Name: Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez l'essai d'empreinte d'adhérence pour imager l'adhésion moléculaire lors du laminage cellulaire rapide. Cette méthode permet de quantifier les forces d'adhésion moléculaires avec une microscopie TIRF.

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Ces travaux ont été soutenus par la Fondation canadienne de l’innovation (FCI 35492), la Subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2017-04407), le Fonds Nouvelles frontières en recherche (NFRFE-2018-00969), la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (SCH-2020-0559) et le Fonds Eminence de l’Université de la Colombie-Britannique.

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<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li>
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<li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling%2Fadhesion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li>
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<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li>
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<li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prepare+reproducible%2C+homogeneous%2C+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li>
<li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li>
<li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).</li>
<li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A%3A+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le test d’empreinte d’adhérence permet de visualiser les événements d’adhésion moléculaire entre PSGL-1 et P-selectin pendant l’adhésion au roulement cellulaire. Ce processus est initié par la capture médiée par la sélection P suivie d’un laminage sous contrainte de cisaillement fluidique. Les problèmes potentiels au cours de l’expérience impliquent généralement un mauvais roulement cellulaire ou des pistes fluorescentes manquantes, même lorsque les cellules roulent bien. Ces problèmes résultent souvent de contrôles de q...

La cascade d’adhésion roulante décrit comment les cellules circulantes s’attachent et roulent le long de la paroi des vaisseaux sanguins1. Le laminage passif est principalement médié par les sélectines, une classe majeure de molécules d’adhésion cellulaire (MCA)1. Sous le flux de cisaillement du sang, les leucocytes exprimant le ligand 1 de la glycoprotéine P-sélectine (PSGL-1) forment des liaisons hautement transitoires avec la P-sélectine, qui peuvent être exprimées à la surface des cellules endothéliales enflammées. Ce processus est essentiel pour que les leucocytes migrent vers un site d’inflammation2. En outre, PSGL-1 est également un récepteur mécanosensible capable de déclencher l’étape d’adhésion ferme ultérieure de la cascade d’adhésion roulante lors de son engagement avec P-selectin3.
Les mutations génétiques affectant la fonction CAM peuvent affecter gravement le système immunitaire, comme dans la maladie rare du déficit en adhésion leucocytaire (LAD), où le dysfonctionnement des molécules d’adhésion médiant le roulement conduit à des individus gravement immunodéprimés4,5,6. En outre, il a été démontré que les cellules tumorales circulantes migrent à la suite d’un processus de roulement similaire, conduisant à des métastases7,8. Cependant, parce que le laminage cellulaire est rapide et dynamique, les méthodes expérimentales conventionnelles de mécanobiologie ne conviennent pas à l’étude des interactions moléculaires pendant le laminage cellulaire. Bien que les méthodes de manipulation à cellule unique et à molécule unique telles que la microscopie à force atomique et la pince optique aient pu étudier les interactions moléculaires telles que l’interaction dépendante de la force de la P-sélectine avec PSGL-1 au niveau de la molécule unique9, elles ne conviennent pas à l’étude des événements d’adhésion en direct pendant le roulement cellulaire. De plus, l’interaction caractérisée in vitro ne peut pas répondre directement à la question de l’adhésion moléculaire in vivo. Par exemple, quelle plage de tension moléculaire est biologiquement pertinente lorsque les cellules fonctionnent dans leur environnement natif? Les méthodes de calcul telles que la simulation de la dynamique des adhésifs10 ou le modèle simple à l’état d’équilibre11 ont capturé certains détails moléculaires et leur influence sur le comportement de roulement, mais dépendent fortement de la précision des paramètres et des hypothèses de modélisation. D’autres techniques telles que la microscopie à force de traction peuvent détecter les forces lors de la migration cellulaire, mais ne fournissent pas une résolution spatiale suffisante ou des informations quantitatives sur la tension moléculaire. Aucune de ces techniques ne peut fournir d’observations expérimentales directes de la dynamique temporelle, de la distribution spatiale et de l’hétérogénéité de magnitude des forces moléculaires, qui sont directement liées à la fonction et au comportement des cellules dans leur environnement natif.
Par conséquent, la mise en œuvre d’un capteur de force moléculaire capable de mesurer avec précision les interactions médiées par la sélection est cruciale pour améliorer notre compréhension de l’adhérence au roulement. Nous décrivons ici le protocole pour le test d’empreinte d’adhérence12 où des billes revêtues de PSGL-1 sont roulées sur une surface présentant des attaches de jauge de tension fonctionnalisées p-selectin (TGT)13. Ces TGT sont des capteurs de force irréversibles basés sur l’ADN qui entraînent un historique permanent des événements de rupture sous forme de lecture de fluorescence. Ceci est réalisé par la rupture du TGT (dsDNA), puis le marquage ultérieur du TGT rompu (ssDNA) avec un brin complémentaire marqué par fluorescence. L’un des principaux avantages de ce système est sa compatibilité avec l’imagerie à diffraction limitée et l’imagerie à super résolution. Le brin complémentaire marqué par fluorescence peut être lié de manière permanente (>12 pb) pour l’imagerie à diffraction limitée ou transitoirement lié (7-9 pb) pour l’imagerie à super-résolution par DNA PAINT. Il s’agit d’un système idéal pour étudier l’adhérence au laminage car les TGT sont rompus pendant le laminage actif, mais la lecture de fluorescence est analysée après le laminage. Les deux méthodes d’imagerie offrent également à l’utilisateur plus de liberté pour étudier l’adhérence au roulement. En règle générale, l’imagerie à diffraction limitée est utile pour extraire la force de rupture moléculaire par l’intensité de fluorescence13, tandis que l’imagerie à super-résolution permet une analyse quantitative de la densité des récepteurs. Avec la capacité d’étudier ces propriétés d’adhérence au laminage, cette approche fournit une plate-forme prometteuse pour comprendre le mécanisme de régulation de la force sur l’adhésion moléculaire des cellules de laminage sous écoulement de cisaillement.

