Name: Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez un protocole rapide et sensible pour évaluer la consommation d'acides aminés dans les cellules osseuses et les os isolés. Cette méthode utilisant des acides aminés radiomarqués est économique et adaptable à d'autres nutriments.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le laboratoire Karner est soutenu par des subventions R01 du National Institute of Health (AR076325 et AR071967) à C.M.K.

Toutes les procédures de souris décrites ici ont été approuvées par les comités d’études animales du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas. Le protocole de radioprotection a été approuvé par le Comité consultatif de radioprotection du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas.
1. Absorption d’acides aminés dans les cellules (Protocole I)
<ol><li>Plaque 5 x 104 cellules ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Cellules en plaques dans α-MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep). Plaquer des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations de l’étape 1.12. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
	<li>Culture des cellules pendant 2-3 jours jusqu’à confluence.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, préparer les solutions suivantes : 1x tampon phosphate salé (PBS), pH 7,4 et tampon Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0 : (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Préchauffer à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 1 mL de 1x PBS, pH 7,4. REMARQUE: Ce protocole est également approprié pour diviser rapidement les cellules non confluentes. Dans ce cas, il est important de normaliser la radioactivité en fonction du nombre absolu de cellules ou du contenu de l’ADN. De plus, envisagez d’augmenter la taille de la plaque de culture ou du flacon pour augmenter le nombre global de cellules et les valeurs de cpm. Il est important de le déterminer empiriquement sur une base individuelle.</li>
	<li>Aspirer 1x PBS et laver les cellules une fois avec 1 mL KRH.</li>
	<li>Faire 4 μCi/mL de milieu de travail L-[3,4-3 H]-glutamine en diluant 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamine par 1 mL de KRH. REMARQUE : Avant d’utiliser des matières radioactives, veuillez communiquer avec le Bureau de la radioprotection de votre établissement d’attache pour obtenir des approbations. Toutes les procédures liées au rayonnement doivent être effectuées derrière le blindage en plexiglas.</li>
	<li>Incuber des cellules avec 0,5 mL de KRH contenant 4 μCi/mL de milieu de travail L-[3,4-3 H]-glutamine pendant 5 min.</li>
	<li>Recueillir le milieu radioactif et le distribuer dans le conteneur à déchets liquides. Lavez brièvement les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Recueillir et jeter tous les lavages dans le conteneur à déchets liquides radioactifs.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de SDS à 1% à chaque puits et triturer 10x pour lyser et homogénéiser les cellules. Transférer les lysats cellulaires dans des tubes de 1,5 mL. Jeter les plaques de culture cellulaire, les pipettes sérologiques et les pointes de pipettes dans le conteneur de déchets radioactifs solides.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 > x g pendant 10 min. Transférer les surnageants dans des flacons à scintillation contenant 8 mL de la solution de scintillation. Mélanger en agitant vigoureusement les flacons de scintillation. Jeter les tubes et les embouts de pipettes dans un conteneur à déchets radioactifs solides.</li>
	<li>Lire la radioactivité en comptage par minute (cpm) à l’aide d’un compteur à scintillation. Jeter les flacons de scintillation dans le récipient à déchets pour flacons à scintillation.</li>
	<li>Trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules des plaques non radioactives restantes des cellules (voir étape 1.1) pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale. Normalisez le cpm de l’étape 1.11 au nombre de cellules estimé à partir des plaques non radioactives.</li>
	<li>Une fois l’expérience terminée, décontaminer la hotte de culture cellulaire, le banc et tous les instruments avec un spray décontaminant radioactif. Enfin, effectuez des tests d’essuyage pour vous assurer que la zone de travail est exempte de rayonnement.</li>
</ol>2. Absorption d’acides aminés dans les tissus osseux fraîchement isolés (Protocole II)
<ol><li>Préchauffer KRH à 37 °C.</li>
	<li>Euthanasier une souris de 3 jours et enlever la peau des bras. Désarticulez l’huméru de l’épaule à l’aide de ciseaux et disséquez les deux humérus. Enlevez tous les tissus extemporanés à l’aide d’un scalpel et d’une pince. Retirez les épiphyses de l’os. NOTE: En plus de l’humerii, ce protocole peut être adapté aux fémurs, tibias et calvariae néonatals ainsi qu’aux humerii, fémurs et tibias isolés de souris âgées de 2 et 4 mois (données non publiées).</li>
	<li>Rincer la moelle osseuse et peser les tiges osseuses pour normaliser à l’étape 2.14.</li>
