Name: Cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez la cristallisation sur puce pour la diffraction X à température ambiante. Cette méthode permet l'étude des états conformationnels des protéines sans cryo-crystallographie.

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L’utilisation d’Advanced Photon Source, une installation utilisateur de l’Office of Science exploitée pour le département de l’Énergie des États-Unis par Argonne National Laboratory, a été soutenue par le contrat DE-AC02-06CH11357. L’utilisation de BioCARS a été soutenue par le National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health sous le numéro de subvention R24GM111072. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. L’utilisation du secteur 21 du LS-CAT a été soutenue par la Michigan Economic Development Corporation et la subvention Michigan Technology Tri-Corridor 085P1000817. Ce travail est soutenu par des subventions de l’Université de l’Illinois à Chicago, des National Institutes of Health (R01EY024363) et de la National Science Foundation (MCB 2017274) à XY.

1. Pré-assemblage de l’appareil
<ol><li>Étiqueter la bague extérieure (30 mm de diamètre) pour l’identification de l’échantillon. Si nécessaire, indiquez le nom du projet, le numéro de l’appareil, l’état de cristallisation et la date (figure 1A). Placez la bague extérieure à l’envers sur une surface propre (Figure 1B) et placez délicatement une plaquette de quartz à l’intérieur de la bague (Figure 1C). Cette première plaquette de quartz sert de fenêtre d’entrée pour les rayons X incidents.</li>
	<li>Versez une petite quantité d’huile d’immersion pour microscope (viscosité de 150 cSt) dans une boîte de Pétri. Trempez une cale dans l’huile et assurez-vous que les deux côtés de la cale sont correctement huilés (figure 1D). Retirez l’excès d’huile en tamponnant la cale sur une surface propre.</li>
	<li>Placer la cale huilée sur la première plaquette de quartz (figure 1E). REMARQUE: L’huile d’immersion est un excellent scellant qui protège la chambre de cristallisation contre les pertes de vapeur potentielles. Les copeaux correctement assemblés durent généralement des semaines sans séchage visible. Cette étape de pré-assemblage est réalisée sous la lumière de la pièce. Pour les échantillons photosensibles, toutes les étapes suivantes, y compris le chargement des échantillons, le stockage de l’appareil et l’observation, doivent être effectuées sous une lumière de sécurité.</li>
</ol>2. Chargement de l’échantillon et assemblage de l’appareil
<ol><li>Utilisez une pipette pour bien mélanger la solution protéique et le tampon de cristallisation sur la première plaquette de quartz. Le rapport volumique entre l’échantillon de protéines et le tampon varie généralement de 2:1 à 1:2 (Figure 1F). Assurez-vous que le volume total de la solution de cristallisation ne dépasse pas la capacité maximale de la chambre de cristallisation déterminée par la taille et l’épaisseur de la cale. Évitez les bulles d’air pendant le mélange. NOTE: La composition d’un tampon de cristallisation varie d’une expérience à l’autre. Voir le tableau 1 pour connaître les conditions de cristallisation.</li>
	<li>Placez la deuxième plaquette de quartz sur la solution mélangée lorsque la solution commence à s’étaler (Figure 1G). Cette deuxième plaquette de quartz sert de fenêtre de sortie aux rayons X diffractés.</li>
	<li>Tapotez légèrement la deuxième tranche de quartz sur le bord pour aider à répandre l’huile tout en poussant l’air vers l’extérieur. Fixez le dispositif en vissant une bague de retenue dans la bague extérieure (Figure 1H). Utilisez un outil de serrage si nécessaire (figure 1I). N’oubliez pas qu’un serrage excessif peut provoquer la déformation ou même la fissuration de plaquettes de quartz délicates.</li>
</ol>3. Stockage des appareils et optimisation de la cristallisation
<ol><li>Rangez les appareils assemblés (Figure 1J) dans une boîte à température ambiante ou à l’intérieur d’un incubateur avec contrôle de la température. REMARQUE: Les cristaux de protéines peuvent apparaître quelques heures à quelques jours après l’assemblage d’un dispositif de cristallisation. Les résultats typiques de la cristallisation sur puce sont présentés pour plusieurs échantillons de protéines représentatifs (Figure 2).</li>
	<li>Surveillez la croissance des cristaux en observant le dispositif de cristallisation au microscope. Si nécessaire, optimiser les conditions de cristallisation par itérations des sections 1 à 3.</li>
</ol>4. Étalonnage
REMARQUE: Les programmes et commandes mentionnés dans les sections ci-dessous sont exécutés dans le logiciel inSituX.
