Name: Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Apprenez à produire des nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l'aide du dispositif microfluidique iLiNP. Cette méthode permet un contrôle précis de la taille des NPL de 20 à 100 nm pour optimiser l'efficacité de l'ARN.

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Ce travail a été soutenu par JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japon, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japon, JST, SCORE, Japon, les dépenses d’éducation spéciale et de recherche du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 et Iketani Science and Technology Foundation.

1. Fabrication de l’appareil iLiNP
REMARQUE: Le dispositif iLiNP est fabriqué à l’aide de la méthode de lithographie logicielle standard18. Le protocole de fabrication détaillé a été signalé précédemment10,13.
<ol><li>Fabrication de moules SU-8<ol>
<li>Versez le SU-8 3050 sur une plaquette de silicium de 3 pouces. Spin coat la plaquette de silicium pour obtenir une couche SU-8 de 100 μm d’épaisseur.</li>
		<li>Cuire la plaquette de silicium en la plaçant sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 5 min et à 95 °C pendant 45 min.</li>
		<li>Après la cuisson, placez la plaquette de silicium sur la scène d’un système de lithographie sans masque de bureau.</li>
		<li>Exposez la plaquette de silicium à la lumière UV à 365 nm pendant 1,5 s par position. REMARQUE: Un système de lithographie sans masque de bureau a été utilisé dans cette expérience. Le système expose automatiquement la lumière UV dans une zone d’irradiation divisée (une position) du microcanal.</li>
		<li>Après irradiation UV, cuire la plaquette de silicium sur la plaque chauffante à 65 °C pendant 1 min et à 95 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Refroidir la plaquette de silicium, puis faire tremper dans un révélateur SU-8 pendant 15 minutes pour éliminer le SU-8 non exposé.</li>
		<li>Traiter le moule SU-8 avec du fumigène de Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane à l’aide d’un dessiccateur et d’une pompe à vide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fabrication de l’appareil iLiNP<ol>
<li>Mélanger la base de silicone et l’agent de durcissement du polydiméthylsiloxane (PDMS) dans un rapport de 10:1 (p / p).</li>
		<li>Dégazez le mélange à l’aide d’une pompe à vide et d’un dessiccateur. REMARQUE: Le PDMS a été dégazé à l’aide d’une pompe à vide pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Versez le PDMS dégazé sur le moule SU-8 dans une boîte de Petri de 100 mm jusqu’à 0,5 à 1 cm d’épaisseur, puis faites cuire au four à 80 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Refroidissez le moule, puis pelez le substrat PDMS du moule SU-8 à l’aide d’une pince à épiler.</li>
		<li>Perforez trois trous (0,5 mm) dans le substrat PDMS. Collez le substrat PDMS et une lame de verre à l’aide d’un nettoyeur à plasma à oxygène pour construire un dispositif iLiNP (voir Figure 1)13.</li>
		<li>Connectez trois capillaires PEEK (I.D. 0,3 mm, O.D. 0,5 mm) aux entrées et sorties du dispositif iLiNP et durcissez avec une superglue. REMARQUE: La longueur des capillaires PEEK est réglable et dépend de l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de solutions lipidiques
<ol><li>Préparer des solutions lipidiques/éthanol : 13,4 mM de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), 10 mM de 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 20 mM de 1,2-dioléoyloxy-3-triméthylammonium propane (DOTAP), 5 mM de 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-méthoxypolyéthylène glycol-2000 (DMG-PEG2k) et 20 mM de cholestérol. Conservez les solutions mères à -20 °C avant l’expérience.</li>
	<li>Pour produire les LNP chargés de siRNA, mélanger les solutions DOTAP, DSPC, cholestérol et DMG-PEG2k à un rapport molaire de 50/10/38,5/1,5. La concentration totale de lipides est ajustée à 8 mM.</li>
</ol>3. Préparation de solutions aqueuses
<ol><li>Préparer des solutions aqueuses : 154 mM de NaCl (solution saline), 25 mM de tampon d’acétate à pH 4,0 à l’aide d’eau distillée sans DNase/RNase.</li>
	<li>Filtrer les solutions à travers des filtres à membrane ou des filtres à seringue de 0,2 μm.</li>
</ol>4. Préparation de la solution siRNA/tampon
<ol><li>Dissoudre 70 μg de siGL4 dans 1 mL de tampon d’acétate de 25 mM (pH 4,0). REMARQUE: siGL4 est utilisé pour l’élimination du gène de la luciférase.</li>
</ol>5. Configuration de l’appareil iLiNP et production de LNP
REMARQUE : Voir la figure 1 pour les schémas.