<table><tbody><tr><td>Guide de perçage à 4 canaux</td><td>Imprimé</td><td></td> sur mesure <td>en 3D avec filament ABS</td></tr><tr><td>Lame à 4 trous</td><td>Percée</td><td></td><td>sur mesure Lame de microscope propre à l’aide d’un Dremel avec des forets recouverts de diamant sur un guide de perçage à 4 canaux dont la disposition correspond aux centres des 8-32 trous filetés sur la pince en aluminium.</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Intercalaire acrylique</td><td>Sur</td><td></td> mesure <td>Découpez deux blocs de feuilles acryliques de dimension 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Sur chaque bloc, percez deux trous de 3 mm qui sont alignés avec précision avec les 4 à 40 trous du support en aluminium.</td></tr><tr><td>Porte-copeaux en aluminium</td><td>Fabriqué sur</td><td></td> mesure <td>Bloc d’aluminium anodisé usiné en un support en forme de C avec les dimensions extérieures de 640 mm x 500 mm x 65 mm et les dimensions d’ouverture de 400 mm x 380 mm x 65 mm. Les entrées et les sorties sont taraudées avec un filetage 8-32.</td></tr><tr><td>Aminosilane</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Solution antibiotique/antimycosique</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>Pen/Strep/Fungiezone</td></tr><tr><td>Billes de polystyrène enduit de ProtG</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Tampon, DNA PAINT</td><td></td><td></td><td>0.05 % Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, tampon EDTA 1 mM</td></tr><tr><td>, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer, HBSS mobile</td><td></td><td></td><td>avec 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1 % de tampon BSA</td></tr><tr><td>, Wash</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2 et 2 mM de CaCl2, 0,05 % Tween 20</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique concentré</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2,5LG</td><td>95-98 %</td></tr><tr><td>Pince à épiler pour lamelles</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Foret diamanté mèches</td><td>Technologie abrasive</td><td>C5250510</td><td>0,75 mm forage au diamant</td></tr><tr><td>ADN ADN, amine-ssDNA (brin supérieur)</td><td>IDT ADN</td><td>Custom oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td></tr><tr><td>DNA, biotin-ssDNA (brin inférieur)</td><td>IDT DNA</td><td>Custom oligo</td><td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCTGCGTCGCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, brin imageur pour DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personnalisé</td><td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>ADN, brin imageur pour marquage permanent</td><td>IDT ADN</td><td>oligo personnalisé</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 pouce de largeur, ruban permanent double face</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Époxy</td><td>Gorilla</td><td>42001</td><td>Temps de durcissement de 5 minutes</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Verre, lamelles de protection</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Verre, Lame de microscope</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Verre, Pot de coloration</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Pot de coloration Wheaton (900620)</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)</td><td>Hémocytomètre Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HL-60</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Support de diapositive de chambre d’humidité</td><td>Imprimé en</td> 3D sur <td></td> mesure <td>avec filament ABS</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30 %</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Entrées/sorties</td><td>Sur</td><td></td> mesure <td>Percez huit vis de réglage 8-32 à l’aide de forets au cobalt. Insert 1,5 cm&nbsp ; Tube en polyéthylène (Tygon, D.I. 1/32 » D.E. 3/32 ») dans chaque vis de réglage creuse</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Billes magnétiques Ni-NTA</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’expédition</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin P-6 Colonnes de gel</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>In SSC Buffer</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-biotine</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Protéine, Protéine G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-terminal His-Tag et C-terminal protéine cystéine</td></tr><tr><td>, P-selectin-Fc</td><td>R& D System</td><td>137-PS</td><td>Protéine P-sélectine humaine recombinante/CD62P Fc Chimère,</td></tr><tr><td>protéine CF, streptavidine</td><td>Cedarlane</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pompe Seringue</td><td>Appareil de Harvard</td><td>704801</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Ward' s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Hamilton</td><td>81520</td><td>Seringues avec luer lock en PTFE, 5 mL</td></tr><tr><td>Aiguilles de seringue</td><td>BD</td><td>305115</td><td>Precision Glide 26 g, longueur 5/8 pouce</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tube Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr><tr><td>, adaptateur</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>formulation 3350, D.E. 1/32 » ; D.E. 3/32 »</td></tr><tr><td>Tubes, polyéthylène</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td>Intramedic (PE20) D.E. 0,38 mm ; D.E. 1,09 mm</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

