Name: Un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l'efficacité de l'épissage dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'étudier les mutations des sites d'épissage et de développer des stratégies thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par des fonds versés à S.S. par les National Institutes of Health (R21CA170786 et R01GM127464) et à l’American Cancer Society (l’Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) et à S.S. et W.M. du Valley Research Partnership Program (P1-4009 et VRP77). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.

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<li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).</li>
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<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).</li>
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<li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li>
<li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position+%2B3+of+donor+splice-sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li>
<li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li>
<li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteitz%2C+JA+%22Functions+of+the+abundant+U-snRNPs.+Structure+and+function+of+major+and+minor+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%22">Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).</li>
<li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5%27+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li>
<li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+recognition+of+5%27+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li>
<li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+atypical+5%27+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li>
<li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splice-switching+small+molecules%3A+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li>
<li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li>
<li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le test peut être adapté pour l’analyse d’épissage dans des lignées cellulaires autres que HeLa, cependant, les facteurs affectant l’efficacité de la transfection, tels que la confluence cellulaire et la quantité d’ADN peuvent devoir être optimisés. Le rapport de construction rapporteur/U1 est un autre paramètre critique qui peut devoir être déterminé en fonction des niveaux d’expression observés dans d’autres types de cellules. La qualité de l’ARN extrait est essentielle pour l’analyse de l’épissage; par conséquent, l’u...

L’épissage pré-ARNm est une étape de traitement essentielle qui élimine les introns non codants et ligature avec précision les exons codants pour former de l’ARNm mature. La reconnaissance des séquences consensuelles aux jonctions exon-intron, appelées site d’épissure 5′ et site d’épissure 3′, par les composants de la machine d’épissage initie le processus d’épissage. La petite ribonucléoprotéine nucléaire U1 (snRNP) reconnaît le site d’épissure 5′ par appariement de base de l’ARNNc U1 au pré-ARNm1. Les mutations génétiquement héréditaires qui modifient les séquences du site d’épissure 5′ sont associées à de nombreuses maladies2,3. On prévoit que la perte de l’appariement de base de l’ARNN U1 avec les sites d’épissure 5′ mutants provoque un épissage aberrant, ce qui peut compromettre la traduction de la transcription affectée. Une approche thérapeutique potentielle pour corriger les défauts d’épissage implique la suppression des mutations par l’ARNN U1 modifié portant des changements nucléotidiques compensatoires dans sa région 5′ qui se base avec le site d’épissure 5′. De tels snRNA U1 modifiés, également appelés snRNA U1 spécifiques aux exons, se sont révélés efficaces pour inverser les défauts d’épissage, entraînant une augmentation de l’expression protéique de l’ARNm sauvé4,5,6,7,8.
Ici, nous décrivons le test de complémentation SnRNP U1, un test d’épissage cellulaire basé sur un rapporteur qui permet d’évaluer l’effet des mutations 5′-ss sur l’épissage d’un exon et peut également être utilisé pour le développement d’ARNs U1 modifiés pour permettre le sauvetage de l’inclusion d’exons. Nous fournissons également des protocoles pour la surveillance des transcriptions du rapporteur épissé par extension d’amorce et RT-PCR, et pour déterminer l’expression des snRNA U1 modifiés par extension d’amorce et RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>Eau déminéralisée de qualité réactif</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Sachet de poudre Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), Source australienne, inactivé par la chaleur</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, solution étalon 1.0N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, certifié ACS Plus, 36.5 à 38.0 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtres jetables pour bouteilles en PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sel disodique Dihydraté</td><td>Amresco</td><td>0105-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % Trypsine (10x), sans rouge de phénol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>sodium</td><td>Fisher Bioréactif</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Bioréactif</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Disodique Bioréactif Fisher Heptahydrate d’hydrogénophosphate</td><td></td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Bioréactif</td> de<td>Fisher Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de transfection - Opti-MEM&trade ; I Milieu sérique réduit, sans rouge de phénol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>réactif de transfection - Lipofectamine&trade ; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade ; Réactif</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme (environ 0,75 % d’éthanol comme conservateur/biologie moléculaire)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, absolu (200 proof), qualité biologie moléculaire, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, qualité biologie moléculaire, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>Kit Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma ;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Plomb, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Exclusion de taille beands - Sephadex&reg ; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>Mini colonnes d’exclusion de taille</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de faible poids moléculaire, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs inactivateurs de rnase - RNaseZAP&trade ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM ch)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade ; Inhibiteur de la ribonucléase recombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse - M-MLV Transcriptase inverse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>utilisé pour l’extension de l’amorce</td></tr><tr><td>Taq DNA polymérase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Hexamères aléatoires (50 &micro ; M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Mélange PCR en temps réel - SYBR&trade ; Sélectionnez Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade ; III Transcriptase inverse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>utilisée pour la préparation de l’ADNc</td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampon Premier brin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamide (&ge ; 99,5 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100 Examen des</td><td>fiches signalétiques Bleu</td></tr><tr><td>de bromophénol Sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris (cristaux blancs ou poudre cristalline/biologie moléculaire)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique (cristallin/ Électrophorèse)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide : Bis-acrylamide 19:1 (solution à 40 %/électrophorèse)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Examen des fiches signalétiques</td></tr><tr><td>Urée (cristaux incolores à blancs ou poudre cristalline/biologique mol.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Peroxodisulfate d’ammonium (APS) &ge ; 98 %, Pro-Pure, Qualité Protéomique</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) &ge ; 99 %, Ultrapur</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>Examen Fiches de données de sécurité</td></tr><tr><td>des matériaux Systèmes de gel de dalle réglable, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade ; Ensembles de plaques de verre, 16,5 x 14,5 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade ; Ensembles de plaques de verre, 16,5 x 22,0 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade ; Ensembles de plaques de verre, 16,5 x 38,7 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE Écrans de stockage au phosphore</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade ; FLA 7000 Imageur biomoléculaire</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 Compteur à scintillation liquide</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermocycleur tactile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Systèmes de PCR en temps réel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Au cours de l’expression des gènes, l’étape vitale de l’épissage pré-ARNm implique la reconnaissance précise des sites d’épissure et l’assemblage efficace de complexes splicéosomiques pour joindre les exons et éliminer les introns avant l’exportation cytoplasmique de l’ARNm mature. L’efficacité de l’épissage peut être altérée par la présence de mutations sur les sites d’épissure, l’influence de facteurs d’épissage trans-agissants ou l’activité thérapeutique. Ici, nous décrivons le protocole pour un test cellulaire qui peut être appliqué pour surveiller l’efficacité d’épissage d’un exon donné. Le test utilise un rapporteur de minigène 3-exon/2-intron codé en plasmide adaptable, qui peut être exprimé dans les cellules de mammifères par transfection transitoire. Après la transfection, l’ARN cellulaire total est isolé et l’efficacité de l’épissage des exons dans l’ARNm rapporteur est déterminée par extension de l’amorce ou par réaction en chaîne semi-quantitative transcriptase inverse-polymérase (RT-PCR). Nous décrivons comment l’impact des mutations du site d’épissure 5′ associées à la maladie peut être déterminé en les introduisant dans le rapporteur; et comment la suppression de ces mutations peut être réalisée par co-transfection avec un petit ARN nucléaire U1 (snRNA) portant des mutations compensatoires dans sa région 5′ qui se base avec les sites d’épissure 5′ aux jonctions exon-intron dans les pré-ARNm. Ainsi, le rapporteur peut être utilisé pour la conception de particules thérapeutiques en U1 afin d’améliorer la reconnaissance des sites d’épissure mutants de 5′. L’insertion de sites régulateurs à action cis, tels que des séquences d’amplificateur d’épissage ou de silencieux, dans le rapporteur peut également être utilisée pour examiner le rôle du SNNP U1 dans la régulation médiée par un facteur d’épissage alternatif spécifique. Enfin, les cellules exprimant le rapporteur peuvent être incubées avec de petites molécules pour déterminer l’effet de thérapies potentielles sur l’épissage constitutif de l’ARNm ou sur les exons porteurs de sites d’épissure mutants de 5′. Dans l’ensemble, le test rapporteur peut être appliqué pour surveiller l’efficacité de l’épissage dans diverses conditions afin d’étudier les mécanismes fondamentaux d’épissage et les maladies associées à l’épissage.

