Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Ce protocole aide à établir le lien entre la force moléculaire et le comportement de roulement cellulaire en plus de permettre de cartographier spatialement et de quantifier l’adhésion au roulement au niveau moléculaire. Cette technique permet d’étudier les événements d’adhésion individuels pendant le roulement cellulaire réel, ce qui nous permet de mesurer directement la force d’adhésion moléculaire physiologique pertinente. La préparation de surface en utilisant la concentration et le temps d’incubation appropriés à chaque étape est cruciale pour obtenir une fonctionnalisation de surface de haute qualité.

La qualité des bioconjugations et les conditions appropriées sont également cruciales. La démonstration visuelle est essentielle pour aider les chercheurs à reproduire ce protocole. En particulier, les étapes telles que l’assemblage de la chambre d’écoulement et le post-traitement des images bénéficieront grandement d’une démonstration visuelle.

Commencez par étaler finement une petite quantité d’époxy des deux côtés du ruban adhésif double face avec une lame de rasoir. À l’aide d’un laser, découpez le ruban enduit d’époxy pour créer quatre canaux. Créez la puce d’écoulement en prenant en sandwich le ruban époxy entre une glissière à quatre trous et un couvercle PEG.

À l’aide d’une pointe de pipette, appliquez une légère pression sur toute la longueur des canaux pour créer une bonne étanchéité, puis durcissez l’époxy pendant au moins une heure. Alignez la puce de sorte que l’ouverture de chaque canal soit positionnée au centre de l’adaptateur. Placez ensuite deux entretoises en acrylique transparent sur le dessus de la puce.

Appliquez une pression ferme au milieu du bloc et vissez aux extrémités de chaque entretoise. Vissez les entrées dans les trous filetés de l’autre côté du support et surveillez l’état d’étanchéité à travers le bloc acrylique transparent. Faites couler 200 microlitres de tampon de lavage dans la chambre pour vérifier les fuites.

Si des bulles se forment dans le canal, poussez agressivement 200 microlitres supplémentaires de tampon de lavage pour éliminer les bulles. Ajouter 40 microlitres de BSA à la chambre d’écoulement pour éviter toute liaison non spécifique et incuber pendant 10 minutes dans la chambre d’humidité. Après l’incubation, ajouter 40 microlitres à Tween 20 à la chambre d’écoulement et incuber à nouveau pendant 10 minutes pour réduire davantage la liaison non spécifique.

Ensuite, lavez le canal avec 200 microlitres de tampon de lavage pour éliminer tous les agents de passivation. Pour la fonctionnalisation de la surface de la chambre, ajoutez 40 microlitres de streptavidine à la chambre d’écoulement et incubez pendant 20 minutes, puis lavez la chambre avec 200 microlitres de tampon de lavage. Maintenant, ajoutez 40 microlitres de protéine hybride G-TGT à la chambre d’écoulement et incubez pendant 20 minutes.

Après le lavage avec un tampon de lavage, ajoutez 40 microlitres de brin supérieur de protéine G-TGT et incubez pendant 20 minutes pour compléter tout brin inférieur TGT non hybridé sur la surface, puis lavez avec un tampon de lavage. Enfin, ajoutez 40 microlitres de P-selectin-Fc à la chambre d’écoulement et incubez pendant 60 minutes avant de laver avec un tampon de lavage. Remplissez une seringue en verre de cinq millilitres avec le tampon roulant et tapotez les côtés de la seringue pour déloger et pousser les bulles vers l’extérieur lorsqu’elles flottent vers la pointe.

Après avoir inséré une aiguille stérile dans un tube en polyéthylène de 200 millimètres, connectez l’aiguille à la seringue en verre. Fixez la seringue sur la pompe à seringue et inclinez la pompe à seringue de manière à ce que le côté du piston soit surélevé pour empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal. Insérez l’extrémité du tube dans l’entrée de la chambre d’écoulement.

Insérez une extrémité d’une autre pièce de 200 millimètres du tube en polyéthylène dans la sortie et immergez l’autre extrémité dans un bécher à déchets. Prélever un à deux millilitres de l’échantillon de suspension cellulaire et centrifuger pour granuler les cellules. Retirez le milieu et remettez doucement les cellules en suspension dans 500 microlitres du tampon de laminage.