L’adhésion roulante, facilitée par des interactions médiées par la sélection, est une motilité passive très dynamique dans le recrutement des leucocytes sur le site de l’inflammation. Ce phénomène se produit dans les veinules postcapillaires, où le flux sanguin pousse les leucocytes dans un mouvement roulant sur les cellules endothéliales. Un laminage stable nécessite un équilibre délicat entre la formation de liaisons d’adhérence et leur dissociation mécanique, permettant à la cellule de rester attachée à la surface tout en roulant dans le sens de l’écoulement. Contrairement à d’autres processus d’adhérence se produisant dans des environnements relativement statiques, l’adhérence au roulement est très dynamique car les cellules de laminage se déplacent sur des milliers de microns à des dizaines de microns par seconde. Par conséquent, les méthodes de mécanobiologie conventionnelles telles que la microscopie à force de traction ne conviennent pas à la mesure des événements d’adhésion individuels et des forces moléculaires associées en raison de la courte échelle de temps et de la sensibilité élevée requises. Ici, nous décrivons notre dernière implémentation du test d’empreinte d’adhérence pour imager les interactions P-selectin: PSGL-1 dans l’adhésion laminée au niveau moléculaire. Cette méthode utilise des attaches de jauge de tension irréversibles à base d’ADN pour produire un historique permanent des événements d’adhésion moléculaire sous la forme de pistes de fluorescence. Ces pistes peuvent être imagées de deux manières: (1) assembler des milliers d’images limitées par diffraction pour produire un grand champ de vision, permettant l’extraction de l’empreinte d’adhérence de chaque cellule roulante sur des milliers de microns de longueur, (2) effectuer DNA-PAINT pour reconstruire des images super-résolution des pistes de fluorescence dans un petit champ de vision. Dans cette étude, le test d’empreinte d’adhérence a été utilisé pour étudier les cellules HL-60 roulant à différentes contraintes de cisaillement. Ce faisant, nous avons pu imager la distribution spatiale de l’interaction P-selectin: PSGL-1 et mieux comprendre leurs forces moléculaires grâce à l’intensité de la fluorescence. Ainsi, cette méthode fournit les bases de l’étude quantitative des différentes interactions cellule-surface impliquées dans l’adhésion au roulement au niveau moléculaire.