<ol><li>Installez un mince cristal de grenat d’yttrium et d’aluminium dopé sur le porte-puce (Figure 3). Installez la butée du faisceau. Prenez des images de fluorescence X du faisceau direct en exécutant le programme : burnmark.py <périphérique>.param où <dispositif> est un nom sélectionné par l’utilisateur pour le dispositif de cristallisation. <device>.param est un nom de fichier qui contient des paramètres de contrôle spécifiques au périphérique. Les valeurs par défaut seront progressivement remplacées par des valeurs spécifiques le long du protocole. Un exemple de fichier <device>.param est présenté dans le fichier supplémentaire 1.</li>
	<li>Trouvez la position précise du faisceau de rayons X direct en exécutant le programme d’ajustement du profil de faisceau : beam.py <graver l’image> -d <périphérique> où < graver l’image > est le nom de fichier de l’image de fluorescence X (Figure 4). REMARQUE: Ce programme calcule les positions précises du faisceau direct ainsi que la taille du faisceau. La position du faisceau marque la destination de translocation pour tous les cristaux du même dispositif. La taille du faisceau est également utilisée pour la planification des cibles.</li>
</ol>5. Balayage optique
<ol><li>Placez un dispositif de cristallisation dans le porte-puce et fixez-le à l’aide d’une vis à molette (Figure 3A).</li>
	<li>Montez le porte-puce sur l’étage de translation du diffractomètre à l’aide d’un mécanisme cinématique (Figure 3B).</li>
	<li>Installez une source de lumière appropriée pour prendre des micrographies à partir de la fenêtre optique de l’appareil. La lumière blanche, la lumière IR ou toute autre lumière de choix peuvent être utilisées en fonction de la sensibilité à la lumière de l’échantillon de protéines ainsi que du but de l’expérience.</li>
	<li>Exécutez le programme d’analyse : scan.py <périphérique>.param Ce programme capture un ensemble de micrographies qui sont automatiquement transférées vers des ordinateurs utilisateur spécifiés.</li>
	<li>Exécutez le programme de mosaïque sur un ordinateur utilisateur : tile.py <périphérique> -x <x> -y <y> où < x > et <y> sont les valeurs initiales pour les déplacements de colonnes et de lignes des micrographies, respectivement. Ce programme assemble toutes les micrographies dans un montage d’une résolution de 1 à 3 μm/pixel (Figure 5). REMARQUE: Les étapes 5.4 et 5.5 prennent généralement quelques minutes. Le nombre total de micrographies varie de plusieurs dizaines à des centaines selon la zone de balayage et le grossissement.</li>
	<li>Exécutez le programme de recherche de cristaux : findX.py <montage> -c <longueur> <largeur> -w <coin> -x <taille du faisceau> où <montage> est l’image en mosaïque. Ce programme effectue la reconnaissance des cristaux et la planification des tirs. <longueur> et <largeur> indiquent la taille du cristal à trouver. Si l’utilisateur souhaite éviter les cristaux plus petits, <largeur> peut être utilisé comme coupure en définissant un nombre plus grand que les tailles des petits cristaux indésirables. <coin> est une valeur angulaire qui définit la tolérance pour les cristaux de forme irrégulière. <taille du faisceau> désigne la taille directe du faisceau obtenue à partir du raccord du profil ci-dessus (étape 4.2; Graphique 4). En outre, une valeur nominale peut être définie par les utilisateurs pour espacer davantage les prises de vue ciblées. Ces paramètres clés permettent une sélection cristalline spécifique et une planification des cibles (Figure 6).</li>
</ol>6. Diffraction des rayons X
<ol><li>Retirez la source lumineuse et installez la butée du faisceau. Définissez une distance de détection appropriée. Suivez le protocole de sécurité de la ligne de faisceau pour fouiller le clapier à rayons X. Ouvrez l’obturateur à rayons X et l’obturateur laser, le cas échéant.</li>
	<li>Exécutez le programme de collecte de données pour la diffraction série: collect.py <device>.param -l <durée de la lumière> Cette commande déclenche la collecte de données dans laquelle tous les plans planifiés sont visités les uns après les autres selon une séquence préprogrammée. Chaque cristal ciblé est transloqué vers la position du faisceau (étape 4.2). À chaque arrêt, l’exposition aux rayons X est prise avec ou sans éclairage laser à un délai prévu. Le film 1 montre une séquence de collecte de données automatisée fonctionnant à une fréquence de 1 Hz. Régulièrement, des dizaines à des centaines d’images de diffraction sont collectées à partir d’un seul dispositif de cristallisation (film 2). NOTE: L’étalonnage de la section 4 et le balayage optique de la section 5 sont autonomes dans la plate-forme inSituX, donc complètement transférables à une autre ligne de faisceau. Section 6 La diffraction des rayons X doit impliquer certains détails dans le fonctionnement de la ligne de faisceau.</li>
</ol>

