Name: Évaluation de la production de glucose hépatique dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez comment quantifier la production hépatique de glucose dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques à l'aide d'un traceur isotopique stable et de la CG-SM. Cette méthode permet d'évaluer le métabolisme glucidique dans différents états métaboliques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions de formation du Département d’obstétrique et de gynécologie, Baylor College of Medicine (ALG) et une subvention de recherche R-01 (Subvention # DK114689) pour CSB, SC et JM des National Institutes of Health.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine.
1. Préparation du [6,6-2H2]glucose
<ol><li>Un jour avant la procédure, préparez le traceur de glucose isotopique stable dans une solution saline normale. Pour cette expérience, le glucose [6,6-2H2] a été utilisé comme traceur pour mesurer le taux d’apparition du glucose plasmatique. REMARQUE: Dans cette expérience, la production de glucose pendant le jeûne et les conditions riches en glucose ont été mesurées, de sorte que l’isotope du glucose a été préparé dans deux préparations différentes. Préparer les solutions de manière à ce que la dose finale d’infusion soit proche de 1 mg/(kg·min) et 2 mg/(kg·min), respectivement. Ces concentrations ont été optimisées par plusieurs études pilotes antérieures.</li>
	<li>Préparer le premier infusat avec seulement [6,6-2H2]glucose comme traceur pour représenter l’état de jeûne en dissolvant le glucose stérile et sans pyrogène [6,6-2H2]dans une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9%.</li>
	<li>Préparez le deuxième infusat en dissolvant à la fois le traceur de glucose [6,6-2H2] et le glucose non isotopique (~20 mg/kg·min) dans une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % pour simuler l’état d’alimentation. REMARQUE: Dans la présente expérience, une perfusion amorcée à débit constant de [6,6-2H2]glucose à (~) 1,08 mg / (kg · min) (condition à jeun) et (~) 1,9 mg / kg · min (condition riche en glucose) a été utilisée. Afin d’imiter la « condition riche en glucose », le débit de perfusion de D-glucose a été fixé à (~) 18,8 mg / (kg · min).</li>
	<li>Une fois les solutions préparées, filtrer stérilement les solutions avec un filtre de 0,22 μm et les conserver à 4 °C. Réchauffer les solutions à température ambiante avant la perfusion. Chargez les solutions sur des seringues prémarquées de 1 mL.</li>
	<li>Configurer la pompe pour faciliter une perfusion amorcée à débit constant du premier infusat (pour l’état basal) contenant uniquement le traceur, et programmer la pompe pour une perfusion à débit constant de l’isotope à 150 μL/h pendant 3 h.</li>
	<li>À la fin de la mise en place du jeûne de 3 heures, remplacez la première seringue infusée par la deuxième seringue infusée contenant le traceur isotopique et le D-glucose (pour l’état d’alimentation simulé), et amorcez la perfusion pour les 15 min initiaux à 600 μL / h. Réglez la pompe sur une perfusion à débit constant à 150 μL/h pendant les 3 h supplémentaires.</li>
</ol>2. Mise en place d’expériences de perfusion
<ol><li>Retirez les souris de leurs cages d’origine et placez-les dans leurs cages à jeun 3 h avant le début de l’expérience. Pour cette expérience, une souris femelle de 4 mois de la souche C57BL/6J a été utilisée. REMARQUE: Cette procédure ne nécessite aucune analgésie avant ou pendant la procédure étant donné sa nature mini-invasive.</li>
	<li>Assemblez l’équipement de mise en cage en regroupant les souris en un nombre défini de souris par pompe à insuline. Placez des cloisons sur une base plate et stable pour faire des stalles individuelles pour les souris. Il est important d’avoir accès au cathéter de la veine caudale pour que la perfusion fonctionne, alors assurez-vous qu’il y a une encoche dans le bas de la porte de la cage. REMARQUE: Les cages montrées dans la vidéo ont été fabriquées spécifiquement pour cette expérience. Les cages sont claires et en plexiglas. Il y a une base plate et stable (équipement de cage standard) sur laquelle reposent les cloisons. Cette configuration se compose de plusieurs pièces pour permettre une installation facile dans plusieurs environnements différents en fonction de la hauteur de la table et des besoins de l’expérimentateur. La porte de la cage glisse pour se fermer et a une encoche en bas pour permettre à la queue de passer à travers.</li>
	<li>Assemblez les seringues de 1 mL contenant 1 mL d’infusat basal, puis connectez-les au tube de la pompe à perfusion à l’aide du tube en polyéthylène 0,28 mm ID x 0,61 mm.</li>
	<li>Préparez la pompe à perfusion en réglant le débit à 150 μL/h, qui est le débit basal.</li>
	<li>Chauffer un bain-marie à 48 °C.</li>
	<li>Préparez la station d’insertion du cathéter adjacente au bain-marie contenant les aiguilles de 30 G de 0,5 pouce, les tubes silastiques de 0,3 mm ID x 0,64 mm et le ruban adhésif transparent de 1 pouce.</li>