	<li>Faire bouillir un humérus dans 1x PBS à 100 °C pendant 10 min pour décellulariser l’os. L’os bouilli décellularisé est utilisé comme témoin négatif. REMARQUE: Comme contrôle de la qualité, la paraffine incorpore les os bouillis et non bouillis pour les taches histologiques afin de confirmer visuellement que l’ébullition était efficace pour décellulariser l’os.</li>
	<li>Équilibrer les deux humérus dans 1 mL de KRH pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C.</li>
	<li>Faire une solution de travail de 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginine dans KRH en diluant 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Stock d’arginine par 1 mL de KRH. REMARQUE : Ce protocole est approprié pour évaluer l’absorption de l’élément nutritif radiomarqué choisi. La L-[2,3,4-3 H]-glutamine, la L-[14CU]-alanine et la L-[2,3-3 H]-proline ont été testées avec des résultats similaires. Les données d’arginine sont montrées pour mettre en évidence l’utilité de ce protocole. ATTENTION : Toutes les procédures utilisant des radiations doivent être effectuées derrière le blindage en plexiglas tout en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.</li>
	<li>Incuber séparément l’os témoin expérimental et bouilli dans du KRH contenant 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginine pendant 90 minutes à 37 °C. REMARQUE: Il est important de déterminer empiriquement les temps d’incubation pour différentes conditions, y compris l’âge des souris, les différents éléments squelettiques et les types d’acides aminés radiomarqués en effectuant un cycle de temps. La saturation se produit principalement après environ 3-4 h. L’absorption devrait être évaluée à un moment donné dans la rage linéaire de l’absorption.</li>
	<li>Retirer le milieu radioactif et le jeter dans le conteneur de déchets radioactifs liquides. Lavez l’humérium trois fois en utilisant 1 mL de KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Jetez tous les lavages dans le conteneur de déchets radioactifs liquides.</li>
	<li>Transférer chaque os dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 500 μL de tampon RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Jetez les plaques de culture, les pipettes sérologiques et les pointes de pipettes dans un conteneur à déchets solides radioactifs.</li>
	<li>Homogénéiser l’humérium en hachant 100 fois avec des ciseaux dans un tampon RIPA.</li>
	<li>Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) l’os homogénéisé résultant pendant 10 s. REMARQUE: La sonication est également connue pour produire des aérosols. Les étapes de sonication peuvent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique. Pour réduire la formation d’aérosols, il est important de ne pas trop remplir les tubes. La sonication de petits volumes d’échantillons peut entraîner une sonication incomplète ou une perte d’échantillon due à la formation de mousse. En cas de moussage, centrifuger l’échantillon pendant 5 minutes pour qu’il se dépose.</li>
	<li>Clarifier le lysat par centrifugation pendant 10 min à >10 000 x g à température ambiante. Transférer 200 μL du surnageant dans des flacons de scintillation contenant 8 mL de solution de scintillation. Mélanger en agitant vigoureusement les flacons de scintillation. Jeter tous les déchets radioactifs solides (p. ex. tubes usagés, embouts de pipettes, plaques, etc.) dans le contenant de déchets radioactifs solides.</li>
	<li>Lire la radioactivité (cpm) à l’aide du compteur Scintillation. Jeter les flacons de scintillation usagés dans le conteneur de déchets radioactifs désigné pour les flacons de scintillation.</li>
	<li>Soustrayez le cpm de l’os bouilli (valeur basale) du cpm de l’os expérimental. Normaliser la radioactivité avec le poids osseux de l’étape 2.3.</li>
	<li>Vaporiser la cagoule de culture cellulaire, les instruments et le banc avec un décontaminant radioactif. Effectuez des tests d’essuyage pour confirmer que la zone de travail est exempte de rayonnement.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
<li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li>
<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
<li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li>
<li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li>
<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
<li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone%3A+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li>
<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Le protocole décrit ici fournit une approche rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés en réponse à diverses permutations expérimentales in vitro ou ex vivo. Par rapport aux kits disponibles dans le commerce (par exemple, les kits de détermination de la glutamine et du glutamate), cette méthode est beaucoup plus sensible, plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre16,17,25. Dans notre pr...