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<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
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<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
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</ol>

ZR est l’inventeur des puces cristal sur cristal sur le brevet américain 9632042 accordé à Renz Research, Inc.

Dans les premières années, la cristallographie des protéines réalisée à température ambiante a eu énormément de difficulté à lutter contre les dommages causés par les rayons X. Ainsi, il a été remplacé par la méthode de cryocristallographie plus robuste à mesure que les sources de rayons X synchrotron devenaient facilement disponibles20. Avec l’avènement des lasers à rayons X à électrons libres, la cristallographie des protéines à température ambiante a été relancée ces dernières années, avec de n...

En raison des effets ionisants des rayons X, la cristallographie des protéines, dans une large mesure, a été limitée aux conditions cryogéniques au cours des trois dernières décennies. Par conséquent, les connaissances actuelles sur les mouvements des protéines au cours de leur fonction découlent en grande partie de comparaisons entre des structures statiques observées dans différents états dans des conditions cryogéniques. Cependant, les températures cryogéniques entravent inévitablement la progression d’une réaction biochimique ou d’une interconversion entre différents états conformationnels pendant que les molécules de protéines sont à l’œuvre. Pour observer directement la dynamique structurale des protéines à la résolution atomique par cristallographie, des méthodes robustes et de routine sont nécessaires pour mener des expériences de diffraction à température ambiante, ce qui nécessite des innovations techniques dans la livraison d’échantillons, la collecte de données et l’analyse de données postérieures. À cette fin, les progrès récents de la cristallographie en série ont ouvert de nouvelles voies pour capturer les images moléculaires d’espèces intermédiaires et structurales à vie courte à température ambiante 1,2,3. Contrairement à la stratégie « un cristal, un ensemble de données » largement utilisée en cryocristallographie conventionnelle, la cristallographie en série adopte une stratégie de collecte de données similaire à celle de la cryo-microscopie électronique à une particule. Plus précisément, les données expérimentales en cristallographie en série sont collectées en petites fractions à partir d’un grand nombre d’échantillons individuels, suivies d’un traitement intensif des données dans lequel les fractions de données sont évaluées et combinées en un ensemble de données complet pour la détermination de la structure 3D4. Cette stratégie « un cristal, un coup » atténue efficacement les dommages causés par les rayons X aux cristaux de protéines à température ambiante via une stratégie de diffraction avant destruction5.
Étant donné que la cristallographie en série nécessite un grand nombre de cristaux de protéines pour compléter un ensemble de données, elle pose des défis techniques majeurs pour de nombreux systèmes biologiques où les échantillons de protéines sont limités et / ou la manipulation délicate des cristaux est impliquée. Une autre considération importante est la meilleure façon de préserver l’intégrité des cristaux dans les expériences de diffraction en série. Les méthodes de diffraction in situ répondent à ces préoccupations en permettant aux cristaux de protéines de se diffracter directement de l’endroit où ils se développent sans briser le sceau de la chambre de cristallisation 6,7,8,9. Ces méthodes sans manipulation sont naturellement compatibles avec la diffraction série à grande échelle. Nous avons récemment annoncé la conception et la mise en œuvre d’un dispositif de cristallisation pour la diffraction in situ basé sur un concept cristal sur cristal - cristaux de protéines cultivés directement sur quartz monocristallin11. Cet appareil « cristal sur cristal » offre plusieurs avantages. Tout d’abord, il dispose d’une fenêtre transparente aux rayons X et à la lumière faite d’un substrat de quartz monocristallin, qui produit peu de diffusion de fond, ce qui se traduit par d’excellents rapports signal sur bruit dans les images de diffraction à partir de cristaux de protéines. Deuxièmement, le quartz monocristallin est un excellent pare-vapeur équivalent au verre, fournissant ainsi un environnement stable pour la cristallisation des protéines. En revanche, d’autres dispositifs de cristallisation utilisant des substrats à base de polymères sont sujets au séchage en raison de la perméabilité à la vapeur, sauf si le matériau polymère a une épaisseur substantielle, ce qui contribue par conséquent à une diffusion de fond élevée10. Troisièmement, ce dispositif permet l’administration d’un grand nombre de cristaux de protéines au faisceau de rayons X sans aucune forme de manipulation ou de récolte des cristaux, ce qui est essentiel pour préserver l’intégrité des cristaux11.