Le protocole ci-dessus décrit la procédure expérimentale du test d’empreinte d’adhérence. Le flux de travail général de l’expérience est illustré à la Figure 1, de l’assemblage de la chambre d’écoulement (Figure 1A) à la fonctionnalisation de surface (Figure 1B) et aux étapes d’expérimentation et d’imagerie (Figure 1C).
La figure 2 est un résulta...

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Ce protocole aide à établir le lien entre la force moléculaire et le comportement de roulement cellulaire en plus de permettre de cartographier spatialement et de quantifier l’adhésion au roulement au niveau moléculaire. Cette technique permet d’étudier les événements d’adhésion individuels pendant le roulement cellulaire réel, ce qui nous permet de mesurer directement la force d’adhésion moléculaire physiologique pertinente. La préparation de surface en utilisant la concentration et le temps d’incubation appropriés à chaque étape est cruciale pour obtenir une fonctionnalisation de surface de haute qualité.La qualité des bioconjugations et les conditions appropriées sont également cruciales. La démonstration visuelle est essentielle pour aider les chercheurs à reproduire ce protocole. En particulier, les étapes telles que l’assemblage de la chambre d’écoulement et le post-traitement des images bénéficieront grandement d’une démonstration visuelle.Commencez par étaler finement une petite quantité d’époxy des deux côtés du ruban adhésif double face avec une lame de rasoir. À l’aide d’un laser, découpez le ruban enduit d’époxy pour créer quatre canaux. Créez la puce d’écoulement en prenant en sandwich le ruban époxy entre une glissière à quatre trous et un couvercle PEG.À l’aide d’une pointe de pipette, appliquez une légère pression sur toute la longueur des canaux pour créer une bonne étanchéité, puis durcissez l’époxy pendant au moins une heure. Alignez la puce de sorte que l’ouverture de chaque canal soit positionnée au centre de l’adaptateur. Placez ensuite deux entretoises en acrylique transparent sur le dessus de la puce.Appliquez une pression ferme au milieu du bloc et vissez aux extrémités de chaque entretoise. Vissez les entrées dans les trous filetés de l’autre côté du support et surveillez l’état d’étanchéité à travers le bloc acrylique transparent. Faites couler 200 microlitres de tampon de lavage dans la chambre pour vérifier les fuites.Si des bulles se forment dans le canal, poussez agressivement 200 microlitres supplémentaires de tampon de lavage pour éliminer les bulles. Ajouter 40 microlitres de BSA à la chambre d’écoulement pour éviter toute liaison non spécifique et incuber pendant 10 minutes dans la chambre d’humidité. Après l’incubation, ajouter 40 microlitres à Tween 20 à la chambre d’écoulement et incuber à nouveau pendant 10 minutes pour réduire davantage la liaison non spécifique.Ensuite, lavez le canal avec 200 microlitres de tampon de lavage pour éliminer tous les agents de passivation. Pour la fonctionnalisation de la surface de la chambre, ajoutez 40 microlitres de streptavidine à la chambre d’écoulement et incubez pendant 20 minutes, puis lavez la chambre avec 200 microlitres de tampon de lavage. Maintenant, ajoutez 40 microlitres de protéine hybride G-TGT à la chambre d’écoulement et incubez pendant 20 minutes.Après le lavage avec un tampon de lavage, ajoutez 40 microlitres de brin supérieur de protéine G-TGT et incubez pendant 20 minutes pour compléter tout brin inférieur TGT non hybridé sur la surface, puis lavez avec un tampon de lavage. Enfin, ajoutez 40 microlitres de P-selectin-Fc à la chambre d’écoulement et incubez pendant 60 minutes avant de laver avec un tampon de lavage. Remplissez une seringue en verre de cinq millilitres avec le tampon roulant et tapotez les côtés de la seringue pour déloger et pousser les bulles vers l’extérieur lorsqu’elles flottent vers la pointe.Après avoir inséré une aiguille stérile dans un tube en polyéthylène de 200 millimètres, connectez l’aiguille à la seringue en verre. Fixez la seringue sur la pompe à seringue et inclinez la pompe à seringue de manière à ce que le côté du piston soit surélevé pour empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal. Insérez l’extrémité du tube dans l’entrée de la chambre d’écoulement.Insérez une extrémité d’une autre pièce de 200 millimètres du tube en polyéthylène dans la sortie et immergez l’autre extrémité dans un bécher à déchets. Prélever un à deux millilitres de l’échantillon de suspension cellulaire et centrifuger pour