	<li>Après 3 h de jeûne, commencez le processus d’insertion du cathéter, qui est détaillé ci-dessous.</li>
</ol>3. Insertion du cathéter
<ol><li>Sélectionnez une souris et placez-la dans un support sécurisé avec accès à la queue. Un exemple de ce qu’il faut utiliser est une bouteille coupée en deux avec une encoche pour la queue. Placez le support sur une base plate. Placez un morceau de ruban adhésif sur la partie proximale de la queue pour laisser de l’espace pour l’insertion du cathéter de manière plus distale. REMARQUE: Le type de ruban choisi pour cette tâche doit avoir une résistance et une adhérence modérées. Du ruban d’étiquetage polyvalent à base de papier a été utilisé dans cette expérience car il est doux et facile à décoller.</li>
	<li>Préparer le cathéter (aiguille de 30 G attachée à un tube silastique de 0,3 mm et le PE-10 ont été stérilisés au gaz) en le fixant à une seringue de 1 mL contenant une solution saline héparinisée stérile. Rincez doucement le cathéter.</li>
	<li>Amenez la souris au bain-marie et insérez la queue dans le bain-marie pendant environ 30 à 45 s. Cela aide à dilater le système vasculaire de la queue pour la mise en place du cathéter.</li>
	<li>Effectuez l’insertion du cathéter dans des conditions stériles. Une fois la queue réchauffée, nettoyez la queue avec des lingettes au benzalkonium et placez une petite pince en alligator en cuivre et édentée, qui était auparavant profilée à la forme de la queue, comme un garrot à l’extrémité proximale de la queue. Visualisez la veine latérale de la queue sous une loupe, puis insérez soigneusement le cathéter dans la veine caudale et retirez l’aiguille. Rincez doucement la solution pour assurer la perméabilité du cathéter.</li>
	<li>Enroulez un morceau de ruban adhésif transpore de 1 pouce autour du site d’insertion pour fixer le cathéter. Retirez le petit garrot de la queue.</li>
</ol>4. Configuration de la perfusion et première perfusion
<ol><li>Placez la souris dans sa cage individuelle et fermez la porte coulissante, en vous assurant que la queue dépasse à travers l’encoche et reste à l’extérieur de la cage.</li>
	<li>Placez un morceau de ruban adhésif supplémentaire sur l’ensemble du cathéter et de la queue pour le fixer à la plaque de base de la cage. Du ruban adhésif d’étiquettes coloré polyvalent a été utilisé pour cette étape.</li>
	<li>Débranchez la chasse d’eau du cathéter de la veine arrière et placez une petite pince sur le tube silastique du cathéter pour éviter le refoulement tout en connectant la conduite d’infusement de la pompe.</li>
	<li>Une fois bien connecté, retirez la pince et rincez avec la solution d’amorçage, qui consiste en l’infuseur. Assurez-vous que la solution est claire dans le tube et non tachée de sang.</li>
	<li>Notez le moment de l’initiation de la perfusion pour vous assurer qu’elle fonctionne pendant la durée totale d’environ 3 h. Si plusieurs cages sont utilisées simultanément, elles doivent être décalées pour gérer efficacement les temps de perfusion.</li>
	<li>Une fois que les lignes de perfusion sont notées pour fonctionner correctement, retirez le couvercle de la souris. Placez la literie standard autour de la souris.</li>
	<li>Commencez la perfusion avec le premier infusat contenant le traceur et faites-le fonctionner pendant 3 h en continu. Pendant toute la durée de la perfusion, continuez à vérifier le bien-être des souris ainsi que les lignes de perfusion. Assurez-vous que le tuyau de perfusion est correctement fixé et qu’il n’y a pas de fuites des points de connexion de la ligne.</li>
</ol>5. Prélèvement sanguin
<ol><li>Une fois la première perfusion terminée, arrêtez la perfusion, placez une pince sur le tube sylastique du cathéter pour éviter le reflux. Retirez doucement les souris de leur enclos sans perturber le cathéter afin de prélever du sang. Placez-les à un endroit près des cages pour une prise de sang. Pour cette expérience, les souris ont subi une ponction veineuse des joues à l’aide d’une lancette de 4 mm.</li>
	<li>Recueillir ~ 75 μL de sang dans le flacon souhaité. Pour déprotéiniser les échantillons en vue de la spectrométrie de masse, ajouter environ 15 μL de sang à 500 μL d’acétone. Le sang restant peut être utilisé pour vérifier la glycémie via le glucomètre et / ou centrifugé pour séparer le plasma pour de futurs tests hormonaux.</li>
</ol>6. Deuxième perfusion
<ol><li>Retirez les infusats des pompes à seringues en déconnectant le tube des seringues et remplacez-le par le deuxième infuseur contenant le traceur avec le glucose. Répétez les étapes 4.2 à 4.7 en utilisant la perfusion de glucose isotopique riche en glucose.<ol>
<li>Pour atteindre un état d’équilibre, faire couler un bolus du deuxième infusat à 600 μL/h pendant 15 min. Notez l’heure de début de chaque groupe de cages. Diminuer le débit de perfusion à 150 μL/h pour compléter les 3 h de temps total de perfusion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez les étapes 5.1 et 5.2.</li>