Pour rationaliser les expériences de diffraction des rayons X en série à l’aide des dispositifs cristal sur cristal, nous avons développé un prototype de diffractomètre pour faciliter la commutation entre les modes de balayage optique et de diffraction des rayons X12. Ce diffractomètre a un faible encombrement et a été utilisé pour la collecte de données en série sur deux lignes de faisceau de la source avancée de photons (APS) au laboratoire national d’Argonne. Plus précisément, nous avons utilisé BioCARS 14-ID-B pour la diffraction Laue et LS-CAT 21-ID-D pour l’oscillation monochromatique. Ce diffractomètre n’est pas nécessaire si un synchrotron ou une ligne de faisceau laser à rayons X à électrons libres est équipé de deux capacités clés : (1) positionnement d’échantillon motorisé avec une plage de course de ±12 mm autour du faisceau de rayons X dans toutes les directions; et (2) un appareil photo numérique sur axe pour l’observation des cristaux sous éclairage lumineux qui est sans danger pour les cristaux de protéines à l’étude. Le dispositif à quartz monocristallin ainsi qu’un diffractomètre portable et le logiciel de contrôle pour le balayage optique, la reconnaissance cristalline et la collecte automatisée de données in situ constituent collectivement la plate-forme inSituX pour la cristallographie en série. Bien que ce développement soit principalement motivé par ses applications de cristallographie dynamique utilisant une source de rayons X polychromatique, nous avons démontré le potentiel de cette technologie pour soutenir les méthodes d’oscillation monochromatique10,12. Grâce à l’automatisation, cette plate-forme offre une méthode de collecte de données en série à haut débit à température ambiante avec une consommation de protéines abordable.
Dans cette contribution, nous décrivons en détail comment mettre en place la cristallisation sur puce dans un laboratoire humide et comment effectuer la collecte de données de rayons X en série sur une ligne de faisceau synchrotron à l’aide de la plate-forme inSituX.
La méthode par lots est utilisée pour mettre en place la cristallisation sur puce dans des conditions similaires à celles de la méthode de diffusion de vapeur obtenue pour le même échantillon de protéines (tableau 1). Comme point de départ, nous recommandons d’utiliser un précipitant à une concentration de 1,2 à 1,5 fois celle de la méthode de diffusion de vapeur. Si nécessaire, les conditions de cristallisation des lots peuvent être optimisées davantage grâce à un criblage fin par grille. Les plaquettes de quartz ne sont pas nécessaires pour les essais d’optimisation; Les lamelles de couverture en verre peuvent être utilisées à la place (voir ci-dessous). Les dispositifs de cristallisation partiellement chargés sont recommandés pour conserver les essais d’optimisation à plus petite échelle. Un certain nombre d’échantillons de protéines ont été cristallisés avec succès sur de tels dispositifs en utilisant la méthode par lots10 (tableau 1).
Le dispositif lui-même se compose des parties suivantes: 1) une bague extérieure; 2) deux plaquettes de quartz; 3) une cale en forme de rondelle en plastique ou en acier inoxydable; 4) un anneau de retenue; 5) l’huile d’immersion pour microscope comme scellant (figure 1). Le volume total de la solution de cristallisation chargée sur une puce dépend du but de l’expérience. La capacité de la chambre de cristallisation peut être ajustée en choisissant une cale de différentes épaisseurs et/ou diamètres intérieurs. Nous mettons régulièrement en place des dispositifs de cristallisation d’une capacité de 10 à 20 μL à l’aide de cales de 50 à 100 μm d’épaisseur. Un dispositif typique peut produire des dizaines à des milliers de cristaux de protéines adéquats pour la collecte de données en série (Figure 2).
En cas de succès, la cristallisation sur puce produira des dizaines, voire des centaines, voire des milliers de cristaux de protéines sur chaque dispositif à quartz prêt pour la diffraction des rayons X. Sur une ligne de faisceau synchrotron, un tel dispositif est monté sur un étage de translation à trois axes du diffractomètre à l’aide d’un mécanisme cinématique. La fenêtre de cristallisation d’un dispositif monté est balayée optiquement et imagée dans des dizaines à des centaines de micrographies. Ces micrographies sont ensuite assemblées dans un montage haute résolution. Pour les cristaux photosensibles, le balayage optique peut être effectué sous lumière infrarouge (IR) pour éviter une photoactivation involontaire. Un logiciel de vision par ordinateur a été développé pour identifier et localiser les cristaux de protéines distribués au hasard sur l’appareil. Ces cristaux sont ensuite classés en fonction de leur taille, de leur forme et de leur position pour informer ou guider la stratégie de collecte de données en cristallographie sérielle. Par exemple, des tirs uniques ou multiples peuvent être localisés sur chaque cristal ciblé. Les utilisateurs pouvaient planifier un seul passage ou plusieurs itinéraires à travers des cristaux ciblés. Nous avons mis en place un logiciel pour calculer différents itinéraires de voyage. Par exemple, l’itinéraire le plus court est calculé à l’aide d’algorithmes qui résolvent le problème du vendeur itinérant13. Pour les applications cristallographiques dynamiques pompe-sonde, le moment et la durée des tirs laser (pompe) et à rayons X (sonde) peuvent être choisis. Une collecte automatisée de données en série est programmée pour transférer chaque cristal ciblé dans le faisceau de rayons X l’un après l’autre.
Les composants clés du diffractomètre insituX comprennent: 1) un support de dispositif; 2) une étape de traduction à trois axes; 3) une source lumineuse pour le balayage optique; 4) un arrêt de faisceau de rayons X; 5) pomper des lasers si des protéines photosensibles sont étudiées; 6) Micro-ordinateur Raspberry Pi équipé d’une caméra sensible aux infrarouges; 7) Logiciel de contrôle pour synchroniser les moteurs, la caméra, les sources lumineuses, le laser de la pompe et pour l’interface avec les commandes de ligne de faisceau.

