Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

La recherche en génétique a grandement bénéficié de la publication de la séquence du génome humain. Le pyroséquençage est un système unique qui permet l'analyse de la variation génétique ainsi que du déséquilibre allélique de l'ARN, de l'ADN, de l'état de méthylation et du nombre de copies de gènes. Dans cette vidéo, nous démontrons une réaction de base de pyroséquençage destinée à l'analyse génétique.

Bonjour, je suis Kristy King du laboratoire des Drs Charles Eby et Brian Gage du Département de médecine interne de l'École de médecine de l'Université de Washington. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de pyroséquençage. Cette procédure est utile car elle constitue l'une des méthodes les plus complètes et toutefois simples pour analyser les SNP.

Le pyroséquençage repose sur le séquençage par synthèse, exploitant la libération de pyrophosphate chaque fois qu'un nucléotide est incorporé dans un brin d'ADN à trois' extrémités libres. Une fois la plaque chargée, les nucléotides sont incorporés selon une séquence fournie par le logiciel. Une fois libéré, le pyrophosphate est utilisé dans une réaction entraînant la libération d'ATP, laquelle est utilisée par la luciférase pour convertir la luciférine en oxyluciférine, produisant ainsi une émission de lumière. La lumière émise est captée par une caméra CCD et enregistrée sous forme de pics, également appelés pyros.

Tous les nucléotides non incorporés dans le brin d'ADN sont dégradés par l'AP pyra afin d'éviter le bruit de fond. Cette procédure comprend les étapes suivantes : conception du test, électrophorèse sur gel PCR pour le contrôle qualité et pyroséquençage.

Commençons donc par le séquençage pyro. Pour effectuer un séquençage pyro, un produit PCR doit d'abord être préparé. La PCR destinée au séquençage pyro nécessite davantage de cycles que la plupart des PCR afin de s'assurer que l'ensemble de l'amorce est consommé, environ 50 cycles.

Le pyroséquençage exige également qu'un des deux amorces PCR soit biotinylé. Enfin, il est important de noter qu'une amorce interne est également nécessaire. Une conception efficace des tests peut être réalisée à l'aide d'un logiciel fourni dans le cadre du pyroséquençage, afin de s'assurer qu'aucune contamination ne soit présente.

Et pour confirmer la présence du produit de PCR, un gel doit être réalisé sur quelques échantillons ainsi que sur un témoin négatif. Pour préparer la plaque de pyroséquençage, ajouter 12 microlitres du mélange d'amorces de pyroséquençage dans la plaque de pyroséquençage à 96 puits. Ce mélange nécessite 43,2 microlitres de l'amorce interne, ainsi que 1396,8 microlitres d'un tampon de recouvrement ; couvrir la plaque de pyroséquençage avec un film adhésif.

Si la mise en place prend plus de 50 minutes par puits de la plaque PCR 96 puits, ajouter 70 microlitres du mélange SRO Speed Mix contenant 240 microlitres de billes Sero Speeds revêtues de streptavidine, 560 microlitres de tampon de liaison, composé de chlorure de sodium triss, d’EDTA et de Tween 20, et 3 600 microlitres d’eau, puis refermer soigneusement le couvercle. Placer la plaque PCR 96 puits contenant le mélange de billes sur un agitateur de plaque pendant cinq minutes à température ambiante.

Veillez à bien fermer le couvercle afin d'éviter toute contamination croisée entre les puits. Cette étape permettra une liaison complète des billes sphériques revêtues de streptavidine aux marqueurs biotine situés sur l'amorce PCR. Installez un poste de travail pour la préparation des plaques.

Cela inclut les réservoirs de réactifs, la plaque de mélange produit PCR et billes, ainsi que la plaque d'amorces de pyroséquençage. Veillez à ce que la plaque de mélange produit PCR et billes ainsi que la plaque d'amorces de pyroséquençage soient correctement alignées, de sorte que les côtés négatifs aient la même orientation. Avant de transférer les échantillons, secouez l'outil sous vide, éteint, dans de l'eau propre afin d'éliminer toute bille ou débris éventuellement présents à sa surface.