<ol><li>Remplissez les seringues en verre de 1 mL avec des solutions lipidiques et aqueuses (des étapes 3.1 et 4.1 dans des seringues individuelles), respectivement. REMARQUE: Ajuster le volume lipidique et aqueux de la solution en fonction de la quantité requise pour l’expérience d’évaluation LNP.</li>
	<li>Connectez les seringues en verre aux capillaires EN PEEK à l’aide de connecteurs de seringue.</li>
	<li>Réglez le débit des solutions lipidiques et aqueuses. REMARQUE: Le rapport de débit (FRR) de la phase aqueuse à la phase lipidique varie de 3: 1 à 9: 1.</li>
	<li>Introduisez les solutions lipidiques et aqueuses séparément dans le dispositif iLiNP à l’aide de pompes à seringues.</li>
	<li>Collectez les suspensions LNP dans un microtube à partir de la sortie du dispositif iLiNP (Figure 1).</li>
</ol>6. Dialyse de la suspension LNP et mesure de la taille LNP
<ol><li>Dialysez la suspension LNP à l’aide d’une membrane de dialyse (coupures de 12−14 kDa MW) à 4 °C pendant la nuit contre une solution saline ou D-PBS pour les LNP POPC et les LNP chargés en siRNA, respectivement. REMARQUE: PopC n’est pas dissous dans une solution saline (voir 2.1). La solution de POPC/éthanol est diluée avec une solution saline dans le dispositif iLiNP.</li>
	<li>Collectez les suspensions LNP dialysées dans des microtubes.</li>
	<li>Pipette 20-30 μL de la suspension LNP vers une cellule de micro quartz.</li>
	<li>Mesurez la taille LNP, la distribution de taille LNP et l’indice de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière (DLS).</li>
</ol>7. Mesure du potentiel Z du LNP
REMARQUE: Pour la mesure du potentiel Z, un analyseur de particules (voir tableau des matériaux) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant.
<ol><li>Diluer la suspension LNP obtenue à partir de l’étape 6.1, 35 fois avec un tampon HEPES de 10 mM (pH 7.4).</li>
	<li>Pipette 700 à 1000 μL de la suspension LNP diluée dans une cellule capillaire.</li>
	<li>Mesurez le potentiel Z conformément aux instructions du fabricant.</li>
</ol>8. Efficacité de l’encapsulation du siRNA par le test RiboGreen
REMARQUE: Le test Ribogreen est effectué pour évaluer l’encapsulation du siRNA dans les LNP19. Le test Ribogreen peut mesurer la quantité d’ARN à l’intérieur et à l’extérieur des SNP avec / sans tensioactif (par exemple, TritonX-100).