Le rapporteur d’épissage Dup51, un minigène d’intron à trois exons-deux, a été dérivé du gène humain β-globine et a été décrit précédemment (Figure 1A)11,12 . Nous avons créé un rapporteur mutant, Dup51p, en introduisant des mutations du site d’épissure associées au syndrome d’Usher qui se produisent dans l’exon 3 du gène de la protocadhérine 15 (PCDH15)13. La séquence du site d’épissure de 5' à la jo...

Ce protocole décrit un test rapporteur minigène pour surveiller l’impact des mutations du site de l’épissure 5'sur l’épissage et développe un suppresseur U1 snRNA pour le sauvetage de l’inhibition de l’épissage induite par mutation. Les constructions de l’ARNN U1 rapporteur et suppresseur sont exprimées dans les cellules HeLa, et l’épissage est analysé par extension d’amorce ou RT-PCR.

Un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Ce protocole décrit un test cellulaire pour la surveillance de l’efficacité de l’épissage, à l’aide d’un rapporteur de gestion adaptable. Ce test rapporteur peut être utilisé pour étudier les effets des mutations associées à la maladie dans les sites Exxon ou d’épissure, et pour concevoir une thérapie, en particulier une particule, afin d’améliorer la reconnaissance des sites d’épissure mutants à cinq points. Le passage dans les cellules Hela aspire le milieu usé et incube les cellules avec trois millilitres de 0,2 5% trébuche en contenant un millimolaire EDTA, à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.Après incubation à sept millilitres de DMEM frais et transfert de la suspension cellulaire dans un tube de 10 millilitres. Centrifuger les cellules. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de DMEM frais et plaquez les cellules sur une nouvelle boîte de culture tissulaire à 20% de confluence, pour une transsfection transitoire.Comptez les cellules hela avec une lame d’hémo cytomètre propre et préparez une suspension d’une densité de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, ensemencez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 12 puits et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirer le milieu usé et ajouter 800 microlitres de DMEM frais avec du sérum dans l’assiette. Préparez les mélanges de transfection et vortexez-les pendant 15 secondes.Ensuite, centrifugez les mélanges et incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez les 200 microlitres du mélange de transfection dans un puits de la plaque cellulaire hela de 12 puits pour obtenir un volume final d’un millilitre par puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Les réactions d’étiquetage préparées sont en incubation.Remettez en suspension les billes d’exclusion de taille de coupure de poids moléculaire Dalton de 25 kilos en vortexant doucement pendant 10 secondes. Ensuite, transférez 600 microlitres des perles remises en suspension dans une mini colonne jetable, placée dans un tube de collecte de 1,5 millilitre, et retournez le stock de perles à quatre degrés Celsius. Centrifugez la colonne et jetez le flux à travers eux.Ensuite, lavez les perles deux fois en ajoutant 300 microlitres d’eau sans ARN à la colonne. Après le deuxième lavage, transférer la mini colonne dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajouter le mélange de réaction kinase à la colonne. Centrifuger la colonne et recueillir l’écoulement contenant les oligonucléotides marqués P32.Ajouter deux microgrammes d’ARN extraits des cellules hélicoïdales dans des tubes de microcentrifugation de 200 microlitres et ajouter de l’eau sans ARN pour augmenter le volume à 6,55 microlitres. Ensuite, ajoutez 0,9 microlitre à un mélange maître à chaque tube pcR contenant les échantillons d’ARN, et incubez les tubes d’abord à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur la glace pendant une minute. Ensuite, à 2,55 microlitres, un maître mélange deux, à chaque tube contenant l’ARN et un mélange maître, et incubez les tubes à température ambiante pendant 10 minutes.Après l’incubation, transférez les tubes dans un cycleur thermique et incubez d’abord à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes, puis à 70 degrés Celsius, pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez 10 microlitres de colorant de chargement d’ARN formamide 2X à chaque échantillon et procédez à la