Jetez l'eau restante, remplissez à nouveau la cuve et activez le vide. Laissez l'outil sous vide dans la cuve jusqu'à ce que toute l'eau soit éliminée, soit environ 30 secondes. Placez les embouts filtrants de l'outil sous vide dans les puits de la plaque contenant le mélange de billes PCR et laissez-les en place jusqu'à ce que tout le liquide soit évacué de la plaque.

Un balancement doux peut être utilisé pour éviter la tension superficielle. Placer la pompe à vide dans la rigole contenant de l'éthanol à 70 % lorsque le liquide commence à s'écouler à travers le tube. Laisser les embouts filtrants aspirer l'éthanol pendant cinq secondes.

Répétez l'opération pour l'hydroxyde de sodium 0,2 M, qui dénature l'ADN en PCR simple brin, et pour le tampon de lavage. Pour nettoyer et neutraliser le produit de PCR. Débranchez le tuyau d'aspiration de l'outil sous vide et placez l'outil sous vide dans la plaque de pyro-séquençage contenant l'amorce de pyro-séquençage dans un mélange tampon tamponné.

Si le tuyau d'aspiration est encore raccordé, lorsque vous le placez dans la plaque de pyroséquençage, le mélange d'amorces sera aspiré à travers les pointes, ce qui entraînera la perte de votre produit PCR. Secouez ou balancez doucement les extrémités du dispositif d'aspiration dans les puits de la plaque de pyroséquençage afin de disperser votre produit PCR.

Retirez l'outil sous vide de la plaque de pyroséquençage une fois le brassage ou le balancement terminé, puis reconnectez l'outil sous vide au tuyau et placez l'outil dans de l'eau propre pour le nettoyer avant la prochaine plaque. Placez la plaque de pyroséquençage sur un bloc chauffant pendant deux minutes à 80 degrés Celsius. Après deux minutes, retirez la plaque du bloc chauffant et placez-la sur une surface froide.

Une fois refroidi, un film adhésif peut être utilisé pour couvrir la plaque, à moins que celle-ci ne doive être utilisée dans les 15 minutes afin d'éviter l'évaporation. Il est maintenant temps de commencer le séquençage pyro. La première étape du séquençage pyro consiste à entrer les détails du test dans l'ordinateur.

Sous l'entrée simplex, sélectionnez la nouvelle entrée et saisissez les informations du test, incluant un nom d'identifiant et la séquence à analyser, fournie par le logiciel de conception du test et permettant un contrôle qualité. Sélectionnez ensuite l'ordre de dispensation, qui fournit la séquence entourant le SNP ainsi que les bases témoins. Enfin, sélectionnez les histogrammes pour obtenir une représentation visuelle de l'aspect que devrait avoir votre pyrogramme. Il est maintenant temps de lancer une analyse de SNP.

Sous les exécutions de découpage et l'onglet général, saisissez un nom d'exécution et sélectionnez les paramètres de l'instrument pour l'exécution. Sous l'onglet configuration, sélectionnez l'entrée d'analyse et cliquez-glissez sur la plaque. Pour entrer l'analyse souhaitée dans votre plaque, il est important de noter que toute la plaque n'a pas besoin d'être utilisée, ce qui vous permet de désactiver différents puits pour l'analyse, et qu'il est également possible d'exécuter plusieurs analyses différentes sur la même plaque.

Cliquez sur l'onglet Affichage, puis sélectionnez Exécuter. Cette page indique les volumes appropriés de nucléotides, d'enzyme et de substrat nécessaires pour l'exécution. Nettoyez soigneusement les embouts de nucléotides ou de capillaire ainsi que les embouts de réactif avant utilisation.