Débranchez soigneusement le tube des entrées et de la sortie et pipettez 40 microlitres de la suspension de la cellule dans la chambre d’écoulement. Reconnectez le tube comme décrit précédemment en veillant à ce que des bulles ne soient pas introduites dans le canal d’écoulement. Commencez l’expérience de laminage cellulaire en démarrant la pompe à seringue aux débits souhaités.

Observez le roulement des cellules à l’aide d’un microscope à champ sombre avec un objectif 10X. Une fois l’expérience terminée, retirez les cellules du canal en injectant le tampon de laminage à 100 millilitres par heure jusqu’à ce que la surface soit libre de cellules. Pour l’imagerie des pistes locales par DNA-PAINT, ajoutez 40 microlitres de brin imageur DNA-PAINT préparé dans le tampon DNA-PAINT au canal.

Effectuer une microscopie à fluorescence à réflexion interne totale en utilisant les conditions mentionnées dans le manuscrit du texte. Localisez et restituez les images en super résolution. Pour l’imagerie des longues pistes par étiquetage permanent, ajoutez le brin d’imageur permanent et incubez pendant 120 secondes dans le tampon T50M5.

Ensuite, lavez le canal en infusant 200 microlitres de tampon de lavage. Enregistrez une image avec le laser d’excitation désactivé pour obtenir le bruit de fond de la caméra. Imagez une grande surface dans un motif de grille par microscopie TIRF.

Programmez le microscope pour qu’il balaye sur une zone de 400 par 50 images et divisez les données brutes en fichiers TIP individuels contenant chacun un maximum de 10 000 images à l’aide du programme ImageJ. Aplatissez toutes les images à l’aide du profil d’éclairage et utilisez le plugin MIST pour assembler les images. Le résultat de la caractérisation de la bioconjugation de l’ADNSs de la protéine G a montré un rapport de près d’un est pour un de la protéine G à l’ADNsS où la protéine G Maleimide ssDNA et les spectres tampons d’élution de l’imidazole de la base orthogonale pour s’adapter au spectre de produits de bioconjugation.

Native PAGE a été utilisé pour confirmer la bioconjugation montrant les bandes vert vif coïncidant avec la bande G de la protéine monomère indiquant une conjugaison réussie et un bon rendement. Le profil d’éclairage TIRF introduit à partir d’une fibre monomode est généralement plus lumineux au milieu du champ de vision et plus faible autour des bords. Pour compenser l’éclairage inégal et aplatir les images pour une analyse quantitative, le profil d’éclairage a été déterminé en faisant la moyenne de milliers d’images individuelles.

Les images aplaties ont été produites en soustrayant le bruit de la caméra des profils bruts et d’éclairage, puis en normalisant par le profil d’éclairage. L’assemblage brut a montré des motifs périodiques clairs correspondant aux images non corrigées, tandis que le même champ de vision cousu à partir d’images aplaties produisait un arrière-plan plat. Un profil d’écoulement de montée en puissance a été utilisé pour déterminer la plage de contrainte de cisaillement résultant en des pistes de laminage cellulaire et de fluorescence de rendement sous lesquelles une empreinte d’adhérence typique d’une seule cellule pouvait être observée.

Des résultats sous-optimaux et optimaux des pistes fluorescentes avec un contraste insuffisant, une densité de piste excessive, une densité et un contraste de piste optimaux, une diffraction limitée et une imagerie ADN-PAINT sont affichés. un temps d’incubation supérieur à 60 minutes assure la fonctionnalisation de la surface et une construction correcte de la chambre empêche le passage de bulles qui endommagent la surface fonctionnalisée. Cette procédure est applicable à l’analyse quantitative de la force moléculaire impliquée dans l’adhésion au roulement et permet aux chercheurs de comprendre le comportement de roulement des différents types de cellules.

Cette technique permet aux chercheurs d’explorer de nouvelles questions concernant les événements d’adhésion rapide conduisant à l’avancement de la recherche sur les molécules uniques et la mécanobiologie.