	<li>Arrêtez la pompe à perfusion et retirez doucement le cathéter de la veine caudale, appliquez une pression sur les sites du cathéter jusqu’à ce que le saignement cesse et ramenez les souris dans leurs cages d’origine.</li>
	<li>Santize et désinfectez soigneusement la configuration de la cage avec de l’eau et du savon standard. REMARQUE: Il s’agit d’une procédure de survie. Les souris peuvent être retournées dans des cages et gardées pour d’autres expériences si nécessaire. Il est recommandé qu’aucune autre expérience ne soit effectuée pendant au moins une semaine après cette procédure afin d’assurer un bien-être animal adéquat.</li>
</ol>7. Spectrométrie de masse
<ol><li>Envoyez les échantillons pour la spectrométrie de masse.</li>
	<li>Analyses<ol>
<li>Mesurer l’enrichissement isotopique du [6,6-2H2]glucose par chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse (SMGC) à l’aide du dérivé de pentaacétate21,22. En bref, cette méthode implique la préparation du dérivé pentaacétate du glucose, suivie d’une analyse d’échantillon à l’aide de GCMS 20,22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculs<ol>
<li>Effectuer toutes les mesures cinétiques dans des conditions d’équilibre. Le taux d’apparition du glucose plasmatique total (glucose Ra) a été calculé à partir de l’enrichissement M+2 du [6,6-2H2]glucose dans le plasma à l’aide d’équations de dilution isotopiques établies21. Dans des conditions d’équilibre, on suppose que le taux d’apparition du glucose est égal au taux de disparition du glucose. Taux de production endogène de glucose (mg/(kg·min)) (GPR) = glucoseRa - glucose exogène.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li>
<li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li>
<li>Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group
. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li>
<li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome%3A+etiology%2C+pathogenesis+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li>
<li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction%3A+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li>
<li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic-pituitary%2C+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li>
<li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li>
<li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li>
<li>Højlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li>
<li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li>
<li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance%2C+polycystic+ovary+syndrome%2C+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+peripheral+insulin+resistance%2C+independent+of+obesity%2C+in+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li>
<li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li>
<li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li>
<li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+%26%2334%3Bmild%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bsevere%26%2334%3B+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &#34;mild&#34; and &#34;severe&#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li>
<li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538(2019).</li>
<li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+reproductive%2C+metabolic%2C+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li>
<li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Connections%22%5BJournal%5D)">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li>
<li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%26%2334%3Btrue%26%2334%3B+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6%2C6-dideuteroglucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Measurement of &#34;true&#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li>
<li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood.+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li>
<li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917(2014).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious%2C+unrestrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188(2011).</li>
<li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739(2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li>
<li>Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metabolism%22%5BJournal%5D)">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’hyperglycémie et le métabolisme anormal du glucose / homéostasie sont des caractéristiques du SOPK. Le taux de glucose dans le sang est maintenu par une combinaison de glucose provenant de l’alimentation et de la production de glucose via la glycogénolyse et la gluconéogenèse et la glycogenèse, sous le contrôle des hormones et des enzymes. La production hépatique de glucose est supprimée par la présence d’une augmentation des taux de glucose circulants. Dans les troubles du métabolisme anormal du glucose, la r...

