Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique
22 mars 2022
Les méthodes de production de nanoparticules lipidiques (LNP) à base de microfluidique ont attiré l’attention dans les systèmes d’administration de médicaments (DDS), y compris l’administration d’ARN. Ce protocole décrit les processus de fabrication, de production de LNP (LNP chargé de siRNA) et d’évaluation LNP à l’aide de notre dispositif microfluidique original nommé iLiNP.
La taille des nanoparticules lipidiques affecte la biodistribution, l’effet anti-tumoral et les performances de silençage génique. Par conséquent, la méthode de contrôle de la taille LNP est une technique efficace pour produire des nanomédicaments, y compris des systèmes d’administration d’ARN. Ce dispositif microfluidique original, nommé dispositif iLiNP, était capable de contrôler la taille du LNP allant de 20 à 100 nanomètres à des intervalles de 10 nanomètres.
Le dispositif iLiNP peut produire non seulement des LNP chargés en siRNA, mais aussi tous des LNPS chargés en ARNm et des LNP chargés en ribonucléoprotéines. Pour commencer, prenez les solutions d’éthanol lipidique et produisez les LNP chargés en siRNA en mélangeant des solutions de DOTAP, DSPC, cholestérol et DMG-PEG2k à un rapport molaire de 50 à 10 à 38,5 à 1,5. Ajuster la concentration totale de lipides à huit millimolaires.
Prenez ensuite les solutions aqueuses de solution saline de 154 millimolaires et de tampon d’acétate de 25 millimolaires à pH 4 et filtrez-les à travers des filtres à membrane de 0,2 micromètre ou des filtres à seringue. Préparer la solution tampon de siRNA en dissolvant 70 microgrammes de siGL4 en un millilitre de tampon d’acétate de 25 millimolaires. Remplissez les seringues en verre d’un millilitre avec des solutions lipidiques et aqueuses, respectivement.
Connectez les seringues en verre au pic capillaire à l’aide de connecteurs de seringue, puis réglez le débit des solutions lipidiques et aqueuses et introduisez les solutions lipidiques et aqueuses séparément dans le dispositif iLiNP à l’aide de pompes à seringues. Collectez les suspensions LNP dans un microtube à partir de la sortie de l’appareil iLiNP. Dialyze la suspension LNP à l’aide d’une membrane de dialyse de 12 à 14 kiloDatons de poids moléculaire à quatre degrés celsius est Celsius pendant la nuit contre une solution saline ou DPBS pour les LNP POPC et les LNP chargés de siRNA, respectivement.
Collectez les suspensions LNP dialysées dans des microtubes, puis pipet 20 à 30 microlitres de la suspension LNP vers une cellule de micro-quartz. Enfin, mesurez la taille LNP, la distribution de taille LNP et l’indice de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière. La distribution de la taille du LNP POPC produite dans différentes conditions d’écoulement, telles que le débit total et les rapports de débit, est présentée ici.
Des tailles LNP précises allant de 20 à 100 nanomètres peuvent être contrôlées à l’aide de cet appareil iLiNP. Les LNP de petite taille sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP qui sont formées au FRR 5 sont plus petites que celles du FRR 3, quel que soit le débit total.
La distribution granulométrique des LNP chargés en siRNA est indiquée ici. Les siRNA sont encapsulés dans les LNP par interaction électrostatique entre le LIPique cationique DOTAP et les siRNA chargés négativement. Le dispositif iLiNP a produit des LNP cationiques chargés de siRNA de 90 nanomètres avec une distribution étroite.
L’efficacité d’encapsulation du siRNA était de 95% en raison de l’interaction électrostatique entre le lipide cationique et les siRNA chargés négativement. La cytotoxicité et l’activité de silençage génique des LNP chargés de siRNA de 19 nanomètres ont été évaluées. Les LNP chargés de siRNA ont montré une cytotoxicité à une dose de 10 à 100 nanomolaires siRNA.
Le niveau d’expression de la luciférase a été diminué en fonction de la concentration de siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont supprimé l’expression de 80% de luciférase à une dose de 100 nanomolaires siRNA. Les optimisations des conditions d’écoulement sont les étapes les plus importantes du protocole pour obtenir les LNP de taille souhaitée.
La méthode de production LNP à base microfluidique, y compris le dispositif iLiNP, ne nécessite aucune procédure compliquée et devrait être utilisée comme méthode de production LNP standard.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour la production de nanoparticules lipidiques (LNPs) chargées de siARN à l'aide d'un dispositif microfluidique appelé iLiNP. La méthode permet un contrôle précis de la taille des LNPs, ce qui est crucial pour des systèmes de délivrance de médicaments efficaces.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Systèmes de délivrance de médicaments
- Nanoparticules lipidiques
- Microfluidique
Contexte
- La taille des nanoparticules lipidiques influence la biodistribution et l'efficacité thérapeutique.
- Le contrôle de la taille des nanoparticules lipidiques est essentiel pour optimiser la délivrance d'ARN.
- Le dispositif iLiNP permet un contrôle de la taille entre 20 et 100 nanomètres.
