Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens

La glande salivaire (SG) du moustique adulte est nécessaire pour la transmission de tous les agents pathogènes transmis par les moustiques à leurs hôtes humains, y compris les virus et les parasites. Cette vidéo démontre l’isolement efficace des SG des moustiques anophèles gambiens au stade larvaire (L4) et la préparation des SG L4 pour une analyse plus approfondie.

Les glandes salivaires des insectes sont nécessaires à la transmission de nombreuses maladies humaines. Donc, une meilleure compréhension de la biologie des glandes salariales devrait nous aider, ajouter aux stratégies existantes de prévention des maladies. Cette technique nous permettra, de nous demander rapidement si des mutations dans les régulateurs candidats, affectent la morphologie, des glandes salivaires larvaires des moustiques, et affectent potentiellement la transmission, des parasites du paludisme.

Les premières fois que vous travaillez avec les larves de moustiques, elles sont difficiles à saisir car elles se déplacent rapidement. Plus vous pratiquez, mieux vous vous portez. Pour commencer la procédure, Marisol Luchetti, assistante de recherche de premier cycle pour mon laboratoire.

Pour commencer l’expérience, placez une plaque de pot sur la scène d’un microscope à dissection et transférez 10 larves de moustiques L4 sur la plaque de pot. Placez ensuite une goutte de la solution de dissection sur la plaque de pot séparée des larves. Utilisez des pinces pour placer une larve de L4 dans la goutte de solution de dissection de 25% d’éthanol.

En tenant un nombre cinq pinces dans chaque main, saisissez les larves avec une pince juste en dessous de la tête, avec la main dominante, et saisissez la tête de la larve avec la main non dominante, puis tirez doucement la tête avec une force constante minimale, pour se détacher du reste du corps, tandis que les glandes restent attachées à la tête. Après avoir jeté la partie corporelle de la carcasse de la larve, collectez la tête ou les glandes salivaires dans un millilitre de PBS, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, et attendez que les glandes salivaires coulent au fond du tampon. Le lendemain, égouttez la solution pour fixer les tissus, avec un millilitre d’acétone froide à 100% pendant 90 secondes.

Après avoir retiré l’acétone, rincez doucement les tissus trois fois, avec un millilitre de PBS. Pour l’immunocoloration, ajouter un anticorps primaire tel que Rab 11, à la dilution appropriée, dans 200 microlitres du volume total de PBS. Faites tourbillonner doucement le contenu du tube avec une pointe de pipette.

Incuber les anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés, puis les laver trois fois dans un millilitre de PBS. Ajoutez ensuite l’anticorps secondaire, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, à la dilution appropriée, dans 200 microlitres de volume total. Après avoir mélangé le contenu avec une pointe de pipette, incuber les tissus avec des colorants, tels que le rouge du Nil, et Hoechst dans 200 microlitres de PBS, à température ambiante pendant 60 minutes, puis laver trois fois avec DU PBS.

Préparez une lame de microscope en ajoutant 200 microlitres de glycérol à 100% avec une pipette et en transférant jusqu’à 20 têtes tachées, avec les glandes attachées et les structures internes, par lame de microscope à l’aide d’une brosse douce. Étalez les échantillons de tête pour les répartir uniformément le long de la lame de verre. En regardant sous un microscope disséquant, séparez la tête larvaire des glandes, à l’aide de deux paires de pinces, en tirant soigneusement les deux tissus dans des directions opposées.

Lorsque tous les échantillons sont terminés, placez doucement un couvercle de 1,5 millimètre d’épaisseur sur le dessus de la lame, en évitant la formation de bulles d’air, puis scellez la lame avec du vernis à ongles transparent. Les glandes salivaires sont relativement faciles à disséquer, à partir de larves de stade quatre. Les larves mâles et femelles peuvent être distinguées, à la fin du stade larvaire L4 par une bande rouge, le long du thorax dorsal des femelles.

La morphologie des antennes est également plus élaborée, chez les mâles que chez les larves femelles L4 comme on peut le voir, avec les flèches blanches pointant vers l’extérieur, les antennes femelles sur l’image de gauche et les antennes mâles sur la droite. Les glandes salivaires isolées des larves du stade L4 précoce, colorées avec Hoechst révèlent les lobes proximaux et distaux, séparés par une étroite constriction. La lumière de formation a été examinée, dans la glande salivaire distale immunocolorée, d’une larve L4 moyenne à tardive.

Les domaines apicals des cellules sécrétoires, entourant la lumière formatrice, présentaient une coloration rouge du Nil intense, suggérant des structures semblables à des microvillosités. La coloration Rab 11 a été observée près de la surface apicale. Il n’y a qu’une seule étape avec le temps, et c’est l’incubation de 90 secondes, des tissus dans l’acétone froide.

Ce protocole n’a été développé que récemment, mais nous nous attendons à ce qu’il soit utile à toute personne travaillant sur la glande salivaire du moustique. Nous nous attendons à l’utiliser souvent.