Les acides aminés sont des composés organiques qui contiennent un groupe fonctionnel amino (-NH2) et carboxyle (-COOH) avec une chaîne latérale variable spécifique à chaque acide aminé. En général, les acides aminés sont bien connus comme le constituant de base des protéines. Plus récemment, de nouvelles utilisations et fonctions des acides aminés ont été élucidées. Par exemple, les acides aminés individuels peuvent être métabolisés pour générer des métabolites intermédiaires qui contribuent à la bioénergétique, fonctionnent comme cofacteurs enzymatiques, régulent les espèces réactives de l’oxygène ou sont utilisés pour synthétiser d’autres acides aminés 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études démontrent que le métabolisme des acides aminés est essentiel pour la pluripotence, la prolifération et la différenciation cellulaires dans divers contextes 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Les ostéoblastes sont des cellules sécrétoires qui produisent et sécrètent la matrice osseuse extracellulaire riche en collagène de type 1. Pour maintenir des taux élevés de synthèse des protéines pendant la formation osseuse, les ostéoblastes exigent un apport constant en acides aminés. Pour répondre à cette demande, les ostéoblastes doivent acquérir activement des acides aminés. Conformément à cela, des études récentes révèlent l’importance de l’absorption et du métabolisme des acides aminés dans l’activité des ostéoblastes et la formation osseuse 15,16,17,18,19,20.
Les ostéoblastes acquièrent des acides aminés cellulaires à partir de trois sources principales: le milieu extracellulaire, la dégradation des protéines intracellulaires et la biosynthèse de novo des acides aminés. Ce protocole se concentrera sur l’évaluation de l’absorption des acides aminés à partir de l’environnement extracellulaire. Les méthodes les plus courantes pour mesurer l’absorption des acides aminés reposent sur des acides aminés radiomarqués (p. ex., 3H ou 14C) ou des isotopes lourds marqués (p. ex. 13C). Les dosages d’isotopomères lourds peuvent analyser l’absorption et le métabolisme des acides aminés de manière plus approfondie et plus sûre, mais ils prennent plus de temps et prennent plusieurs jours à compléter car il faut une journée pour préparer et dérivatiser les échantillons et plusieurs jours pour analyser sur le spectromètre de masse en fonction du nombre d’échantillons21,22. En comparaison, les tests d’absorption des acides aminés radiomarqués ne sont pas informatifs sur le métabolisme en aval, mais sont peu coûteux et relativement rapides, pouvant être achevés dans les 2-3 heures suivant le début de l’expérience23,24. Ici, nous décrivons un protocole de base facilement modifiable conçu pour évaluer l’absorption d’acides aminés radiomarqués dans des cellules primaires en culture ou des lignées cellulaires in vitro ou des arbres osseux individuels ex vivo. L’application de ces deux protocoles peut être étendue à d’autres acides aminés radiomarqués et à d’autres types de cellules et de tissus associés aux os.

<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1 mL</td><td>BD précision</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30G Aiguille</td><td>BD précision</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorhydrate d’arginine L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Compteur à scintillation Beckman LS6500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de choline</td><td>Sigma</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Solution de glucose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Outil</td><td></td><td></td> de dissection <td>Pinces, ciseaux, scapels</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td> Flacons à scintilation liquide Sigma Z190535 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorure de lithium, 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de magnésium Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha ;</td><td>Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation, 15mL</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& Matériaux</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (Solution de scintillation)</td><td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-(Methylamino)isobutyric</td><td>acid Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Le développement osseux et l’homéostasie dépendent de la différenciation et de l’activité des ostéoblastes formant des os. La différenciation des ostéoblastes est caractérisée séquentiellement par une prolifération suivie d’une synthèse protéique et, finalement, d’une sécrétion de matrice osseuse. La prolifération et la synthèse des protéines nécessitent un apport constant en acides aminés. Malgré cela, on sait très peu de choses sur la consommation d’acides aminés dans les ostéoblastes. Nous décrivons ici un protocole très sensible conçu pour mesurer la consommation d’acides aminés à l’aide d’acides aminés radiomarqués. Cette méthode est optimisée pour quantifier les changements dans l’absorption des acides aminés qui sont associés à la prolifération ou à la différenciation des ostéoblastes, aux traitements médicamenteux ou aux facteurs de croissance, ou à diverses manipulations génétiques. Il est important de noter que cette méthode peut être utilisée de manière interchangeable pour quantifier la consommation d’acides aminés dans des lignées cellulaires cultivées ou des cellules primaires in vitro ou dans des puits osseux isolés ex vivo. Enfin, notre méthode peut être facilement adaptée pour mesurer le transport de l’un des acides aminés ainsi que du glucose et d’autres nutriments radiomarqués.