séparation des fragments par page UIA. Synthèse de l’ADN de Percy.Ajouter deux microgrammes d’ARN extraits des cellules hela transectées, dans des tubes de 200 microlitres de microncentrifuge et ajouter de l’eau libre d’ARN pour composer le volume à un faible 11 microlitres. Ensuite, ajoutez deux microlitres, un mélange principal à chaque échantillon et incubez d’abord à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur la glace pendant une minute. Ensuite, ajoutez sept microlitres, un mélange maître deux à chaque tube et incubez les tubes à température ambiante pendant 10 minutes, suivis d’une incubation à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes et à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, pour la PCR, diluez la réaction d’ADN C pour obtenir une concentration de 100 nanogrammes par microlitre et transférez un microlitre de chaque échantillon de CDNA dans de nouveaux tubes de PCR. Ajoutez 10,5 microlitres du mélange maître à chaque tube contenant du CDNA et effectuez la PCR. Utilisation d’un thermocycleur Une fois la PCR terminée.Ajouter 12,5 microlitres de colorant de charge d’ADN formamide 2X à chaque tube. Chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes et procédez à l’exécution d’une page UIA. Pipette cinq microlitres de CDNA dilué dans des puits individuels d’une plaque qpcr de 96 puits triplicate.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de mélange PCR en temps réel à chaque puits, scellez les plaques avec un film optique et centrifugez pour recueillir les réactions au fond des puits, puis effectuez le qpcr tout en collectant les valeurs du cycle de quantification seuil de l’amplicon cible. Avant de charger les marqueurs et les échantillons, videz les puits avec un tampon TBE pour éliminer l’urée décantée. Chargez ensuite 10 microlitres de chaque échantillon par puits et faites fonctionner le gel à 300 à 500 volts pendant deux à trois heures, ou jusqu’à ce que le xylène atteigne le fond.Après l’électrophorèse, retirez les plaques de verre de l’appareil d’électrophorèse et séparez soigneusement les deux plaques de sorte que le gel repose à plat sur l’une ou l’autre surface de verre, puis transférez le gel sur un papier filtre et recouvrez-le d’une pellicule plastique, à l’aide d’un séchoir à gel, séchez le gel sous vide à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis placez le gel séché dans une cassette d’imagerie au phosphore pour une incubation nocturne à température ambiante. Lorsqu’il est exprimé dans des cellules hela, le rapporteur de tranchage dup 51 minnijean exprime la transcription complète mature dans laquelle Exxon two est épissé efficacement. Les cinq mutations du site d’épissure premier et dup 51 P réduisent l’inclusion de deux Exxon de 95 à 30%, ce qui conduit à la formation d’un transcrit plus court.La co-expression de dup 51 P avec L’ARNN U15A sauve Exxon de deux épissages et restaure la formation de la transcription complète. En revanche, la co-expression avec la variante de type sauvage U1 ou U15G n’a pas le même effet sur l’épissage dup 51P. La détection des transcriptions de la variante U15A, par extension primaire, utilise l’oligonucléotide U1 sept à 26, qui est constitué de 20 nucléotides de longues paires de bases près de l’adénine à la cinquième position de l’ARNN U1.En présence de DATP seul, U1 sept à 26 permet d’incorporer deux à trois nucléotides pour l’ARNNS sauvage endogène de type U1 donnant un produit long de 22 ou 23 nucléotides. Pour les variantes U15A et U15G, l’extension se termine après l’ajout d’une seule adénosine produisant un produit à 21 nucléotides. Après normalisation à l’expression de l’ARNN U2, les variantes U1 de type sauvage U1 5g et U15A transfectées ont été exprimées de trois à cinq fois sur l’ARNN endogène.La qualité de l’ARN extrait est essentielle pour l’analyse de l’épissage. Par conséquent, l’utilisation d’eau sans ARN et la décontamination des services avec des ARN inactivent les agents sont fortement recommandées. Le système de rapport décrit ici peut être appliqué pour étudier le rôle des ARN U1 SN dans les réglementations d’épissage pour inverser l’effet des mutations d’épissage à prix flash pour le silençage génique à l’aide d’ARN U1SN modifiés.

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