<ol><li>Diluer 2 mg/mL de siGL4 avec 10 mM de tampon HEPES (pH 7,4) à 500 ng/mL de solution de siGL4.</li>
	<li>Préparer la série de dilution (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/mL) de la solution de siGL4 pour obtenir une courbe d’étalonnage pour les échantillons triton (+) et triton (-).</li>
	<li>Diluer la suspension LNP 100 fois avec un tampon HEPES de 10 mM (pH 7,4).</li>
	<li>Mélanger ce qui suit pour la solution Triton (+) : 980 μL de 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 μL de TritonX-100 à 10 % p/v et 1,25 μL de RiboGreen pour 10 puits d’une microplaque de 96 puits.</li>
	<li>Mélanger ce qui suit pour la solution Triton (-): 1000 μL de 10 mM HEPES (pH 7,4) et 1,25 μL de RiboGreen pour 10 puits d’une microplaque de 96 puits.</li>
	<li>Pipette 100 μL de la série de dilution de la solution siGL4 et des suspensions LNP diluées dans les puits d’une microplaque noire de 96 puits. REMARQUE: La série de dilution de la solution de siGL4 et des suspensions de LNP diluées a été distribuée dans quatre micropuits par condition.</li>
	<li>Pipette 100 μL de la solution de détection (TritonX-100 (+) ou Triton (-)) dans les puits. REMARQUE: La solution de détection (TritonX-100 (+)) a été distribuée dans deux puits par échantillon et par condition, et la solution TritonX-100 (-) a été distribuée dans les deux puits restants par condition d’échantillon.</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Mesurez l’intensité de fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 475 nm.</li>
	<li>Calculez l’efficacité d’encapsulation du siRNA à partir de l’équation suivante19. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62999/62999eq01.jpg">
</li>
</ol>9. Culture cellulaire
<ol><li>Préparer un milieu de croissance contenant du DMEM, du FBS inactivé par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 400 μg/mL de G418.</li>
	<li>Cultiver des cellules HeLa exprimant de manière stable la luciole et la renilla luciférase (HeLa-dluc) dans une boîte de culture cellulaire traitée tc de 100 mm contenant le milieu de croissance à 37 °C dans un incubateur à CO2 à 5 %.</li>
</ol>10. Essai de viabilité cellulaire
<ol><li>Ensemencer 100 μL d’une suspension de cellules HeLa dans le milieu de croissance (6 x 103 cellules/puits) dans une microplaque de 96 puits. REMARQUE: Les cellules ont été comptées à l’aide d’une plaque de compteur de cellules et d’un microscope.</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Diluer les LNP chargés de siRNA avec du DMEM (FBS (-)) aux concentrations de 10 et 100 nM siRNA.</li>
	<li>Distribuer 100 μL de la suspension LNP diluée chargée de siRNA par puits.</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Retirez la suspension LNP et ajoutez 100 μL de DMEM (FBS (+)).</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 20 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Mesurez la viabilité de la cellule à l’aide d’un kit disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant. REMARQUE : Le D-PBS (-) a été utilisé comme témoin négatif.</li>
</ol>11. Test d’élimination du gène de la luciférase
<ol><li>Ensemencez 75 μL d’une suspension de cellules HeLa dans le milieu de croissance (4,5 x 103 cellules/puits) dans une microplaque de 96 puits.</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Diluer les LNP chargés de siRNA avec du DMEM (FBS (-)) aux concentrations de 10 et 100 nM siRNA.</li>
	<li>Distribuer 75 μL de la suspension LNP diluée chargée de siRNA par puits.</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Retirez la suspension LNP et ajoutez 75 μL de DMEM (FBS (+)).</li>
	<li>Incuber la microplaque pendant 20 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Mesurez l’expression de la luciférase à l’aide d’un kit disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant. REMARQUE: Nous avons utilisé D-PBS (-) comme contrôle négatif.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La taille du LNP affecte la biodistribution du LNP, l’effet anti-tumoral et les performances de silençage génique. Par conséquent, la méthode de contrôle de la taille LNP est une technique importante pour la production de nanomédicaments DDS, y compris les systèmes d’administration d’ARN. L’objectif de cet article est de présenter le dispositif iLiNP pour un réglage précis de la taille des LNP et son application à la production de LNP chargés de siRNA. L’appareil iLiNP était capable de contrôler la taille LNP comprise entre 20 et 100 nm (Figure 2)13. Lorsque les conditions d’écoulement, telles que le débit total et le FRR, sont modifiées pour contrôler la taille du LNP, la suspension LNP doit être collectée après environ 5 à 10 s pour stabiliser le débit de la solution. La suspension LNP recueillie à la sortie du dispositif iLiNP a été dialysée immédiatement contre la solution tampon pour éliminer l’éthanol et empêcher l’agrégation de LNP.