Remplissez les embouts d'eau et appliquez une pression sur le dessus de l'embout pour vérifier s'ils sont obstrués. Si l'eau ne sort pas par le bas de l'embout, videz-le et remplissez-le plusieurs fois pour tenter de forcer l'eau à passer. Sinon, vous pouvez soumettre les embouts à une sonication si l'obstruction persiste.

Jetez les pointes et prenez-en de nouvelles. L'enzyme et le substrat doivent être resuspendus dans de l'eau avant utilisation. Si un brassage entraîne la formation de bulles d'air pouvant provoquer des obstructions des pointes ou une distribution incohérente, l'enzyme et le substrat non utilisés peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius.

Pour une utilisation ultérieure des embouts de distribution capillaire dans un tube microfuge, préparez une dilution au demi avec les nucléotides et le tampon TE P huit. Mélangez soigneusement avant usage. Remplissez les embouts de nucléotides et de réactifs avec les volumes appropriés selon les quantités suggérées par le logiciel.

Dispensez délicatement le liquide le long des parois des embouts afin d'éviter d'aspirer des bulles d'air qui pourraient les obstruer. Vérifiez systématiquement la présence de bulles d'air dans les embouts de distribution des nucléotides. S'il y a des bulles d'air, tapez doucement sur les parois des embouts jusqu'à ce que les bulles remontent à la surface ou désengorgez-les à l'aide d'un embout de pipette propre.

Exécutez une plaque témoin après avoir rempli la cartouche. Placez la cartouche dans l'instrument de séquençage pyro et la plaque témoin sur la plateforme de plaque 96 puits. La pose d'un film adhésif sur la plaque permet d'observer facilement la distribution des réactifs et des nucléotides.

Sélectionnez l'onglet instrument situé sur le côté gauche de l'écran, puis cliquez sur gérer. Sélectionnez l'instrument dans le menu déroulant. Cliquez sur tester, et un avertissement apparaîtra.

Demander de vérifier que la plaque de test a été placée dans l'instrument. Cliquer sur OK. Une fois l'opération terminée, retirer la plaque de test et, au centre de la plaque, des gouttelettes de liquide doivent apparaître au-dessus de six puits représentant les quatre nucléotides, l'enzyme et le substrat.

S'il y a moins de six petits points, un bouchon est survenu et les embouts doivent être vérifiés et débarrassés de tout obstacle. Placer la plaque sur la plateforme de séquençage pyro à 96 puits. Fermer tous les leviers et cliquer sur « exécuter » pour la plaque individuelle.

Lancez la configuration : l'enzyme, le substrat et les nucléotides seront dispensés dans l'ordre prédéterminé. Une fois que le pyroséquenceur a analysé l'analyse, il est temps d'examiner les résultats. Les puits bleus représentent un génotype valide et un pyrogramme concluant.

Les puits orange nécessitent une intervention humaine et peuvent être modifiés en cliquant sur le puits concerné et en ouvrant l'histogramme prédit. Un génotype peut être validé, rejeté ou vérifié, et le génotype lui-même peut être modifié en conséquence. Une fois un puits modifié, un cercle foncé apparaîtra sur la carte de la plaque.

Les contrôles négatifs doivent être évalués comme négatifs. Des pics non spécifiques peuvent apparaître dans les puits négatifs ; toutefois, ils sont généralement causés par un repliement du primer interne. Nous venons donc de vous montrer comment séquencer par pyro-séquençage un polymorphisme dans l'ADN génomique humain.

Le pyroséquençage de l'ADN est utile par rapport à d'autres procédures de séquençage car il est adaptable à un large éventail d'applications. Il est également suffisamment robuste pour traiter l'ADN provenant de n'importe quelle source, y compris l'ADN à faible concentration et dégradé. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer avec un produit de PCR purifié de bonne qualité.

Inclure un témoin négatif pour chaque test et s'assurer que tous vos réactifs sont de bonne qualité. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.