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est un trouble fréquent chez 12 % à 20 % des femmes en âge de procréer1,2. Il s’agit d’une maladie complexe entraînant des phénotypes variables impliquant des ovaires polykystiques, des règles irrégulières et des preuves cliniques ou de laboratoire d’hyperandrogénémie, et elle est généralement diagnostiquée lorsqu’une femme répond à deux des trois critères3. Un aspect prédominant du SOPK, et un facteur clé de sa pathogenèse, est les dérangements métaboliques que l’on trouve chez les femmes atteintes de la maladie. Les femmes atteintes du SOPK ont une incidence plus élevée de résistance à l’insuline, d’intolérance au glucose, d’obésité et de syndrome métabolique3,4,5,6. La résistance à l’insuline n’est pas seulement une manifestation de la maladie, mais on pense qu’elle contribue à sa pathogenèse en potentialisant l’action de l’hormone lutéinisante dans l’ovaire, entraînant ainsi une augmentation de la production d’androgènes7,8. On pense que la résistance à l’insuline a plusieurs origines possibles, mais des études suggèrent qu’elle pourrait être due à des schémas anormaux de signalisation des récepteurs de l’insuline9,10. Des études ont évalué la résistance à l’insuline chez les patients atteints du SOPK en utilisant la technique de référence de la pince hyperinsulinémique-euglycémique11,12,13,14,15. Les femmes atteintes du SOPK, indépendamment de l’IMC, ont des niveaux plus élevés de résistance à l’insuline que les témoins. Le contrôle de l’insuline sur la production de glucose est altéré dans les troubles de la résistance à l’insuline conduisant à une production excessive de glucose. Par exemple, les patients diabétiques ont des taux accrus de gluconéogenèse et une altération de la suppression de la glycogénolyse16. En outre, une altération de la suppression de la production de glucose a été observée chez des rats diabétiques17. Bien que les études sur les pinces puissent donner une mesure de la résistance à l’insuline, peu d’études sur le SOPK se concentrent sur la mesure directe de la production de glucose à jeun et en état d’alimentation. Cela nécessite l’utilisation d’une perfusion de traceur de glucose isotopique non radioactif et la mesure par spectrométrie de masse.
Les modèles animaux ont été largement utilisés dans la recherche sur le SOPK. Des modèles murins de SOPK maigre et de type obèse ont été créés en administrant des androgènes avant la naissance, prépubère ou post-puberté18. Les modèles de SOPK des rongeurs démontrent également des différences métaboliques par rapport à leurs témoins respectifs. Des données antérieures de notre laboratoire ont démontré des tests de tolérance au glucose anormaux (GTT) dans des modèles murins du SOPK (maigres et obèses), conformes à la littérature sur le SOPK humain19. L’utilisation d’un modèle animal maigre et obèse permet d’approfondir les recherches sur les différences métaboliques. Plus précisément, ce modèle permet d’évaluer le taux de production de glucose directement à l’aide de traceurs de glucose isotopiques. L’un des traceurs de glucose isotopiques stables les plus couramment utilisés est le glucose [6,6-2H2]. L’enrichissement en glucose [6,6-2H2] peut être mesuré à l’aide d’un dérivé de pentaacétate comme décrit précédemment20.
Dans cette étude, notre objectif était de mesurer le taux de production de glucose hépatique à jeun et à l’état riche en glucose chez les souris SOPK en utilisant une perfusion de glucose isotopique. Ces techniques peuvent être appliquées à un large éventail d’expériences impliquant la cinétique du glucose.

