Name: Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Découvrez la dissection et l'immunocoloration des glandes salivaires larvaires d'Anopheles gambiae. Cette technique permet d'étudier la morphologie et la transmission des agents pathogènes par les moustiques.

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Nous tenons à remercier le Johns Hopkins Malaria Research Institute pour l’accès et l’élevage des larves d’An. gambiae.

1. Préparation des solutions et des outils
<ol><li>Préparation de la solution de dissection<ol>
<li>Pour préparer la solution disséquante, ajouter 2,5 mL d’éthanol à 100 % à 7,5 mL deH2Odistillé dans un tube en plastique de 15. Inverser le tube 3 fois pour mélanger. REMARQUE: Cette solution peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de 10x stock de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)<ol>
<li>Pour préparer 10x bouillon PBS, ajouter 17,8 g de Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g de KH2PO4,80 g de NaCl et 2 g de KCl à 800 mL d’eau désionisée. Mélanger avec une barre d’agitation sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que les solides soient complètement dissous. Réglez le volume final à 1 L avec de l’eau purifiée. REMARQUE: Cette solution peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de 1x PBS<ol>
<li>Ajouter 10 mL de 10x PBS à 90 mL deH2Odans une bouteille en verre stérile. Fermez hermétiquement le couvercle et inversez 3x pour mélanger. REMARQUE: La solution peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation du fixateur.<ol>
<li>Ajouter 600 μL de méthanol à 200 μL d’acide acétique glacial. Rendez la solution fraîche à chaque fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construction d’une plaque de mastic (un plat de culture tissulaire rempli de caoutchouc de silicone)<ol>
<li>Mélanger les composants (1:50) d’époxy (1 g) et d’eau (50 mL) et verser le mélange dans une boîte de Pétri. Attendez que les composants sèchent avant de les utiliser. REMARQUE: Une fois construite, la plaque de mastic peut être utilisée pendant des années.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissection des glandes (Figure 1A)
<ol><li>Recueillir les larves L4 à un stade avancé (~ 10 jours après l’éclosion; Graphique 2) à partir de plateaux d’alimentation à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. REMARQUE: Voir ce manuel en ligne utile pour l’élevage standard des moustiques et la culturelarvaire 13.<ol>
<li>Placez une plaque de mastic sur la scène d’un microscope à dissection et transférez les larves sur la plaque de mastic. REMARQUE: Lors de la citation de larves pour la dissection initiale, il est utile de transférer environ 10 larves sur la lame en même temps à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer une goutte de solution de dissection (1:3 EtOH:H2O) sur la plaque de mastic, séparée des 10 larves.</li>
	<li>Utilisez une pipette de transfert en plastique ou une pipette en verre jetable pour placer une larve de L4 dans la goutte d’EtOH de 25%.</li>
	<li>Prenez des pinces (#5), une dans chaque main, et avec la main non dominante, saisissez la tête de la larve. À l’aide de la main dominante, saisissez la larve avec une pince juste en dessous de la tête et tirez doucement avec une force constante minimale, de sorte que la tête se détache du reste du corps et que les glandes restent attachées à la tête. Jetez la partie du corps de la carcasse de la larve. REMARQUE: Lors de la dissection, placez une serviette en papier à proximité pour recueillir les carcasses de larves.</li>
	<li>Recueillir la tête ou les glandes dans 1 mL de 1x PBS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Utilisez 1 mL de PBS pour ~40 glandes disséquées avec leurs têtes attachées. Attendez que les têtes/SG s’enfoncent au fond de la mémoire tampon.</li>
</ol>3. Fixation pour la coloration des anticorps (Figure 1B)
<ol><li>Égouttez le PBS à partir du haut du tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette de transfert en verre, en évitant les mouchoirs collants et en retirant autant de solution de PBS que possible sans endommager les tissus. Remplacer la solution par 800 μL d’un mélange 3:1 de méthanol en acide acétique glacial. Placez le tube à 4 °C pendant la nuit (12-24 h recommandé; 19 h de préférence).</li>
	<li>Le lendemain, égoutter la solution et la remplacer par 1 mL d’acétone froide à 100 %. Laisser pour 90 s.</li>
	<li>Retirez l’acétone et rincez doucement les tissus trois fois avec 1 mL de 1x PBS à chaque fois. REMARQUE: Les échantillons doivent flotter lentement vers le haut avec le flux, puis retomber au fond du tube au moment où chaque ajout de PBS est terminé.</li>
</ol>4. Immunocoloration (Figure 1B)
<ol><li>Ajouter l’anticorps primaire (p. ex. Rab11) à la dilution appropriée (1:100) dans 200 μL du volume total de 1x PBS. Faites tourbillonner doucement le contenu du tube avec une pointe de pipette. Incuber toute la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Retirer la solution d’anticorps primaire et laver trois fois avec 1 mL de 1x PBS (en pipetant doucement la solution à l’intérieur et à l’extérieur de la pipette).</li>
	<li>Ajouter l’anticorps secondaire (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) à la dilution appropriée (1:200) dans 200 μL de volume total. Faites tourbillonner doucement le contenu du tube avec une pointe de pipette. Incuber à température ambiante pendant 90 min.</li>
	<li>Ajouter des colorants, tels que Nile Red (lipides, 5 μL de 1 μg/μL) et/ou Hoechst (ADN, 3 μL de 1 μg/μL), dans 200 μL de PBS à ce stade. Incuber à température ambiante pendant 60 minutes supplémentaires. Laver doucement trois fois avec 1x PBS.</li>
