Automatisation de la quantification agrégée chez Caenorhabditis elegans
14 octobre 2021
Le protocole suivant décrit le développement et l’optimisation d’un flux de travail à haut débit pour la culture de vers, l’imagerie par fluorescence et le traitement automatisé d’images afin de quantifier les agrégats de polyglutamines en tant qu’évaluation des changements dans la protéostasie.
Une approche simple a été adoptée pour surveiller les changements dans la protéostasie en évaluant l’agrégation des polyglutamines et en fournissant un cadre pouvant être utilisé pour des applications à haut débit. Noter un phénotype tel que le nombre d’agrégats par I peut devenir subjectif. L’automatisation du comptage des agrégats nous permet d’éliminer ces biais, d’augmenter le débit et la reproductibilité.
Cette méthode aide à identifier les gènes bactériens contribuant à la perturbation de la protéostasie de l’hôte. Comprendre la contribution individuelle des gènes bactériens nous aidera à comprendre son implication dans la pathogenèse de maladies comme la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Commencez par retirer les plaques contenant des vers du congélateur et laissez-les décongeler à température ambiante.
Essuyez ensuite l’excès de condensation et retirez le couvercle avant l’imagerie. Utilisez les paramètres du microscope avec un temps d’exposition de 500 millisecondes, un grossissement de 40 X avec un adaptateur de caméra 0,63 X et une intensité GFP réglée à 100% pendant la capture d’image. Maintenant, ajustez les commandes de lumière transmise jusqu’à ce que les vers apparaissent brillamment éclairés par rapport à l’arrière-plan sombre, évitant ainsi la surexposition.
Modifiez les positions des vers dans le puits pour éviter un agglutination excessive en utilisant une pointe de pipette de 10 microlitres pour pousser doucement les vers dans la position souhaitée. Définissez le canal sur le filtre GFP pour établir un plan focal pour les deux images. Capturez une image en champ lumineux.
Prenez une image de fluorescence correspondante sans perturber la plaque ou changer la mise au point du microscope. Maintenant, pour évaluer les images, téléchargez d’abord cellProfiler. Ouvrez le logiciel et faites glisser et déposez les images d’intérêt dans la boîte d’images.
Cliquez sur les images dans la liste des fichiers pour les ouvrir. Sélectionnez la loupe pour mettre en surbrillance une région d’intérêt et l’icône en forme de flèche pour mesurer la longueur des vers et des agrégats. Passez le curseur de la souris sur l’objet souhaité pour déterminer sa valeur d’intensité, qui peut être vue dans la partie inférieure de l’écran.
Pour utiliser le pipeline d’analyse d’images CellProfiler, nommez correctement les paires d’images comme décrit dans le manuscrit textuel après avoir téléchargé CellProfiler à partir du site officiel. Téléchargez le pipeline et téléchargez-le dans CellProfiler en sélectionnant fichier, importer et pipeline à partir du fichier. Sélectionnez le module vers non intriqués pour ouvrir ses paramètres afin de charger un jeu d’entraînement utilisé pour identifier les vers dans le module vers non intriqués.
Identifiez ensuite le nom du fichier de l’ensemble de formation. Sélectionnez l’icône de téléchargement du fichier et téléchargez également le fichier supplémentaire. Téléchargez des images en sélectionnant le module images dans le coin supérieur gauche.
Et puis faites glisser et déposez des images correctement nommées. Avant d’analyser les images, sélectionnez le dossier de sortie souhaité qui sera utilisé pour stocker les résultats en cliquant sur le bouton des paramètres de sortie situé dans le coin inférieur gauche du programme. Sélectionnez ensuite l’icône de dossier à droite de la sortie par défaut pour choisir l’emplacement de sortie souhaité.
Sélectionnez l’icône Analyser les images pour commencer l’analyse des images. Si l’analyse prend trop de temps à terminer et est bloquée dans le traitement d’une seule image, abandonnez l’exécution et identifiez l’image non traitée en triant le dossier de sortie et en notant quel nom d’image est introuvable. Après une analyse complète, le logiciel organisera les résultats dans une feuille de calcul Excel contenant des vers individuels dans la colonne N et le nombre respectif d’agrégats dans la colonne K.Téléchargez l’organisateur de métadonnées pour organiser facilement les données du fichier CSV de sortie de CellProfiler.
Pour le système d’exploitation Windows, localisez le fichier téléchargé et extrayez-le à l’emplacement souhaité. Recherchez et ouvrez le dossier extrait nommé gui_Windowsos_64x. Et lancez l’application en cliquant sur l’icône de l’application GUI.