<table><tbody><tr><td>Solution de chlorure de sodium à 0,9 %</td><td>McKesson</td><td>275595</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Seringue à embout BD Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>75846-756</td><td>Deux seringues par animal (une pour une solution isotopique de glucose, une pour une solution isotopique riche en glucose)</td></tr><tr><td>Ruban transparent transparent de 1 pouce</td><td>3M</td><td>70200400169</td><td></td></tr><tr><td>1 pouce Ruban d’étiquetage</td><td>Fisher</td><td>GS07F161BA</td><td>La marque est un exemple</td></tr><tr><td>Seringue de 5 mL contenant une solution saline héparannique</td><td>McKesson</td><td>191-MIH-2235</td><td>On peut également préparer une solution de rinçage à l’héparine (10 unités/mL d’héparine dans du chlorure de sodium à 0,9 %)</td></tr><tr><td>5 mm Medipoint Goldenrod Animal</td><td>Lances Fisher Scientific</td><td>NC9891620</td><td>5 mm si l’animal a entre 2 et 6 mois</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à plaque chauffante Advanced</td><td>VWR</td><td>97042-602</td><td>La marque est un exemple</td></tr><tr><td>: aiguilles BD de calibre 27 0,5 pouce</td><td>Health Warehouse</td><td>A283952</td><td></td></tr><tr><td>aiguilles BD 30 de calibre 0,5 pouce</td><td>Medvet</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Tube en polyéthylène (PE) 0,28 mm ID x 0,61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Tube en polyéthylène (PE) 0,28 mm ID x 0,61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>Bécher, 1000 mL</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Granulés</td><td></td><td></td><td></td>de cage</tr><tr><td>Flacons en verre transparent VOA avec bouchon fermé</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-719-120</td><td>Pour le stockage d’échantillons d’acétone et de prise de sang</td></tr><tr><td>Pince crocodile édentée en cuivre pour garrot</td><td>Amazon N’importe</td><td></td><td>quelle marque ; pinces crocodiles lisses et édentées en cuivre solide</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose >99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose (6,6-D2, 99 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-349-PK</td><td></td></tr><tr><td>Tube silastique Dow Corning 0,3 mm ID x 0,64 mm OD</td><td>VWR</td><td>62999-042</td><td></td></tr><tr><td>Loupe</td><td>Amazon</td><td></td><td>N’importe quelle marque ; similaire à LANCOSC Loupe avec microbalance de lumière et de support</td></tr><tr><td></td><td>Ohaus Adventurer Pro</td><td>AV264C</td><td>Tout modèle similaire avec une précision de 0,0001g peut être utilisé</td></tr><tr><td>Bouteille Nalgene, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0158-12EA</td><td>Ou toute marque similaire ; scie en deux (y compris le couvercle) et coupe l’encoche de la taille d’une queue dans le fond</td></tr><tr><td>Pompe multi-seringues PHD Ultra</td><td>Appareil Harvard</td><td>70-3024A</td><td></td>Feuille</tr><tr><td></td><td></td> de<td>plexiglas</td><td>N’importe quelle marque ; pour stabiliser la souris lors de l’insertion du cathéter</td></tr><tr><td>Feuilles et séparateurs</td><td></td><td></td> en plexiglas <td>N’importe quelle marque ; utilisé pour mettre les souris en cage pendant la perfusion</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la production de glucose hépatique dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est une maladie courante qui entraîne des troubles du métabolisme du glucose, tels que la résistance à l’insuline et l’intolérance au glucose. Le métabolisme du glucose dérégulé est une manifestation importante de la maladie et est la clé de sa pathogenèse. Par conséquent, les études impliquant une évaluation du métabolisme du glucose dans le SOPK sont de la plus haute importance. Très peu d’études ont quantifié la production hépatique de glucose directement dans les modèles SOPK à l’aide de traceurs de glucose non radioactifs. Dans cette étude, nous discutons des instructions étape par étape pour la quantification du taux de production hépatique de glucose dans un modèle murin SOPK en mesurant l’enrichissement M + 2 du [6,6-2H2]glucose, un traceur de glucose isotopique stable, par chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse (SMGC). Cette procédure implique la création d’une solution de traceur de glucose isotopique stable, l’utilisation de la mise en place d’un cathéter veineux de la queue et la perfusion du traceur de glucose à jeun et riche en glucose chez la même souris en tandem. L’enrichissement du [6,6-2H2]glucose est mesuré à l’aide du dérivé du pentaacétate dans le SMGC. Cette technique peut être appliquée à une grande variété d’études impliquant une mesure directe du taux de production hépatique de glucose.