- Les interactions électrostatiques facilitent l'encapsulation de l'ARNsi dans les nanoparticules lipidiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour produire des LNPs chargées de siARN.
- Évaluer l'impact de la taille des LNPs sur l'efficacité de la silenciation génique.
- Optimiser les conditions d'écoulement pour obtenir les caractéristiques souhaitées des LNPs.
Méthodes utilisées
- Préparation des solutions lipidiques et aqueuses pour la production de nanoparticules lipidiques (LNP).
- Utilisation du dispositif iLiNP pour le mélange et la formation des LNP.
- Dialyse des suspensions de LNP afin d'éliminer les excès de matières.
- Diffusion dynamique de la lumière pour mesurer la taille et la distribution des LNP.
Résultats principaux
- Le dispositif iLiNP a produit des LNPs chargés de siARN ayant une taille de 90 nanomètres et une efficacité d'encapsulation de 95 %.
- De petits LNPs se sont formés dans des conditions de débit total élevé.
- Les LNPs chargés de siARN ont démontré une cytotoxicité et une inhibition efficace des gènes.
- Des conditions d'écoulement optimisées étaient essentielles pour obtenir des tailles de LNPs souhaitées.
Conclusions
- La méthode microfluidique utilisant le dispositif iLiNP simplifie la production de LNPs.
- On s'attend à ce que cette approche standardise la production de LNPs dans la recherche.
- Des études ultérieures pourront explorer l'application de cette méthode à divers systèmes de délivrance d'ARN.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Le contrôle précis de la taille des nanoparticules lipidiques (LNP) est essentiel pour optimiser la biodistribution, l'efficacité thérapeutique et les performances de silencing génique dans les systèmes de délivrance de médicaments à base d'ARN. Le dispositif microfluidique iLiNP permet une production reproductible de LNP dont la taille est ajustable entre 20 et 100 nanomètres, soutenant ainsi les flux de travail de validation précoce des cibles et d'identification des candidats prometteurs. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en réduisant la variabilité des performances des nanoparticules, un facteur clé pour minimiser les risques lors du développement translationnel.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'activité biologique dépendante de la taille pour les LNPs chargés de siARN dans les essais de validation ciblée.
- Valeur opérationnelle : Fournit des formulations normalisées de LNPs afin de réduire le bruit dans les études de criblage phénotypique et de détection mécanistique des risques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des LNPs chargés en siRNA monodisperses de taille définie et avec une efficacité d'encapsulation de 95 %, permettant une évaluation fiable des composés.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation des tests grâce à un contrôle reproductible de la taille des LNPs par ajustement du débit dans le dispositif iLiNP.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet de corréler la taille des nanoparticules lipidiques (LNP) à l'efficacité de la silenciation génique et à la cytotoxicité dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Permet une production à grande échelle de LNPs chargées d'ARNm, de siARN et de ribonucléoprotéines pour assurer la continuité préclinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode microfluidique iLiNP s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles à l'identification de candidats-médicaments, jusqu'au développement préclinique, en particulier pour les thérapies à base d'ARN où la délivrance dépendante de la taille influence l'efficacité.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant une variation systématique de la taille des nanoparticules lipidiques (LNP) afin d'évaluer leur impact sur l'absorption cellulaire et la liaison à la cible.
- Criblage : Fournit des formulations de LNP prêtes à l'emploi, présentant une distribution de taille homogène et une forte encapsulation de siRNA, pour un criblage reproductible de composés.
- Analyse : Fournit des mesures quantitatives de la taille, de la polydispersité et du potentiel zêta par diffusion dynamique de la lumière, permettant de prendre des décisions d'avancement ou d'arrêt.
- Recherche translationnelle : Relie l'optimisation des LNP en phase de découverte à l'évaluation préclinique grâce à des nanomédicaments standardisés et contrôlés en taille.
- Réutilisation inter-projets : Met en place une plateforme réutilisable pour la production de diverses LNP chargées en ARN (siRNA, ARNm, RNP) dans le cadre de multiples projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance dans la cible en reliant les propriétés physicochimiques des nanoparticules lipidiques aux résultats fonctionnels, tels que la silenciation génique.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité et la montée en échelle de la production de nanoparticules lipidiques grâce à la précision de la microfluidique.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques en phase avancée en permettant une élimination précoce des risques liés aux performances du vecteur de délivrance.
- Impact sur le portefeuille : Guide la priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques à ARN en fonction de l'efficacité de délivrance.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en formulation lipidique, en manipulation microfluidique et en chargement d'acides nucléiques.
- Dépend de pompes à seringue, de seringues en verre et d'un dispositif de dialyse pour la purification des nanoparticules lipidiques.
- Nécessite une standardisation des rapports de débits et des conditions de débit total entre les équipes.
- Implique des ajustements à prévoir lors de modifications des compositions lipidiques ou des types de charge d'ARN.
- Est limité par la nécessité d'une dialyse post-production et de diffusion de la lumière dynamique pour le contrôle qualité.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