Le contrôle de la taille du LNP est l’un des défis majeurs dans le domaine de la DDS. Généralement, le processus de production LNP conventionnel, tel que la méthode d’hydratation du film lipidique, nécessite un processus de réglage de la taille après la production LNP20. D’autre part, la méthode de production de LNP à base de microfluidique peut produire les LNP à taille contrôlée en introduisant les solutions lipidiques et aqueuses dans le dispositif microfluidique6,11,13. Bien que le processus de dialyse soit nécessaire pour éliminer l’éthanol de la suspension LNP, un processus continu par le dispositif microfluidique couplé au système de flux tangentiel promet l’automatisation du processus de production LNP14. Selon la littérature, les tailles POPC LNP étaient de 50-60 nm et 30-60 nm, respectivement pour le dispositif microfluidique focalisant le débit21 et le dispositif mélangeur chaotique10. Comparé à d’autres dispositifs microfluidiques, le dispositif iLiNP permet le contrôle de la taille du POPC LNP dans une large plage de 20 à 100 nm.
Le processus de fabrication du dispositif iLiNP utilisé était la lithographie douce standard. Ainsi, le dispositif iLiNP peut être produit en série par une technique de prototypage rapide et prévenir la contamination croisée des solutions à l’aide d’un dispositif jetable. Le dispositif iLiNP peut produire des LNP chargés en siRNA de la même manière que la méthode de production POPC LNP. Pour la méthode de production LNP utilisant le périphérique iLiNP, l’utilisateur n’a pas besoin de procédures compliquées. Pour ces raisons, la méthode de production LNP à base microfluidique, y compris le dispositif iLiNP, devrait être utilisée comme méthode de production LNP standard. Le protocole de cet article peut être adapté à d’autres dispositifs microfluidiques pour la production de LNP. En outre, la production de LNP chargés d’ARNm est également activée en changeant la solution siRNA/tampon en une solution tampon contenant des ARNm.

La nanoparticule lipidique (LNP) est l’un des nanotransporteurs les plus utilisés pour les systèmes d’administration d’ARN. Récemment, les LNP chargés d’ARNm ont été approuvés comme vaccins pour la prévention de la COVID-191,2,3. En général, la taille du LNP joue un rôle crucial dans la performance des systèmes de biodistribution et d’administration de médicaments (DDS), y compris le silençage génique ou l’expression des protéines4,5,6. Par conséquent, une méthode précise de contrôle de la taille du LNP est nécessaire pour le processus de production du LNP.
Pour la production de LNP à taille contrôlée, les dispositifs microfluidiques ont attiré l’attention au fil des ans7. En 2018, le premier LNP chargé de siRNA approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) (par exemple, Onpattro) a été développé à l’aide du dispositif microfluidique8,9. Dans la méthode de production de LNP à base de microfluidique, une solution lipidique et une solution aqueuse sont introduites séparément dans le dispositif microfluidique, puis mélangées dans le microcanal. Pour améliorer l’efficacité du mélange, le mélangeur chaotique a été utilisé pour la production LNP10,11,12. Le mélangeur chaotique permet de produire des LNP de taille spécifique.