Le transport des acides aminés est régulé par de nombreux transporteurs d’acides aminés liés à la membrane qui ont été classés en systèmes de transport distincts en fonction de nombreuses caractéristiques, notamment la spécificité du substrat, la cinétique, ainsi que la dépendance aux ions et au pH25. Par exemple, l’absorption de glutamine peut être médiée par les systèmes de transport dépendants de Na+ A, ASC, γ+L et N ou le système L indépendant de Na+. Les systèmes dépenda...

Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

L’absorption et le métabolisme des acides aminés sont essentiels pour la spécification, la différenciation et la formation osseuse des ostéoblastes. Ce protocole fournit une méthode rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés. Notre protocole utilise des acides aminés radiomarqués pour quantifier l’absorption des acides aminés.C’est une méthode bon marché, sensible et rapide qui peut être facilement modifiée pour différentes conditions. Ce protocole peut facilement être modifié pour évaluer l’absorption d’autres nutriments radiomarqués comme le glucose et les acides gras dans une variété de tissus ainsi que dans les cellules primaires ou transformées. Pour commencer, plaquer cinq fois 10 à la quatrième cellule ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits en milieu alpha MEM supplémentée en FBS, pénicilline et streptomycine.Plaquer des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations. Ensuite, incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à confluence. Après incubation, aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS à pH 7,4.Ensuite, aspirez le PBS avant de laver les cellules une fois avec un millilitre de HEPES ou KRH de Krebs-Ringer. Incuber des cellules avec 0,5 millilitre de KRH fraîchement préparé contenant quatre microcuries par millilitre de milieu de travail de glutamine tritiée L34 pendant cinq minutes. Après l’incubation, recueillir le milieu radioactif pour le distribuer dans le conteneur à déchets liquides.Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Ensuite, ajoutez un millilitre de dodécylsulfate de sodium à 1% à chaque puits et triturez le mélange 10 fois pour lyser et homogénéiser les cellules. Ensuite, transférez les lysats cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre et clarifiez le lysat en centrifugeant à une vitesse minimale de 10 000 G pendant 10 minutes.Transférer le surnageant dans un flacon à scintillation contenant huit millilitres de la solution de scintillation et lire l’activité radio et le nombre de comptes par minute à l’aide du compteur à scintillation. À partir des plaques non radioactives restantes des cellules, trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale.Pour déterminer l’absorption d’acides aminés, rincer la moelle de l’os avant de peser la tige osseuse. Pour décellulariser l’os, faites bouillir un humérus dans du PBS à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Équilibrez l’humeri vivant et bouilli dans un millilitre de KRH pendant 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.Ensuite, incuber séparément les os témoins expérimentaux et bouillis dans du KRH fraîchement préparé contenant quatre microcurries par millilitre d’arginine triciée L234 pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré le milieu radioactif, mettez fin à la réaction en lavant l’humérus trois fois avec un millilitre de KRH glacé. Transférez chaque os dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de tampon RIPA.Homogénéisez ensuite l’humérus et le tampon RIPA en hachant 100 fois avec des ciseaux, suivi d’une sonication à 35% d’amplitude et d’une impulsion seconde pendant 10 secondes. Clarifié le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 10 000 fois G à température ambiante. Après centrifugation, transférer 200 microlitres du surnageant dans des flacons à scintillation contenant huit millilitres de solution de scintillation.Lire l’activité radio à l’aide du compteur de scintillation. Les propriétés cinétiques de l’absorption in vitro de la glutamine tritiée par L34 et des cellules ST2 confluentes ont été évaluées en présence ou en l’absence d’acide méthylaminé isobutyrique sodique ou de lithium. L’élimination du sodium a entraîné une réduction de 90% de l’absorption de glutamine.La présence de lithium a augmenté l’absorption de glutamine de 2% par rapport à l’état sans sodium. Alors que l’acide méthylamino isobutyrique n’a pas affecté l’absorption de glutamine. Les contributions estimées en pourcentage des systèmes A, N, L ou ASC et gamma plus L ont indiqué que la majeure partie de l’absorption de glutamine est médiée par les systèmes ASC et gamma plus L.Le système N est responsable d’environ 2% de l’absorption de glutamine dépendante du sodium.Et le système A a montré 0% de contribution et d’adoption. L’absorption d’arginine tritiée X-VIVO L34 dans l’huméri néonatal bouilli et vivant a été analysée sur une période de deux heures. L’absorption d’arginine a augmenté linéairement tout au long de l’expérience et de l’humérium vivant.L’humérus bouilli n’a pas montré d’augmentation dynamique de l’absorption d’arginine dans l’expérience. L’analyse représentative montre l’absorption normalisée et corrigée de l’arginine. Il est important de faire bouillir l’os controlatéral comme témoin actif.Cette étape est essentielle car la matrice osseuse peut absorber des acides aminés radioactifs, ce qui entraîne des résultats inexacts. Le protocole nous a permis de confirmer la cinétique d’absorption des acides aminés à la fois in vitro et in vivo.