</ol>5. Montage de glandes colorées pour la microscopie (Figure 1C)
<ol><li>Pipette 200 μL de glycérol à 100% sur une lame de microscope. REMARQUE: Comme le glycérol est visqueux, laissez l’extrémité de la pipette dans le liquide jusqu’à ce qu’elle atteigne le volume approprié. Aucun rétrécissement tissulaire n’a été observé lors de l’entrée directe dans le glycérol à 100%. Cependant, les chercheurs peuvent passer par 30% et 50% de lavages de glycérol dans les tubes avant de déplacer les échantillons dans 100% de glycérol.</li>
	<li>Transférer les têtes tachées (jusqu’à 20 par lame) avec les glandes attachées (ainsi que d’autres structures internes) sur la lame du microscope à l’aide d’une brosse douce (Figure 3A). Étalez les échantillons de manière à ce qu’ils soient répartis uniformément le long de la lame de verre. REMARQUE: Lors du dépôt de glandes sur une glissière de couverture avec une brosse, des pinces peuvent être utilisées pour orienter doucement les SG afin qu’ils soient tous orientés dans la même direction.</li>
	<li>En regardant sous un microscope à dissection, séparez la tête larvaire des glandes à l’aide de deux paires de pinces et tirez soigneusement les deux tissus dans des directions opposées. REMARQUE: Comme il est difficile d’isoler complètement les SG, retirez simplement les têtes, laissant les SG et les structures internes associées. Même si les SG restent associés à d’autres tissus, ils sont facilement reconnaissables lorsqu’ils sont colorés avec Hoechst et d’autres marqueurs (Figure 3B, C).</li>
	<li>Retirez et jetez les têtes et répétez le processus de séparation pour chaque SG. REMARQUE: Lorsque vous retirez les têtes, placez une serviette en papier à proximité pour les collecter.</li>
	<li>Placez doucement un couvercle de 1,5 mm d’épaisseur sur le dessus (en évitant les bulles d’air) et scellez avec du vernis à ongles transparent.</li>
	<li>Conserver à 4 °C dans un récipient à l’épreuve de la lumière. REMARQUE: Les lames préparées de glandes colorées peuvent être maintenues à 4 ° C dans l’obscurité jusqu’à six mois à un an sans aucun changement notable de qualité. Si le glycérol commence à fuir au fil des mois, soulevez doucement le couvercle et pipetez plus de glycérol pour remplir les trous.</li>
</ol>

<ol><li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
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<li>Feachem, R. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+eradication+within+a+generation%3A+ambitious%2C+achievable%2C+and+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary.</a> Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553(2020).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Rostami, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+drive+technology+to+control+transmission+of+vector-borne+parasitic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections.</a> Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).</li>
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<li>Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+mosquito+salivation+in+blood+feeding+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 41 (1), 115(1981).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mosquito+saliva+in+blood+vessel+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of mosquito saliva in blood vessel location.</a> Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).</li>
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<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cellular+architecture+in+the+Asian+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Parasites & Vectors. 8, 617(2015).</li>
<li>Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+maturation+and+duct+formation+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).</li>
<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+salivary+gland+architecture+shapes+plasmodium+sporozoite+availability+for+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission.</a> mBio. 10 (4), 01238(2019).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+physiology+of+mosquitoes%22">The physiology of mosquitoes</a>. , Pergamon Press. Paris. (1963).</li>
<li>Imms, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+larval+and+pupal+stages+of+Anopheles+maculipennis%2C+meigen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen.</a> Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).</li>
<li>Favia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+of+the+genus+Asaia+stably+associate+with+Anopheles+stephensi%2C+an+Asian+malarial+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).</li>
<li>Neira Oviedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+transcriptome+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+larvae%3A+A+microarray-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrases+and+anion+transport+in+mosquito+midgut+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slc4-like+anion+transporters+of+the+larval+mosquito+alimentary+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal.</a> Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le protocole décrit ici a été adapté d’un protocole de dissection de Drosophila SG et d’un protocole de dissection de moustique adulte14,15,16. Cependant, la plupart des marqueurs n’ont pas pénétré dans la membrane basale (données non présentées) lors de l’utilisation des méthodes de dissection adulte et de coloration SG. Les adaptations du protocole adulte comprenaient la dissection des glandes dans une solution d’EtOH à 25%, l...