Un dispositif microfluidique simple, appelé production invasive de nanoparticules lipidiques (iLiNP), équipé de structures de déflecteurs, a été développé pour contrôler la taille du LNP avec précision13,14. En comparaison avec le mélangeur chaotique, le dispositif iLiNP était capable de contrôler la taille LNP allant de 20 à 100 nm à des intervalles de 10 nm. En outre, le dispositif iLiNP a produit des LNP6 chargés en siRNA, des LNP15 chargés en ARNm, des LNP16 chargés en ribonucléoprotéines16 et des LNP de type exosome17. L’objectif de cet article est d’introduire le processus de fabrication et de production de LNP chargé d’ARN du dispositif iLiNP et de décrire le processus d’évaluation du LNP produit par le dispositif iLiNP.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC)</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-6081</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-méthoxypolyéthylène glycol-2000 (DMG-PEG2K)</td><td>NOF Corp.</td><td>GM-020</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioléoyloxy-3-triméthylammonium propane (DOTAP)</td><td>NOF Corp.</td><td>CL-8181TA</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC)</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-8080</td><td></td></tr><tr><td>10 x D-PBS (-)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>048-29805</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Blue Test de viabilité cellulaire</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>Système de lithographie sans masque</td><td>de bureau NEOARK CORPORATION</td><td>DDB-701-DL4</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de dialyse</td><td>Repligen</td><td>132697</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo Luciferase Assay</td><td>System Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Lot : 42G6587K</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08973-14</td><td></td></tr><tr><td>Substrat en verre</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>Seringue en verre S1111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>GASSTIGHT 1002</td><td></td></tr><tr><td>Cellule</td><td></td><td></td><td>HeLa-dluc Les cellules HeLa-dluc ont été fournies par le Dr Yusuke Sato de l’Université d’Hokkaido</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Faible teneur en glucose Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma à oxygène</td><td>Femto Science</td><td>CUTE-1MP/R</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline&ndash ; streptomycine, trypsine (2,5 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen Réactif d’ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>siGL4</td><td>Hokkaido System Science Co., Ltd</td><td>Les séquences de brins sens et antisens de siGL4 sont 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' et 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3', respectivement.</td><td></td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>GTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C (PDMS)Dow</td> <td>Corning Toray Co., Ltd.</td><td></td><td>la base de silicone et l’agent de durcissement sont inclus</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>192-01075</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Nippon Kyaku Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connecteur de seringue</td><td>Institute of microchemical Technology Co., Ltd.</td><td>ISC-011</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue</td><td>Chemyx</td><td>CX07200</td><td></td></tr><tr><td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&nbsp ; Eau distillée sans DNase/RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>&nbsp ; Malvern Instruments</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr></tbody></table>

production de nanoparticules lipidiques chargées de sirna à l’aide d’un dispositif microfluidique

Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device

Le développement de nanoparticules lipidiques fonctionnelles (LNP) est l’un des défis majeurs dans le domaine des systèmes d’administration de médicaments (DDS). Récemment, les systèmes d’administration d’ARN basés sur LNP, à savoir les LNP chargés d’ARN, ont attiré l’attention pour la thérapie par ARN. En particulier, les vaccins LNP chargés d’ARNm ont été approuvés pour prévenir la COVID-19, ce qui a conduit au changement de paradigme vers le développement de nanomédicaments de nouvelle génération. Pour les nanomédicaments à base de LNP, la taille du LNP est un facteur important dans le contrôle de la biodistribution LNP et des performances LNP. Par conséquent, une technique précise de contrôle de la taille du LNP est indispensable pour le processus de production du LNP. Ici, nous rapportons un protocole pour la production de LNP à taille contrôlée à l’aide d’un dispositif microfluidique, nommé iLiNP. Les LNP chargés en siRNA sont également produits à l’aide du dispositif iLiNP et évalués par expérience in vitro . Des résultats représentatifs sont présentés pour la taille du LNP, y compris les LNP chargés en siRNA, le potentiel Z, l’efficacité de l’encapsulation du siRNA, la cytotoxicité et l’activité de silençage du gène cible.

La figure 2A,B montre la distribution de la taille du PNL POPC produite dans différentes conditions d’écoulement. La méthode de préparation de LNP à base de microfluidique peut contrôler la taille des LNP par les conditions d’écoulement telles que le débit total (TFR) et le FRR. Par rapport aux dispositifs microfluidiques typiques, y compris le mélangeur chaotique et le dispositif microfluidique focalisant le flux, le dispositif iLiNP a permis un contrôle précis de la taille du LNP allant de 20 à 100 nm (Figure 2). Des LNP de petite taille se sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP formées au FRR de 5 étaient plus petites que celles du FRR de 3, quel que soit le débit total13.
