Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

La recherche en génétique a grandement bénéficié de la libération de la séquence du génome humain. Le pyroséquençage est un système unique qui permet d’analyser la variation génétique ainsi que le déséquilibre allélique de l’ARN, l’ADN, le statut de méthylation et le nombre de copies de gènes. Dans cette vidéo, nous démontrons une réaction de pyroséquençage de base pour l’analyse génétique.

Bonjour, je suis Kristy King du laboratoire du Dr Charles Eby et du Dr Brian Gage du Département de médecine interne de la Faculté de médecine de l’Université de Washington. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de pyroséquençage. Cette procédure est utile car c’est l’une des méthodes les plus approfondies et les plus simples utilisées pour analyser les SNP.

Le pyroséquençage est basé sur le séquençage par synthèse, tirant parti de la libération de pyrophosphate chaque fois qu’un nucléotide est incorporé dans un brin d’ADN ouvert à trois primes. Une fois qu’une plaque est chargée, les nucléotides sont incorporés sur la base d’une séquence fournie par le logiciel Une fois libéré, le pyrophosphate est utilisé dans une réaction qui entraîne la libération d’un TP, qui est utilisé par la luciférase pour convertir Lucifer en oxy Lucifer, ce qui entraîne l’émission de lumière. La lumière admise est collectée par une caméra CCD et enregistrée sous forme de pics, également appelés pyros.

Tous les nucléotides non incorporés dans le brin d’ADN sont dégradés par l’AP pyra pour éviter le bruit de fond. Cette procédure comprend les étapes suivantes. Conception de dosage, électrophorèse sur gel PCR pour le contrôle de la qualité et le pyroséquençage.

Commençons donc par le pyroséquençage. Afin d’effectuer un pyroséquençage, un produit PCR doit d’abord être préparé. La PCR pour le pyroséquençage nécessite plus de cycles que la plupart des PCR afin de s’assurer que toute l’amorce est utilisée jusqu’à environ 50 cycles.

Le pyroséquençage nécessite également que l’une des amorces de la PCR soit biotinylée. Enfin, il est important de noter qu’un apprêt interne est également nécessaire. Une conception efficace du test peut être réalisée à l’aide d’un logiciel fourni par pyroséquençage pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination.

Et pour confirmer la présence d’un produit PCR, un gel doit être analysé sur quelques échantillons ainsi qu’un contrôle négatif. Pour fabriquer la plaque de pyroséquençage, ajoutez 12 microlitres du mélange d’amorce de pyroséquençage à la plaque de pyroséquençage à 96 puits. Cela nécessite un mélange de 43,2 microlitres d’amorce interne, ainsi que 1396,8 microlitres d’un tampon à genoux pour recouvrir la plaque de pyroséquençage d’un film adhésif.

Si l’installation doit prendre plus de 50 minutes pour chaque puits du produit PCR à 96 puits, ajoutez 70 microlitres de mélange de vitesse SRO contenant 240 microlitres de sérovitesse enrobée de streptavidine. 4 560 microlitres de tampon de liaison, composé de chlorure de sodium de triss, d’EDTA et de 20 et 3 600 microlitres d’eau et replacez le couvercle en toute sécurité. Placez la plaque de produit PCR à 96 puits avec le mélange de billes dans un agitateur à plaque pendant cinq minutes à température ambiante.

Assurez-vous que le couvercle est bien fixé pour éviter toute contamination croisée entre les puits. Cette étape permettra un agenouillement complet du streptocoque ENC, des billes de sphéros enrobées sur l’étiquette de biotine qui se trouve sur l’amorce PCR. Installez un poste de travail pour préparer les plaques.

Cela comprend les auges à réactifs, le plateau de mélange de produits et de billes PCR et le plateau d’amorce de pyroséquençage. Assurez-vous que le produit PCR et la plaque de mélange de billes ainsi que le plateau d’amorce de pyroséquençage sont correctement alignés afin que les négatifs soient dans la même orientation. Avant de transférer des échantillons, secouez l’outil d’aspiration, qui est éteint à l’eau claire pour libérer les billes ou les débris qui pourraient s’y trouver.

Jetez l’eau restante, remplissez l’auge et allumez l’aspirateur. Laissez l’outil d’aspiration dans l’auge jusqu’à ce que toute l’eau ait été éliminée, ce qui est environ 30 secondes. Placez les pointes filtrantes de l’aspirateur dans les puits de la plaque de mélange de billes PCR et laissez-les reposer jusqu’à ce que tout le liquide ait été retiré de la plaque.

Un balancement doux peut être utilisé pour éviter la tension superficielle. Placez le vide dans l’auge à 70 % d’éthanol lorsque le liquide commence à s’écouler dans le tube. Laissez les pointes du filtre aspirer l’éthanol pendant cinq secondes.

Répétez l’opération pour l’hydroxyde de sodium de 0,2 molaire, qui dénature l’ADN en PCR simple brin et pour le tampon de lavage. Pour nettoyer et neutraliser le produit PCR. Débranchez le tuyau d’aspiration de l’outil d’aspiration et placez l’outil d’aspiration dans la plaque de pyroséquençage contenant l’amorce de pyroséquençage dans un mélange tampon à genoux.

Si le tuyau d’aspiration est toujours connecté, lorsqu’il est placé dans la plaque de pyroséquençage, le mélange d’amorce sera aspiré. Les conseils qui vous font perdre votre produit PCR. Secouez ou balancez doucement les pointes du vide dans les puits de la plaque de pyroséquençage pour disperser votre produit PCR.