<table><tbody><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>Développement</td><td></td><td></td>interne Huile</tr><tr><td></td><td>d’aluminium dopé</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> au cérium <tr><td></td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Type A faible viscosité 150 cSt</td></tr><tr><td>Plate-forme inSituX</td> Source lumineuse IR développée <td></td><td></td><td>en interne</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED avec une lentille en verre, 1085 nm, 5 mW, microscope TO-18</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Anneau extérieur</td><td>Boîte</td> de Pétri Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scietific</td><td>développée</td> en interne FB0875713 <td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Pompe lasers</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, & Oslash ; 9 mm, E Pin Code, Diode Laser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Anneau</td> de retenue de fondation <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Raspberry Pi Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 Anneau de retenue pour &Oslash ; Tubes d’objectif et montures</td></tr><tr><td>1" Cristal de quartz sans pépins</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm de diamètre Coupe en Z 0,05 mm d’épaisseur Polissage double face 8 mm sur -</td></tr><tr><td>X Cale</td> Arrêt de faisceau de rayons X <td>développé</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>en interne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Les réactions biochimiques et les processus biologiques peuvent être mieux compris en démontrant comment les protéines font la transition entre leurs états fonctionnels. Étant donné que les températures cryogéniques ne sont pas physiologiques et peuvent prévenir, dissuader ou même modifier la dynamique structurelle des protéines, une méthode robuste pour les expériences de diffraction des rayons X de routine à température ambiante est hautement souhaitable. Le dispositif cristal sur cristal et le matériel et les logiciels qui l’accompagnent utilisés dans ce protocole sont conçus pour permettre la diffraction in situ des rayons X à température ambiante pour les cristaux de protéines de différentes tailles sans aucune manipulation d’échantillon. Nous présentons ici les protocoles pour les étapes clés de l’assemblage de l’appareil, de la cristallisation sur puce, du balayage optique, de la reconnaissance des cristaux à la planification des tirs aux rayons X et à la collecte automatisée des données. Étant donné que cette plate-forme ne nécessite aucune récolte de cristaux ni aucune autre manipulation d’échantillons, des centaines, voire des milliers de cristaux de protéines cultivés sur puce peuvent être introduits dans un faisceau de rayons X de manière programmable et à haut débit.