Les LNP chargés en siRNA ont également été préparés à l’aide du dispositif iLiNP (Figure 3A). Pour la préparation de LNP chargée de siRNA, DOTAP, un lipide cationique, a été utilisé pour encapsuler efficacement le siRNA dans les LNP. Le dispositif iLiNP a produit des LNP cationiques chargés en siRNA de taille 90 nm avec une distribution étroite (Figure 3A,B). L’efficacité d’encapsulation du siRNA était de 95 % en raison de l’interaction électrostatique entre le lipide cationique et les siRNA chargés négativement (Figure 3C).
La cytotoxicité et l’activité de silençage génique des SNP chargés en siRNA de taille 90 nm ont été évaluées, comme le montrent les figures 4 et 5. Les LNP chargés de siRNA ont montré une cytotoxicité à une dose de 10 et 100 nM siRNA. Nous avons également confirmé que le niveau d’expression de la luciférase était diminué en fonction de la concentration de siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont supprimé l’expression de la luciférase à 80% à une dose de 100 nM siRNA. L’effet de la taille de la LNP sur l’activité de silençage génique a été rapporté précédemment6,13,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig01.jpg"> Figure 1 : (A) Illustration schématique et (B) photographie du dispositif iLiNP. Le dispositif iLiNP comprend des substrats PDMS et en verre. L’appareil iLiNP est connecté aux capillaires PEEK avec une supercolle. Les solutions lipidiques et siRNA/tampon sont introduites séparément dans le dispositif iLiNP à l’aide de pompes à seringues. La suspension LNP est collectée dans un microtube. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig02.jpg"> Figure 2 : Distributions de taille LNP POPC produites par le dispositif iLiNP aux différents rapports de débit (FRR). La taille du LNP POPC est mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les SNP POPC sont préparés en modifiant le débit total et le FRR: (A) 3 FRR et (B) 5 FRR. Les LNP de petite taille sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP formées au FRR de 5 étaient plus petites que celles du FRR de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig03.jpg"> Figure 3 : Caractérisation des SNP chargés en siRNA. (A) Distribution granulométrique des LNP chargés en siRNA. Les siRNA (siGL4) sont encapsulés dans les LNP par interaction électrostatique entre le lipide cationique (DOTAP) et les siRNA chargés négativement. (B) Potentiel Z des LNP chargés en siRNA. La suspension LNP a été diluée avec un tampon HEPES de 10 mM (pH 7,4) avant la mesure. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± et de développement durable (écart-type). n = 3. (C) efficacité d’encapsulation du siRNA des LNP à base de DOTAP. L’efficacité d’encapsulation a été déterminée par le test RiboGreen. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD. n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig04.jpg"> Figure 4 : Cytotoxicité des LNP chargés en siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont été dilués avec du DMEM (FBS (-)) pour obtenir les concentrations de siGL4 de 10 et 100 nM. Les suspensions LNP sont ajoutées aux cellules HeLa-dLuc et incubées pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. N.T. : Non traité (D-PBS(-)). Les données sont représentées comme la moyenne ± ET. n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig05.jpg"> Figure 5 : Activité d’élimination du gène de la luciférase traitée avec des LNP chargés de siRNA. Les LNP chargés de siRNA sont préparés de la même manière que le test de viabilité cellulaire. Le niveau d’expression de la luciférase est mesuré à l’aide du système de dosage de la luciférase Dual-Glo. N.T. : Non traité (D-PBS(-)). Les données sont représentées comme moyenne ± ET N= 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Les méthodes de production de nanoparticules lipidiques (LNP) à base de microfluidique ont attiré l’attention dans les systèmes d’administration de médicaments (DDS), y compris l’administration d’ARN. Ce protocole décrit les processus de fabrication, de production de LNP (LNP chargé de siRNA) et d’évaluation LNP à l’aide de notre dispositif microfluidique original nommé iLiNP.

Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based ...