Le paludisme est une menace majeure pour la santé publique causant près de 230 millions d’infections et environ 409 000 décès en 20191. La majorité des décès se trouvent en Afrique subsaharienne et sont causés par le parasite Plasmodium falciparum,dont l’insecte vecteur est Anopheles gambiae,qui fait l’objet de cette démonstration vidéo. Bien que les chiffres indiquent une baisse significative du taux de mortalité annuel depuis le début du siècle (300 000 décès annuels de moins >), les baisses prometteuses des taux de mortalité observées de 2000 à 2015 s’estompent, ce qui suggère la nécessité de nouvelles approches pour limiter la transmission de la maladie2. Parmi les stratégies supplémentaires prometteuses pour contrôler et éventuellement éliminer le paludisme, il y a le ciblage de la capacité des moustiques vecteurs à l’aide de l’édition de gènes basée sur CRISPR / Cas9 et du forçagede gènes 3,4,5. En effet, c’est le ciblage du moustique vecteur (grâce à l’utilisation accrue de moustiquaires imprégnées d’insecticide de longue durée) qui a eu le plus grand impact sur la réduction de la transmission des maladies6.
Les moustiques femelles acquièrent des gamétocytes de Plasmodium d’un humain infecté lors d’un repas de sang. Après la fécondation, la maturation, la traversée de l’épithélium de l’intestin moyen, l’expansion de la population et la navigation de l’hémocèle chez leurs hôtes moustiques obligatoires, des centaines à des dizaines de milliers de sporozoïtes de Plasmodium envahissent les SG de moustiques et remplissent les cavités sécrétoires des cellules sécrétoires constitutives. Une fois à l’intérieur des cavités sécrétoires, les parasites ont un accès direct au canal salivaire et sont donc prêts à être transmis à un nouvel hôte vertébré lors du prochain repas sanguin. Parce que les SG sont essentiels à la transmission des sporozoïtes responsables du paludisme à leurs hôtes humains, et que des études de laboratoire suggèrent que les SG ne sont pas essentiels à l’alimentation sanguine, à la survie des moustiques ou à la fécondité7,8,9,ils représentent une cible idéale pour les mesures de blocage de la transmission. Les SG de moustiques adultes se forment comme une élaboration de restes de « bourgeons de canal » dans les SG larvaires qui persistent au-delà de l’histolyse SG nymphale précoce10, faisantde la SG larvaire une cible idéale pour les interventions visant à limiter la transmission de la maladie au stade adulte.