evaluation-amino-acid-consumption-cultured-bone-cells-isolated-bone

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Une bibliothèque d'affichage de phages a été utilisé pour identifier les séquences peptidiques qui os cible. L'objectif était d'étudier l'effet de ces peptides sur la différenciation des cellules mésenchymateuses et de déterminer leur effet sur la régénération osseuse.

Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l&#39;expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l&#39;ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode de détection des dépôts de calcium sécrétés par les ostéoblastes à l’aide d’un colorant anionique, le rouge d’alizarine S. Les ostéoblastes cultivés sont d’abord colorés, puis le colorant est récupéré pour la quantification colorimétrique des dépôts de calcium ou du degré de minéralisation des ostéoblastes.

Dosage de minéralisation in vitro : méthode colorimétrique pour quantifier les dépôts de calcium ostéoblastique sur un substitut de greffe osseuse par coloration et extraction au rouge d’alizarine

Cette vidéo présente une technique in vitro pour estimer l’absorption d’acides aminés par les cellules stromales dérivées de la moelle osseuse. Les transporteurs d’acides aminés dépendants du Na+ médient l’absorption des acides aminés radiomarqués à l’intérieur des cellules, et l’absorption cellulaire est estimée en mesurant la radioactivité.

Dosage de l’absorption des acides aminés radiomarqués pour quantifier l’absorption cellulaire des acides aminés

Nous décrivons ici comment préparer milieu de l'os de la climatisation (BCM) et de tester son activité in vitro.

Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

L’uranium est connu pour affecter le métabolisme osseux. Nous présentons ici un protocole visant à étudier les effets de l’exposition de l’uranium naturel sur la viabilité, la différenciation et la fonction des ostéoclastes, les cellules en charge de la résorption osseuse.

Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis

Nous présentons un protocole pour comparer l’état de minéraux dans les vésicules, sortis deux lignées de cellules d’os humains : hFOB 1.19 et Saos-2. Leurs profils de minéralisation ont été analysés par l’alizarine rouge-S (AR-S), de coloration, ultraviolette visualisation de lumière (UV), imagerie de microscopie électronique (met) de transmission et microanalyse à rayons x dispersive en énergie (EDX).

Analyse des minéraux produits par hFOB 1.19 et Saos-2 cellules à l’aide de microscopie électronique à Transmission avec Energy Dispersive x-ray Microanalysis

Ici, nous présentons une méthode pour la culture ex vivo de longs os murins aux stades fœtal et nouveau-né, approprié pour analyser le développement osseux et le cartilage et l’homéostasie dans des conditions contrôlées tout en récapitulant le processus in vivo.

Culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né

Le test de flux métabolique cellulaire en temps réel mesure le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire, qui correspond à la production mitochondriale et glycolytique d’adénosine triphosphate, à l’aide de capteurs de pH et d’oxygène. Le manuscrit explique une méthode pour comprendre l’état énergétique des ostéoblastes et la caractérisation et l’interprétation de l’état bioénergétique cellulaire.

Utilisation d’un analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel pour surveiller la bioénergétique des ostéoblastes

Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.

Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

Ce protocole décrit la fabrication de constructions osseuses 3D utilisant des ostéocytes humains intégrés dans des hydrogels de gélatine méthacrylée (GelMA) complétés par une matrice extracellulaire décellularisée. La méthode est peu coûteuse, évolutive et compatible avec le matériel de laboratoire de base, offrant une plateforme translationnelle pour étudier les processus de maladies musculosquelettiques.

Une plateforme de culture osseuse 3D utilisant des ostéocytes humains et une matrice extracellulaire décellularisée pour modéliser les maladies musculosquelettiques

Découvrez un protocole rapide et sensible pour évaluer la consommation d'acides aminés dans les cellules osseuses et les os isolés. Cette méthode utilisant des acides aminés radiomarqués est économique et adaptable à d'autres nutriments.

Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés

Explorer plus de vidéos