (dossier supplémentaire 2). Cependant, ...

Nous présentons une technique d’échographie non invasive pour générer des angiographies tridimensionnelles dans l’œil sans utiliser d’agents de contraste.

Imagerie vasculaire profonde dans l’œil avec ultrasons améliorés par flux

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

La technique Flow-Enhanced Ultrasound nous permet d’imager la vascularisation de l’œil en trois dimensions, sans utiliser d’agents de contraste. Le principal avantage de cette technique est sa stabilité pour imager le vesture, derrière la rétine pigmentée, ce qui est difficile avec plusieurs techniques d’imagerie optique. Nous démontrons cette technique chez les poissons rouges, mais elle peut être appliquée à toutes les espèces avec des globules rouges nucléés, ce qui permet aux chercheurs de mieux comprendre l’évolution fonctionnelle des yeux.Cette technique peut être appliquée par des chercheurs ayant une formation de base en imagerie échographique et en manipulation d’animaux. Après avoir confirmé un niveau optimal d’anesthésie, positionnez l’animal dans une posture qui permet un accès direct d’en haut, à l’œil. Placez un milieu échographique approprié sur l’œil de l’animal.Si des paupières écailleuses couvrent l’œil, déplacez-les doucement avec un coton-tige. Pour les animaux aquatiques, l’eau fonctionne bien comme milieu ultrasonore, Ensuite, positionnez le transducteur à ultrasons, médial à l’œil, dans une orientation caudale dorsale ventrale ou rostrale, en fonction de l’orientation souhaitée de l’image. En mode B, avec une profondeur de champ maximale, imagez la partie médiale et la plus profonde de l’œil, pour vous assurer que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image.Traduisez lentement le transducteur de chaque côté, tout en inspectant les images en temps réel. Assurez-vous que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image. Si ce n’est pas le cas, passez à un transducteur avec une fréquence plus basse et une plus grande profondeur de champ.Ajustez la profondeur de l’image, le décalage de profondeur, la largeur de l’image et le nombre de zones focales pour couvrir la région d’intérêt souhaitée dans les trois dimensions spatiales. Ensuite, définissez la fréquence d’images dans la plage de 50 à 120 images par seconde. Ensuite, ajustez le gain 2D à un niveau, de sorte que les structures anatomiques ne soient que juste visibles dans l’acquisition du mode B pour augmenter le rapport signal / bruit dans la reconstruction ultérieure améliorée par le flux.Pour acquérir une image 2D à flux amélioré à une position de tranche unique, traduisez le transducteur à cette position et procédez à la reconstruction d’image améliorée par flux. Pour acquérir un enregistrement 3D d’une région entière d’intérêt, traduisez le transducteur à un extrême de la région d’intérêt. Pour déterminer la position exacte de l’extrémité extrême, augmentez brièvement le gain 2D.Une fois le transducteur placé correctement, abaissez le gain 2D avant l’enregistrement, afin d’assurer un rapport signal/bruit maximal lors de la reconstruction ultérieure améliorée du débit. Pour chaque étape ou tranche de l’enregistrement 3D, acquérez plus de 100 images. Ensuite, à l’aide d’un micro-manipulateur ou d’un moteur de transducteur intégré, traduisez le transducteur dans toute la région d’intérêt, par pas de 25 ou 50 micromètres, et répétez l’acquisition de plus de 100 images pour chaque étape.Pour une construction d’imagerie améliorée par flux, exportez les enregistrements au format de fichier DICOM. Pour produire une image à flux unique améliorée basée sur un enregistrement de scène supérieur à 100 images, calculez l’écart type au niveau d’un pixel à l’aide de cette formule et répétez le calcul pour chaque tranche de l’enregistrement 3D. Pour automatiser le calcul de l’écart type et le processus de reconstruction d’image pour plusieurs tranches dans un enregistrement 3D, effectuez cette opération en mode batch à l’aide d’ImageJ et du script macro fourni dans le manuscrit de texte.Combinez toutes les images reconstruites en une seule pile d’images à l’aide de la commande Images to Stack dans ImageJ. Ensuite, à l’aide de la commande Propriétés, spécifie l’épaisseur de la tranche à partir de la taille d’étape utilisée lors de l’acquisition et enregistre la pile d’images en tant que fichier TIFF 3D. La présence de globules rouges nucléés chez les vertébrés de mammifères adultes non ad fournit un contraste positif du sang qui coule, par rapport aux tissus statiques dans les enregistrements de scène.Cependant, lorsqu’on analyse maintenant image par image, la distinction claire entre le sang et les tissus environnants est moins évidente. Cette procédure d’amélioration du flux sanguin, essentiellement, compile un enregistrement ponctuel multi-temps dans l’espace 2D, en une seule image, où dans la valeur inhérente du signal, la fluctuation en pixels, positionnés dans le sang qui coule, marque un écart-type plus élevé que le tissu statique environnant, produisant un contraste positif. Dans les acquisitions 3D, plusieurs tranches parallèles avec un espacement connu peuvent être combinées en données d’image 3D.Il peut être utilisé pour le rendu de volume tridimensionnel et la modélisation anatomique. L’imagerie échographique basée sur Doppler offre également la possibilité d’imager spécifiquement le flux sanguin, cependant, avec moins de sensibilité que cette méthode. Cette procédure d’échographie améliorée par le flux sanguin permet l’imagerie du flux sanguin dans une gamme d’espèces avec des globules rouges nucléés.Les lits vasculaires oculaires profonds, tels que la choroïde rete mirabile chez certains poissons, peuvent être imagés s’ils sont présents dans l’espèce. La méthode est limitée par l’absence de globules rouges nucléés chez les mammifères, dans laquelle la procédure d’amélioration du flux produit un certain degré de contraste du flux sanguin, mais pas aussi distinct que chez les espèces avec des globules rouges nucléés. Les ultrasons à flux amélioré sont sensibles au bruit de mouvement.Les mouvements respiratoires peuvent causer un flou de l’image et des artefacts, tels que l’amélioration de la bordure tissulaire. La grille prospective ou rétrospective peut être utilisée pour ajuster le bruit de mouvement. Pour les acquisitions 2D et 3D, il est crucial de limiter les artefacts de mouvement causés par le déplacement de l’animal, en raison d’une anesthésie inadéquate sur un transducteur instable.Le développement de cette technique a ouvert la voie à l’examen in vivo non invasif des réseaux vasculaires profonds dans l’œil de la grande majorité des vertébrés, qui possèdent des érythrocytes nucléés.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

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La microscopie intravitale peut être utilisée chez les animaux pour visualiser et mesurer les diamètres vasculaires rétiniens, les vitesses de la circulation sanguine et le flux sanguin rétinien total.

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