À l’aide d’équations de dilution isotopique décrites précédemment, le taux de glucose plasmatique total (glucoseRa) a été calculé à partir de l’enrichissement M+2 du [6,6-2H2]glucose dans des conditions à jeun et riches en glucose à l’aide du dérivé de pentaacétate21. Dans des conditions d’équilibre, on suppose que le taux d’apparition du glucose est égal au taux de disparition du glucose. Dans le groupe témoin, le glucoseRa total était de 19,98 ± 2,53 m...

Cette étude décrit la mesure directe de la production hépatique de glucose dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques en utilisant un traceur de glucose isotopique stable via la veine caudale à jeun et riche en glucose en tandem.

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Le but de cette procédure est de déterminer la production hépatique de glucose dans un syndrome des ovaires polykystiques, ou modèle murin SOPK. Le métabolisme du glucose dérégulé est une manifestation importante du SOPK et est la clé de sa pathogenèse. Par conséquent, les études impliquant une évaluation du métabolisme du glucose dans le SOPK sont de la plus haute importance.Dans cette étude, nous discutons des instructions étape par étape pour la quantification du taux de production hépatique de glucose dans un modèle murin SOPK en mesurant l’enrichissement M plus deux de six six glucose deutérés, un traceur de glucose isotopique stable, par chromatographie en phase gazeuse, spectrométrie de masse ou SMGC. Cette procédure implique la création d’une solution de traceur de glucose isotopique stable, l’utilisation de la mise en place d’un cathéter de veine caudale et la perfusion du traceur de glucose à jeun et riche en glucose chez la même souris en tandem. Un jour avant la procédure, préparez le traceur de glucose isotopique stable dans une solution saline normale.Pour cette expérience, la production de glucose pendant le jeûne dans des conditions riches en glucose a été mesurée,

evaluation-hepatic-glucose-production-polycystic-ovary-syndrome-mouse

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

La pince hyperinsulinémique-euglycémique, ou pince à l'insuline, est le gold standard pour évaluer action de...

Hyperinsulinémique euglycémique-pinces dans Conscient, Souris illimités

Cette vidéo explique comment effectuer un test de tolérance au glucose par voie orale sur une souris de laboratoire.

Test de tolérance au glucose par voie orale (OGTT) : mesure du métabolisme du glucose chez la souris

Cet article décrit une façon de préparer et d’insérer des pastilles de dihydrotestostérone (DHT) pour modéliser le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez la souris. L’exemple de protocole illustre la procédure chez la souris utilisée pour les études de reproduction et métaboliques.

Traitement sous-cutané à la dihydrotestostérone (DHT) : modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK)

Ici, des méthodes optimisées pour générer des modèles in vivo et in vitro de stéatose hépatique et pour analyser les phénotypes stéatotiques et les paramètres physiologiques associés sont décrites.

Analyse optimisée des<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Stéatose hépatique

L’article décrit la génération et la caractérisation métabolique de chez les souris nourries à la diète riche en gras comme un modèle de résistance à l’insuline induite par le régime alimentaire et l’obésité. Il dispose également des protocoles détaillés pour effectuer l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale et le test de tolérance de l’insuline, suivi des altérations du corps entier de glucose métabolisme in vivo.

Étude In Vivo du métabolisme du Glucose à haute teneur en graisses régime chez les souris nourries avec épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et Test de tolérance à l’insuline (ITT)

Les auteurs décrivent le développement d’un modèle de souris SOPK type maigre avec une boulette de dihydrotestostérone afin d’étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Un modèle de souris Hyperandrogenic d’étudier le Syndrome des ovaires polykystiques

Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.

Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique essentielle responsable de la génération d’énergie dans de nombreux types de cellules, y compris les hépatocytes. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer l’oxydation β des acides gras dans des hépatocytes primaires fraîchement isolés en utilisant de l’acide palmitique marqué 14C.

Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés

Nous présentons ici une méthode robuste de perfusion in situ du foie de souris pour étudier la régulation aiguë et directe du métabolisme hépatique sans perturber l’architecture hépatique mais en l’absence de facteurs extra-hépatiques.

La production hépatique de glucose, l’uréagénèse et la lipolyse quantifiées à l’aide du modèle de foie de souris perfusé

Ce protocole introduit une technique permettant d’induire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez la souris par une libération contrôlée de létrozole à l’aide de mini-pompes. Sous anesthésie adéquate, la mini-pompe a été implantée par voie sous-cutanée et le SOPK a été induit avec succès chez les souris après une certaine période de libération de la mini-pompe.

Une technique modifiée pour induire le syndrome des ovaires polykystiques chez la souris

Découvrez comment quantifier la production hépatique de glucose dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques à l'aide d'un traceur isotopique stable et de la CG-SM. Cette méthode permet d'évaluer le métabolisme glucidique dans différents états métaboliques.

Évaluation de la production de glucose hépatique dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques

Explorer plus de vidéos