Une invite peut s’ouvrir pour demander l’autorisation d’exécuter. Sélectionnez plus d’informations, puis cliquez sur exécuter quand même. L’organisateur de métadonnées est maintenant prêt à glisser-déposer les fichiers CSV de sortie CellProfiler.
Pour Mac OS, recherchez le fichier téléchargé et extrayez le fichier d’application de l’organisateur de métadonnées de fichier. Ouvrez le dossier extrait trouvé dans les téléchargements. Faites un clic droit sur l’application GUI et sélectionnez Ouvrir.
Une invite apparaîtra demandant la permission d’ouvrir en raison de l’absence d’une licence officielle. Sélectionnez Ouvrir. Une fois que votre application d’organisateur de métadonnées est ouverte dans le système d’exploitation respectif, cliquez sur télécharger vos fichiers ici, ou faites glisser et déposez les fichiers CSV CellProfiler souhaités.
Cliquez sur le bouton organiser, ce qui amènera l’utilisateur à un nouvel écran avec un bouton de téléchargement de fichiers. Cliquez sur le bouton et sélectionnez l’emplacement souhaité pour enregistrer le fichier de sortie. Le fichier de sortie apparaîtra comme le nom de fichier d’origine avec _organized’extension ajoutée au nom de fichier.
En présence de FUDR, les vers nourris avec diverses bactéries avaient une taille corporelle plus constante, ce qui permettait une détection plus uniforme et plus précise des vers, résolvant ainsi le problème de la surpopulation. La congélation des vers a amélioré la détection des agrégats polyQ en éliminant la fluorescence de fond, ainsi que la précision du comptage automatisé comparable au comptage manuel. L’éclairage en champ lumineux inversé a été utilisé pour détecter l’ensemble du canal C.elegans et GFP pour imager les agrégats polyQ YFP.
La détection des vers, le démêlage et la quantification des agrégats pour chaque ver ont été effectués en appliquant un pipeline de traitement d’image CellProfiler optimisé, ce qui permet d’obtenir le nombre d’agrégats par ver individuel. La différence entre l’efficacité de la quantification automatisée des agrégats et l’utilisation du pipeline CellProfiler était minime, ce qui indique que la méthode automatisée peut être appliquée à des écrans à grande échelle. Sur 90 souches bactériennes testées, la colonisation de l’intestin de C.elegans avec un candidat a montré une diminution significative du nombre d’agrégats.
Les expériences de confirmation par comptage manuel ont révélé qu’aucun des mutants, y compris celui qui a significativement diminué le nombre d’agrégats, n’a affecté l’agrégation polyQ. Les chercheurs qui décident d’utiliser ce cadre doivent comprendre que les étapes décrites ne sont pas absolues. La modification et une compréhension fondamentale de la façon de manipuler CellProfiler sont essentielles au succès.
D’autres approches biochimiques telles que le western blotting peuvent être utilisées pour confirmer l’agrégation polyQ.
Aperçu
Cette étude développe un flux de travail à haut débit pour la culture des vers, l'imagerie par fluorescence et le traitement automatisé d'images pour quantifier les agrégats de polyglutamine comme mesure des changements dans la protéostase. La méthode améliore l'évaluation de ces agrégats, en particulier dans l'exploration de leur rôle dans les maladies neurodégénératives.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Protéostase
- Maladies neurodégénératives
- Dépistage à haut débit
Contexte
- L'agrégation de polyglutamine est liée à des maladies telles que Alzheimer, Parkinson et Huntington.
- Comprendre les contributions des gènes bactériens à la perturbation de la protéostase est essentiel.
- Les méthodes de notation traditionnelles pour les agrégats peuvent être subjectives.
Méthodes utilisées
- Imagerie et analyse à haut débit utilisant CellProfiler
- C. elegans comme modèle biologique
- Quantification automatisée des agrégats de polyglutamine
Résultats principaux
- Le traitement automatisé d'images permet d'éliminer les biais et d'augmenter la reproductibilité du comptage des agrégats.
- Des gènes bactériens identifiés affectant la protéostase de l'hôte avec des résultats significatifs sur le nombre d'agrégats dans les vers.
- Les résultats validés indiquent que l'automatisation est comparable au comptage manuel, soutenant des dépistages à grande échelle.
Conclusions
- Cette étude fournit un cadre fiable pour étudier la protéostase par l'agrégation de polyglutamine.
- Les connaissances acquises grâce à cette méthode sont pertinentes pour comprendre les mécanismes des maladies neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
