Détection de virus et de protéines salivaires d’un vecteur cicadelle dans la plante hôte

Ce protocole fournit une technique de détection des protéines salivaires des cicadelles et des plantes hôtes afin d’étudier davantage la fonction de ces protéines chez les plantes hôtes. Cette technique est facile à réaliser et le système est stable et reproductible. Cette méthode pourrait également être utile dans la détection des protéines salivaires d’autres hémiptères et plantes hôtes.

Pour commencer, élevez les cicadelles adultes sur des plants de riz dans une cage cubique de 40 centimètres sur 35 centimètres sur 20. Gardez un côté de la cage recouvert d’un filet à l’épreuve des insectes pour la ventilation. Placez les cages avec les cicadelles dans un incubateur contenant un régulateur d’humidité intégré à 26 degrés Celsius avec une humidité relative de 60 à 75% sous une période photo de 16 heures de lumière et huit heures d’obscurité.

Une fois par semaine, utilisez un aspirateur pour transférer doucement tous les adultes de leur cage dans une nouvelle cage contenant des plants de riz frais. Laissez plus de 200 adultes s’accoupler et pondre des œufs dans le riz. Conservez les vieux plants de riz pour que les nymphes émergent et élevez ces nouvelles nymphes non virulifères au stade du deuxième stade.

À l’aide de l’aspirateur, transférez soigneusement les nymphes non virulifères du deuxième stade dans un tube de culture en verre pendant une à deux heures pour mourir de faim. Ensuite, relâchez les nymphes dans une cage contenant un plant de riz infecté par le virus nain du riz cultivé dans un pot et laissez les nymphes se nourrir du plant de riz infecté pendant deux jours. Après deux jours, transférez soigneusement ces nymphes dans une nouvelle cage contenant des plants de riz frais exempts de virus et laissez les nymphes se nourrir des plants de riz exempts de virus pendant 12 jours pour compléter la période de transmission circulative du virus nain du riz.

Pour recueillir les protéines salivaires, préparez cinq petites cages d’alimentation en forme de tuyaux recouvertes d’un filet à l’épreuve des insectes à une extrémité. Après avoir confiné 15 à 20 cicadelles dans chaque cage d’alimentation, couvrir l’autre extrémité de la cage avec un mince tapis en mousse. Fixez un plant de riz entre l’extrémité de la cage et un tapis en mousse avec des rubans, en veillant à ce que les cicadelles dans la cage d’alimentation puissent se nourrir des plants de riz exposés à l’intérieur de la cage.

Immergez les racines des plantules dans l’eau pour que le plant de riz reste en vie et laissez les cicadelles s’en nourrir pendant deux jours. Après deux jours, retirez les cicadelles de leurs cages d’alimentation et ramassez les plants de riz dont les cicadelles se nourrissaient. Coupez les plants à l’extérieur de la cage et récupérez les régions d’alimentation des plants.

Préparer 1x tampon Tris-Glycine en diluant 200 millilitres du tampon 5x préparé avec 800 millilitres d’eau stérile. Ensuite, préparez 10x tampon TBS et autoclavez la solution à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, préparez le tampon d’échantillon de protéines 4x.

Préparez ensuite le tampon de transfert en mélangeant 800 millilitres du tampon Tris-Glycine avec 200 millilitres de méthanol. Enfin, préparez la solution TBST en ajoutant 100 millilitres de TBS 10x et trois millilitres de Tween 20 à 900 millilitres d’eau stérile. Pour détecter les protéines salivaires et virales, broyez 0,1 gramme d’échantillons de riz avec de l’azote liquide jusqu’à ce que le tissu devienne une poudre.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres du tampon d’échantillon de protéines 4x à l’échantillon et faites bouillir pendant 10 minutes. Centrifuger les échantillons et transférer le surnageant dans un nouveau flacon. Chargez 10 microlitres de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE et faites-le passer dans un tampon Tris-Glycine à 150 volts pendant 45 à 60 minutes.

Pendant que le gel fonctionne, placez une membrane de nitrocellulose de 0,45 micron et d’autres fournitures sandwich dans le tampon de transfert pendant 30 minutes. Après la course, prenez le gel en sandwich et transférez-le pendant 90 à 120 minutes à 100 volts dans le tampon de transfert. Une fois le buvard terminé, placez la membrane dans une solution de blocage de lait en poudre écrémé à 7% dans TBST et incuber pendant 20 minutes.

Après cela, ajoutez un anticorps contre le virus nain du riz P8 ou la vitellogénine et incuber la membrane pendant deux heures ou toute la nuit. Après l’incubation, laver la membrane avec du TBST trois fois avec une incubation de cinq minutes entre chaque lavage. Ajoutez ensuite des IgG anti-lapin de chèvre comme anticorps secondaire et incuber la membrane pendant 60 à 90 minutes.

Utilisez le kit ECL Western pour la détection chimiluminescente dans les réactifs de détection mixtes un et deux dans le kit dans un rapport de un pour un. Placez la membrane sur le réactif mixte et incuber le transfert pendant cinq minutes. Égoutter l’excès de réactif et prendre une image chimioluminescente et colorimétrique de la membrane.

Combinez les images pour voir ces dernières avec des bandes protéiques. L’analyse par transfert Western pour la détection de la vitellogénine a montré des bandes spécifiques et attendues d’environ 220 kilodaltons dans l’alimentation des plants de riz et des glandes salivaires des insectes. En revanche, aucune bande n’a été observée chez les plantes non nourricières, ce qui indique que la vitellogénine a été libérée dans la plante hôte sous forme de protéine salivaire.

L’analyse par transfert Western pour la détection de la protéine P8 du virus nain du riz a montré une bande spécifique et attendue d’environ 46 kilodaltons dans les plantes d’alimentation et les corps d’insectes virulifères. En revanche, aucune bande n’a été observée chez les plantes non nourricères et les corps de cicadelles non virulifères, ce qui prouve que les protéines virales pouvaient également être détectées dans les plantes d’alimentation. La charge virale dans les cicadelles, le moment de la détection et les réplications doivent être pris en compte lors de l’exécution de ce protocole.

Cette méthode peut également être appliquée pour étudier les moustiques qui transmettent des arbovirus.