Plusieurs ensembles de données représentatifs ont été publiés au cours des dernières années 10,12 ainsi que les résultats cristallographiques et les découvertes scientifiques d’un large éventail d’échantillons de protéines, y compris des protéines photoréceptrices et des enzymes, par exemple, un photorécepteur UV-B UVR8 végétal, une photolyase de réparation de l’ADN pilotée par la lumière PhrB10, une nouvelle protéine de détection de la lumière rouge lointaine d’une histidine kinase sen...

Cette contribution décrit comment configurer la cristallisation des protéines sur des dispositifs cristaux sur cristaux et comment effectuer une collecte automatisée de données série à température ambiante à l’aide de la plate-forme de cristallisation sur puce.

Cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Ce protocole démontre la cristallisation des protéines sur un dispositif semblable à une puce dans la collecte de données de diffraction des rayons X. Ce dispositif est appelé cristal sur cristal parce que les cristaux de protéines se développent sur un seul cristal de quartz. Après la croissance réussie des cristaux de protéines sur de tels dispositifs, des milliers d’images de diffraction sont collectées à partir de chaque dispositif à température ambiante sans même toucher les cristaux de protéines.La diffraction des rayons X à température ambiante est essentielle pour étudier la fonction des protéines impliquant de nombreux états conformationnels. Ces changements protéiques informatifs ou ces actions protéiques peuvent être congelés, donc non détectables en cryocristallographie. Ces dispositifs peuvent être utilisés pour étudier les processus de signalisation induits par la lumière et les changements redox.Seule une poignée d’appareils fournit des ensembles de données complets et redondants. Pour commencer le pré-assemblage de l’appareil, étiquetez la bague extérieure pour l’identification de l’échantillon. Incluez le nom du projet, le numéro de l’appareil, l’état de cristallisation et la date souhaitée.Ensuite, placez l’anneau étiqueté à l’envers sur une surface propre et placez une plaquette de quartz à l’intérieur de l’anneau extérieur. Ensuite, versez une petite quantité d’huile d’immersion pour microscope dans une boîte de Petri et trempez une cale dans l’huile en veillant à ce que les deux côtés de la cale soient bien enduits. Enlevez tout excès d’huile en tamponnant la cale sur une surface propre.Placez ensuite la cale huilée sur la première plaquette de quartz. Mélanger la solution protéique et le tampon de cristallisation sur la première plaquette de quartz à l’aide d’une pipette. Essayez d’éviter les bulles d’air lors du mélange.Le volume total de la solution de cristallisation ne doit pas dépasser la capacité maximale de la chambre de cristallisation déterminée par la taille et l’épaisseur de la cale Placez la deuxième plaquette de quartz sur la solution mélangée. La solution se répandra spontanément.Ensuite, tapotez légèrement la deuxième tranche de quartz sur le bord pour aider à répandre l’huile tout en expulsant l’air. Fixez l’appareil en vissant une bague de retenue dans la bague extérieure. Si nécessaire, utilisez un outil de serrage.Évitez de trop serrer car cela pourrait provoquer la déformation ou la fissuration des plaquettes de quartz délicates. Conservez les appareils assemblés dans une boîte à température ambiante ou à l’intérieur d’un incubateur à température contrôlée. Après quelques heures ou quelques jours, placez le dispositif de cristallisation sous un microscope et surveillez la croissance des cristaux.Si nécessaire, optimiser les conditions de cristallisation telles que décrites dans le manuscrit. Pour l’étalonnage, installez un cristal YAG mince sur le porte-puce, puis installez la butée du faisceau. Ensuite, ouvrez le logiciel Insitux et exécutez le programme indiqué pour prendre des