La caractérisation du stade larvaire du développement de la SG peut aider à développer non seulement une meilleure compréhension de sa morphologie et de ses adaptations fonctionnelles, mais peut également aider à évaluer de nouvelles interventions qui ciblent cet organe grâce à l’édition de gènes de régulateurs clés de la SG. Parce que toutes les études antérieures sur l’architecture des glandes salivaires larvaires sont antérieures à l’immunocoloration et aux techniques d’imagerie modernes10,11, nous avons développé un protocole pour isoler et colorer les glandes salivaires avec une variété d’anticorps et de marqueurs cellulaires12. Cette vidéo démontre cette approche de l’extraction, de la fixation et de la coloration des SG larvaires des larves d’Anopheles gambiae L4 pour l’imagerie confocale.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Na2HPO4 &bull ; 2H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Millipore Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau à poils doux</td><td>Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set</td><td>B08LH63D89</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles (22 x 50 mm)</td><td>VWR</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (DNA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique 200 proof</td><td>Millipore Sigma</td><td>EX0276</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman P200 Pipette</td><td>Gilson</td><td>P200</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td><td>Millipore Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>58221</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>1414209</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Amazon (Sally Hansen)</td><td>B08148YH9M</td><td></td></tr><tr><td>Rouge du Nil (lipide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N1142</td><td></td></tr><tr><td>Essuie-tout/lingettes</td><td>ULINE</td><td>S-7128</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de Petri (pour faire une plaque de mastic)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>Gilson</td><td>Tips E200ST</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert en plastique</td><td>Fisher Anticorps</td><td>S304671</td><td></td></tr><tr><td>primaires (p. ex., Crb, Rab11),</td> <td>études sur le développement, banque d’hybridomes (DSHB) ; Andrew Lab</td><td>Souris anti-Crb (Cq4) ou Lapin anti-Rab11</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaires avec marqueurs fluorescents (par exemple, Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Résine de silicone et agent de durcissement pour plaque de mastic</td><td>Dow Chemicals - Ximeter Silicone</td><td>PMX-200</td><td></td></tr><tr><td>Lames, dépolies à une extrémité pour l’étiquetage</td><td>VWR&nbsp ; 20 X 50 mm</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>Germe de blé Agglutinine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>W834</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Les glandes salivaires des moustiques (SG) sont un organe passerelle nécessaire à la transmission d’agents pathogènes transmis par les insectes. Les agents pathogènes, y compris les virus et les parasites Plasmodium qui causent le paludisme, s’accumulent dans les cavités sécrétoires des cellules SG. Ici, ils sont prêts à être transmis à leurs hôtes vertébrés lors d’un repas de sang ultérieur. Comme les glandes adultes se forment comme une élaboration de restes de bourgeons de canal SG larvaire qui persistent au-delà de l’histolyse SG nymphale précoce, la SG larvaire est une cible idéale pour les interventions qui limitent la transmission de la maladie. Comprendre le développement de la SG larvaire peut aider à mieux comprendre sa morphologie et ses adaptations fonctionnelles et aider à l’évaluation de nouvelles interventions qui ciblent cet organe. Ce protocole vidéo démontre une technique efficace pour isoler, fixer et colorer les SG larvaires des moustiques anophèles gambiens. Les glandes disséquées des larves dans une solution d’éthanol à 25% sont fixées dans un mélange méthanol-acide acétique glacial, suivi d’un lavage à froid à l’acétone. Après quelques rinçages dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les SG peuvent être colorés avec un large éventail de colorants marqueurs et / ou d’antisérums contre les protéines exprimées en SG. Cette méthode d’isolement de sg larvaire pourrait également être utilisée pour prélever des tissus pour l’analyse d’hybridation in situ, d’autres applications transcriptomiques et des études protéomiques.

Les glandes salivaires sont relativement faciles à disséquer de toutes les larves de stade 4. Les larves mâles et femelles peuvent être distinguées à la fin du stade larvaire L4 par une bande rouge le long du thorax dorsal des femelles mais pas des mâles (Figure 2). Nous observons également que la morphologie des antennes est beaucoup plus élaborée chez les larves mâles que chez les larves femelles L4(Figure 2),similaire aux différences observées dans cette stru...

La glande salivaire (SG) du moustique adulte est nécessaire pour la transmission de tous les agents pathogènes transmis par les moustiques à leurs hôtes humains, y compris les virus et les parasites. Cette vidéo démontre l’isolement efficace des SG des moustiques anophèles gambiens au stade larvaire (L4) et la préparation des SG L4 pour une analyse plus approfondie.

Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Les glandes salivaires des insectes sont nécessaires à la transmission de nombreuses maladies humaines. Donc, une meilleure compréhension de la biologie des glandes salariales devrait nous aider, ajouter aux stratégies existantes de prévention des maladies. Cette technique nous permettra, de nous demander rapidement si des mutations dans les régulateurs candidats, affectent la morphologie, des glandes salivaires larvaires des moustiques, et affectent potentiellement la transmission, des parasites du paludisme.Les premières fois que vous travaillez avec les larves de moustiques, elles sont difficiles à saisir car elles se déplacent rapidement. Plus vous pratiquez, mieux vous vous portez. Pour commencer la procédure, Marisol Luchetti, assistante de recherche de premier cycle pour mon laboratoire.Pour commencer l’expérience, placez une plaque de pot sur la scène d’un microscope à dissection et transférez 10 larves de moustiques L4 sur la plaque de pot. Placez ensuite une goutte de la solution de dissection sur la plaque de pot séparée des larves. Utilisez des pinces pour placer une larve de L4 dans la goutte de solution de dissection de 25% d’éthanol.En tenant un nombre cinq pinces dans chaque main, saisissez les larves avec une pince juste en dessous de la tête, avec la main dominante, et saisissez la tête de la larve avec la main non dominante, puis tirez doucement la tête avec une force constante minimale, pour se détacher du reste du corps, tandis que les glandes restent attachées à la tête. Après avoir jeté la partie corporelle de la carcasse de la larve, collectez la tête ou les glandes salivaires dans un millilitre de PBS, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, et attendez que les glandes salivaires coulent au fond du tampon. Le lendemain, égouttez la solution pour fixer les tissus, avec un millilitre d’acétone froide à 100% pendant 90 secondes.Après avoir retiré l’acétone, rincez doucement les tissus trois fois, avec un millilitre de PBS. Pour l’immunocoloration, ajouter un anticorps primaire tel que Rab 11, à la dilution appropriée, dans 200 microlitres du volume total de PBS. Faites tourbillonner doucement le contenu du tube avec une pointe de pipette.Incuber les anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés, puis les laver trois fois dans un millilitre de PBS. Ajoutez ensuite l’anticorps secondaire, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, à la dilution appropriée, dans 200 microlitres de volume total. Après avoir mélangé le contenu avec une pointe de pipette, incuber les tissus avec des colorants, tels que le rouge du Nil, et Hoechst dans 200 microlitres de PBS, à température ambiante pendant 60 minutes, puis laver trois fois avec DU PBS.Préparez une lame de microscope en ajoutant 200 microlitres de glycérol à 100% avec une pipette et en transférant jusqu’à 20 têtes tachées, avec les glandes attachées et les structures internes, par lame de microscope à l’aide d’une brosse douce. Étalez les échantillons de tête pour les répartir uniformément le long de la lame de verre. En regardant sous un microscope disséquant, séparez la tête larvaire des glandes, à l’aide de deux paires de pinces, en tirant soigneusement les deux tissus dans des directions opposées.Lorsque tous les échantillons sont terminés, placez doucement un couvercle de 1,5 millimètre d’épaisseur sur le dessus de la lame, en évitant la formation de bulles d’air, puis scellez la lame avec du vernis à ongles transparent. Les glandes salivaires sont relativement faciles à disséquer, à partir de larves de stade quatre. Les larves mâles et femelles peuvent être distinguées, à la fin du stade larvaire L4 par une bande rouge, le long du thorax dorsal des femelles.La morphologie des antennes est également plus élaborée, chez les mâles que chez les larves femelles L4 comme on peut le voir, avec les flèches blanches pointant vers l’extérieur, les antennes femelles sur l’image de gauche et les antennes mâles sur la droite. Les glandes salivaires isolées des larves du stade L4 précoce, colorées avec Hoechst révèlent les lobes proximaux et distaux, séparés par une étroite constriction. La lumière de formation a été examinée, dans la glande salivaire distale immunocolorée, d’une larve L4 moyenne à tardive.Les domaines apicals des cellules sécrétoires, entourant la lumière formatrice, présentaient une coloration rouge du Nil intense, suggérant des structures semblables à des microvillosités. La coloration Rab 11 a été observée près de la surface apicale. Il n’y a qu’une seule étape avec le temps, et c’est l’incubation de 90 secondes, des tissus dans l’acétone froide.Ce protocole n’a été développé que récemment, mais nous nous attendons à ce qu’il soit utile à toute personne travaillant sur la glande salivaire du moustique. Nous nous attendons à l’utiliser souvent.

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