Retirez l’outil d’aspiration de la plaque de pyroséquençage une fois que l’agitation ou le balancement est terminé, reconnectez l’outil d’aspiration au tuyau et placez l’outil dans l’eau propre pour le nettoyer pour la plaque suivante. Placez la plaque de pyroséquençage sur un bloc de chaleur pendant deux minutes à 80 degrés Celsius. Après deux minutes, retirez la plaque du bloc de chaleur et placez-la sur une surface fraîche.

Une fois refroidie, un film adhésif peut être utilisé pour recouvrir la plaque, à moins que la plaque ne soit coulée dans les 15 minutes pour éviter l’évaporation. Et maintenant, il est temps de commencer le pyro séquençage. La première étape du pyroséquençage consiste à saisir les détails du test dans l’ordinateur.

Sous l’entrée simplexe, sélectionnez la nouvelle entrée et entrez les informations de test, y compris un nom d’ID et la séquence à analyser, qui sont fournies par le logiciel de conception de test et permettent le contrôle de la qualité Sélectionnez l’ordre de distribution, qui fournit la séquence autour du SNP plus les bases de contrôle. Enfin, sélectionnez des histogrammes pour fournir un visuel de ce à quoi votre pigramme devrait ressembler. Il est maintenant temps d’entrer dans une course de coupe.

Sous l’onglet Snip runs et l’onglet General, entrez un nom de run et sélectionnez les paramètres de l’instrument pour le run. Sous l’onglet Configuration, sélectionnez l’entrée d’analyse et cliquez-glissez-la sur la plaque. Pour entrer le test de votre choix dans votre plaque, il est important de noter qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser la plaque entière dans laquelle vous pouvez inactiver différents puits pour l’analyse, ainsi que de nombreux tests différents peuvent être effectués sur la même plaque.

Cliquez sur l’onglet Affichage, puis sélectionnez. Courir. Cette page répertorie les volumes appropriés de nucléotides, d’enzymes et de substrat nécessaires à l’exploitation. Nettoyez les pointes du nucléotide ou du capillaire et du réactif avant utilisation.

Remplissez les pointes d’eau et appliquez une pression sur le dessus de la pointe pour vérifier qu’il n’y a pas de blocage de la pointe. Si l’eau ne gicle pas du bas de l’embout, videz et remplissez plusieurs fois pour essayer de forcer l’eau à travers. Ou vous pouvez sonicer les pointes si la pointe reste bloquée.

Jetez et obtenez de nouveaux conseils. L’enzyme et le substrat doivent être remis en suspension avec de l’eau avant utilisation. Si des bulles d’air secouées peuvent entraîner des blocages de pointes ou une distribution incohérente, l’enzyme et le substrat en suspension inutilisés peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius.

Pour une utilisation future des pointes de distribution capillaire dans un tube de micro-fuge, effectuez une dilution un à un avec les nucléotides et le tampon P huit. Bien mélanger avant utilisation. Remplissez les pointes de nucléotides et de réactifs avec les volumes appropriés en fonction des quantités suggérées par le logiciel.

Versez doucement du liquide sur les côtés des pointes pour éviter que le pipetage ne fasse des bulles d’air et ne provoque des blocages. Assurez-vous de vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les pointes de distribution de nucléotides. S’il y a des bulles d’air, il suffit de tapoter les côtés des pointes jusqu’à ce que les bulles d’air fassent surface ou de les déloger avec une pointe de pipette propre.

Exécutez une plaque de test après avoir rempli la cartouche. Placez la cartouche dans l’instrument de pyroséquençage et la plaque d’essai dans la plate-forme de plaque à 96 puits. Le fait de placer un film adhésif sur la plaque permet de voir facilement la distribution du réactif et des nucléotides.

Sélectionnez l’onglet Instrument sur le côté gauche de l’écran, puis cliquez sur Gérer. Sélectionnez l’instrument dans le menu déroulant. Cliquez sur tester et un avertissement apparaîtra.

Vous demandant de vérifier que la plaque de test a été placée dans l’instrument. Cliquez sur OK. Une fois terminé, retirez la plaque de test et au milieu de la plaque doivent se trouver des points liquides sur six des puits représentant quatre nucléotides, l’enzyme et le substrat.

S’il y a moins de six petits points, un blocage s’est produit et les pointes doivent être vérifiées et retirées de tout blocage. Placez la plaque dans la plate-forme de plaque pyro séquençage à 96 puits. Fermez tous les leviers et cliquez sur Exécuter sur la plaque individuelle.

Exécutez la configuration du substrat enzymatique et les nucléotides seront distribués dans l’ordre prédéterminé. Une fois que la course a été analysée par le pyroséquenceur, il est temps d’examiner la course. Les puits bleus représentent un génotype de passage et pyro.

Les puits orange nécessitent une intervention humaine et peuvent être modifiés en cliquant sur le puits d’intérêt et en ouvrant l’histogramme prédit. Un génotype peut être réussi, échoué ou vérifié, ainsi que le génotype lui-même modifié de manière appropriée. Une fois qu’un puits est modifié, un cercle sombre s’affiche sur la carte de la plaque.

Les contrôles négatifs doivent être considérés comme négatifs. Il peut y avoir des pics non spécifiques dans les puits négatifs, cependant, ils sont généralement causés par la boucle de l’amorce interne. Nous venons donc de vous montrer comment séquencer un polymorphisme en génomique humaine.

Le séquençage pyrotechnique de l’ADN est utile par rapport à d’autres procédures de séquençage car il s’adapte à un large éventail d’applications. Il est également suffisamment robuste pour gérer l’ADN de n’importe quelle source, y compris l’ADN à faible concentration et dégradé. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de commencer avec un bon produit PCR propre.

Incluez un contrôle négatif pour chaque test et assurez-vous que tous vos réactifs sont bons. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.