granuler les cellules. Retirez le milieu et remettez doucement les cellules en suspension dans 500 microlitres du tampon de laminage.Débranchez soigneusement le tube des entrées et de la sortie et pipettez 40 microlitres de la suspension de la cellule dans la chambre d’écoulement. Reconnectez le tube comme décrit précédemment en veillant à ce que des bulles ne soient pas introduites dans le canal d’écoulement. Commencez l’expérience de laminage cellulaire en démarrant la pompe à seringue aux débits souhaités.Observez le roulement des cellules à l’aide d’un microscope à champ sombre avec un objectif 10X. Une fois l’expérience terminée, retirez les cellules du canal en injectant le tampon de laminage à 100 millilitres par heure jusqu’à ce que la surface soit libre de cellules. Pour l’imagerie des pistes locales par DNA-PAINT, ajoutez 40 microlitres de brin imageur DNA-PAINT préparé dans le tampon DNA-PAINT au canal.Effectuer une microscopie à fluorescence à réflexion interne totale en utilisant les conditions mentionnées dans le manuscrit du texte. Localisez et restituez les images en super résolution. Pour l’imagerie des longues pistes par étiquetage permanent, ajoutez le brin d’imageur permanent et incubez pendant 120 secondes dans le tampon T50M5.Ensuite, lavez le canal en infusant 200 microlitres de tampon de lavage. Enregistrez une image avec le laser d’excitation désactivé pour obtenir le bruit de fond de la caméra. Imagez une grande surface dans un motif de grille par microscopie TIRF.Programmez le microscope pour qu’il balaye sur une zone de 400 par 50 images et divisez les données brutes en fichiers TIP individuels contenant chacun un maximum de 10 000 images à l’aide du programme ImageJ. Aplatissez toutes les images à l’aide du profil d’éclairage et utilisez le plugin MIST pour assembler les images. Le résultat de la caractérisation de la bioconjugation de l’ADNSs de la protéine G a montré un rapport de près d’un est pour un de la protéine G à l’ADNsS où la protéine G Maleimide ssDNA et les spectres tampons d’élution de l’imidazole de la base orthogonale pour s’adapter au spectre de produits de bioconjugation.Native PAGE a été utilisé pour confirmer la bioconjugation montrant les bandes vert vif coïncidant avec la bande G de la protéine monomère indiquant une conjugaison réussie et un bon rendement. Le profil d’éclairage TIRF introduit à partir d’une fibre monomode est généralement plus lumineux au milieu du champ de vision et plus faible autour des bords. Pour compenser l’éclairage inégal et aplatir les images pour une analyse quantitative, le profil d’éclairage a été déterminé en faisant la moyenne de milliers d’images individuelles.Les images aplaties ont été produites en soustrayant le bruit de la caméra des profils bruts et d’éclairage, puis en normalisant par le profil d’éclairage. L’assemblage brut a montré des motifs périodiques clairs correspondant aux images non corrigées, tandis que le même champ de vision cousu à partir d’images aplaties produisait un arrière-plan plat. Un profil d’écoulement de montée en puissance a été utilisé pour déterminer la plage de contrainte de cisaillement résultant en des pistes de laminage cellulaire et de fluorescence de rendement sous lesquelles une empreinte d’adhérence typique d’une seule cellule pouvait être observée.Des résultats sous-optimaux et optimaux des pistes fluorescentes avec un contraste insuffisant, une densité de piste excessive, une densité et un contraste de piste optimaux, une diffraction limitée et une imagerie ADN-PAINT sont affichés. un temps d’incubation supérieur à 60 minutes assure la fonctionnalisation de la surface et une construction correcte de la chambre empêche le passage de bulles qui endommagent la surface fonctionnalisée. Cette procédure est applicable à l’analyse quantitative de la force moléculaire impliquée dans l’adhésion au roulement et permet aux chercheurs de comprendre le comportement de roulement des différents types de cellules.Cette technique permet aux chercheurs d’explorer de nouvelles questions concernant les événements d’adhésion rapide conduisant à l’avancement de la recherche sur les molécules uniques et la mécanobiologie.

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JoVE Journal

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Biologie

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Etudier Trajectoires Cellule roulant sur les Patterns récepteur asymétrique

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