images de fluorescence X du faisceau direct où le dispositif est un nom sélectionné par l’utilisateur pour le dispositif de cristallisation et le dispositif.param est le nom de fichier qui contient les paramètres de contrôle spécifiques au périphérique. Ensuite, trouvez la position précise du faisceau de rayons X direct en exécutant le programme d’ajustement du profil de faisceau où l’image de gravure est le nom de fichier de l’image de fluorescence X. Pour le balayage optique, placez un dispositif de cristallisation dans le porte-puce et fixez-le à l’aide d’une vis à molette.Montez ensuite le porte-puce sur l’étage de translation du diffractomètre à l’aide d’un mécanisme cinématique. Selon la sensibilité à la lumière de l’échantillon de protéines et le but de l’expérience, installez une source de lumière blanche ou infrarouge pour prendre des micrographies à partir de la fenêtre optique de l’appareil. Une fois la configuration prête, exécutez le programme de numérisation en entrant la commande indiquée pour la numérisation en mouvement sur la ligne de faisceau.Exécutez ensuite le programme de mosaïque sur un ordinateur utilisateur où x est la valeur initiale de la colonne et y est la valeur initiale des déplacements non autorisés des micrographies. Le programme assemble toutes les micrographies dans un montage d’une résolution de pixel d’un à trois micromètres. Après avoir assemblé les micrographies, entrez la commande indiquée pour exécuter le programme de recherche de cristaux.Ce programme effectue la reconnaissance des cristaux et la planification des tirs et les paramètres clés de ce programme permettent une sélection de cristaux spécifiques et une planification de la cible. Retirez la source lumineuse et positionnez la butée du faisceau. Exécutez ensuite le programme de collecte de données pour la diffraction série.La commande suggérée déclenche la collecte de données en visitant les plans planifiés dans une séquence préprogrammée. Chaque cristal ciblé est transloqué vers la position du faisceau. À chaque arrêt, l’exposition aux rayons X est prise avec ou sans éclairage laser à un délai prévu.Dans l’étude, les conditions de cristallisation entre la diffusion de vapeur et un lot sur puce ont été comparées. Quatre études de cas de cristallisation sur puce et des ensembles de données représentatifs recueillis directement à partir de dispositifs à quartz sont présentés ici. Les expériences de cristallographie dynamique ont révélé des changements induits par la lumière dans la protéine photoréceptrice rouge lointaine en comparant les données de 4 352 cristaux dans l’obscurité et de 8 287 cristaux après éclairage lumineux.L’ensemble de données sombres de la diffraction de Laue en série in situ a permis d’obtenir des densités électroniques mieux résolues, permettant la construction de modèles fiables d’un chromophore de bilin dans une conformation de signe Z entière. Les cartes des différences induites par la lumière ont révélé des mouvements concertés dans la feuille bêta centrale suggérant l’importance de l’empilement pi-pi entre les anneaux pyrrole du chromophore et plusieurs résidus aromatiques. Cette plateforme s’appelle Insitux.L’avantage unique de cette plate-forme est que l’on n’a pas à faire de manipulation de cristaux une fois la cristallisation terminée. Il est nécessaire de collecter de nombreux ensembles de données dans des conditions changeantes pour capturer les mouvements des protéines. Et cela devient possible avec Insitux car il permet la collecte de données à grande échelle à partir de milliers de cristaux de protéines à température ambiante.Avec cette nouvelle capacité incluant la cristallographie, les systèmes sensibles à la lumière peuvent être déclenchés à l’intérieur de l’appareil et le système inerte de lumière peut être étudié si le dispositif cristal sur cristal est converti en flux sortants.