La taille des nanoparticules lipidiques affecte la biodistribution, l’effet anti-tumoral et les performances de silençage génique. Par conséquent, la méthode de contrôle de la taille LNP est une technique efficace pour produire des nanomédicaments, y compris des systèmes d’administration d’ARN. Ce dispositif microfluidique original, nommé dispositif iLiNP, était capable de contrôler la taille du LNP allant de 20 à 100 nanomètres à des intervalles de 10 nanomètres.Le dispositif iLiNP peut produire non seulement des LNP chargés en siRNA, mais aussi tous des LNPS chargés en ARNm et des LNP chargés en ribonucléoprotéines. Pour commencer, prenez les solutions d’éthanol lipidique et produisez les LNP chargés en siRNA en mélangeant des solutions de DOTAP, DSPC, cholestérol et DMG-PEG2k à un rapport molaire de 50 à 10 à 38,5 à 1,5. Ajuster la concentration totale de lipides à huit millimolaires.Prenez ensuite les solutions aqueuses de solution saline de 154 millimolaires et de tampon d’acétate de 25 millimolaires à pH 4 et filtrez-les à travers des filtres à membrane de 0,2 micromètre ou des filtres à seringue. Préparer la solution tampon de siRNA en dissolvant 70 microgrammes de siGL4 en un millilitre de tampon d’acétate de 25 millimolaires. Remplissez les seringues en verre d’un millilitre avec des solutions lipidiques et aqueuses, respectivement.Connectez les seringues en verre au pic capillaire à l’aide de connecteurs de seringue, puis réglez le débit des solutions lipidiques et aqueuses et introduisez les solutions lipidiques et aqueuses séparément dans le dispositif iLiNP à l’aide de pompes à seringues. Collectez les suspensions LNP dans un microtube à partir de la sortie de l’appareil iLiNP. Dialyze la suspension LNP à l’aide d’une membrane de dialyse de 12 à 14 kiloDatons de poids moléculaire à quatre degrés celsius est Celsius pendant la nuit contre une solution saline ou DPBS pour les LNP POPC et les LNP chargés de siRNA, respectivement.Collectez les suspensions LNP dialysées dans des microtubes, puis pipet 20 à 30 microlitres de la suspension LNP vers une cellule de micro-quartz. Enfin, mesurez la taille LNP, la distribution de taille LNP et l’indice de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière. La distribution de la taille du LNP POPC produite dans différentes conditions d’écoulement, telles que le débit total et les rapports de débit, est présentée ici.Des tailles LNP précises allant de 20 à 100 nanomètres peuvent être contrôlées à l’aide de cet appareil iLiNP. Les LNP de petite taille sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP qui sont formées au FRR 5 sont plus petites que celles du FRR 3, quel que soit le débit total.La distribution granulométrique des LNP chargés en siRNA est indiquée ici. Les siRNA sont encapsulés dans les LNP par interaction électrostatique entre le LIPique cationique DOTAP et les siRNA chargés négativement. Le dispositif iLiNP a produit des LNP cationiques chargés de siRNA de 90 nanomètres avec une distribution étroite.L’efficacité d’encapsulation du siRNA était de 95% en raison de l’interaction électrostatique entre le lipide cationique et les siRNA chargés négativement. La cytotoxicité et l’activité de silençage génique des LNP chargés de siRNA de 19 nanomètres ont été évaluées. Les LNP chargés de siRNA ont montré une cytotoxicité à une dose de 10 à 100 nanomolaires siRNA.Le niveau d’expression de la luciférase a été diminué en fonction de la concentration de siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont supprimé l’expression de 80% de luciférase à une dose de 100 nanomolaires siRNA. Les optimisations des conditions d’écoulement sont les étapes les plus importantes du protocole pour obtenir les LNP de taille souhaitée.La méthode de production LNP à base microfluidique, y compris le dispositif iLiNP, ne nécessite aucune procédure compliquée et devrait être utilisée comme méthode de production LNP standard.

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Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique

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