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Ce protocole décrit en détail comment fabriquer et utiliser des dispositifs microfluidiques pour la collecte de données de diffraction des rayons x à la température ambiante. En outre, il décrit comment contrôler la cristallisation de protéines en diffusion dynamique de la lumière et comment traiter et analyser des données de diffraction a obtenu.

Puces microfluidiques pour diffusion de lumière dynamique Diffraction de rayons x de cristaux In Situ et In Situ pour série cristallographie

Cet article détaille le protocole de fabrication des puces microfluidiques développées pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de dialyse et les expériences in situ de diffraction des rayons X. Le processus de microfabrication permet d'intégrer une membrane de dialyse à cellulose régénérée semi-perméable avec n'importe quel coupure de poids moléculaire, entre deux couches de la puce.

Cristallisation des protéines sur puce par microdialyse pour les études in situ sur la diffraction des rayons X

Un dispositif microfluidique polyvalent est décrit qui permet la cristallisation d’une enzyme en utilisant la méthode de contre-diffusion, l’introduction d’un substrat dans les cristaux par trempage, et la détermination de la structure 3D de l’enzyme: substrat complexe par une analyse en série des cristaux à l’intérieur de la puce à température ambiante.

Cristallisation et détermination structurale d’une enzyme : complexe de substrat par cristallographie sérielle dans une puce microfluidique polyvalente

Nous présentons un protocole pour la cristallisation des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation du complexe de recherche à Harwell et la collecte ultérieure de données cristallographiques aux rayons X in situ à partir de cristaux à l’intérieur des plaques sur la ligne de faisceau VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ ) de Diamond. Nous décrivons les exigences en matière d’échantillons, les protocoles de cristallisation et les directives de collecte de données.

Cristallisation et collecte in situ de données à température ambiante à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de la ligne de faisceau VMXi, source de lumière au diamant

Nous décrivons des procédures pour la préparation et l’administration de microcristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la cristallographie en série à l’aide de lasers à rayons X à électrons libres et de sources synchrotron. Ces protocoles peuvent également être appliqués pour l’incorporation et l’administration de microcristaux de protéines solubles, ce qui permet de réduire considérablement la consommation d’échantillons par rapport à l’injection de liquide.

Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

Systèmes automatisés et protocoles pour l’établissement systématique d’un grand nombre d’écrans et des gouttelettes de cristallisation nanolitres pour expériences de diffusion de vapeur sont décrites et discutées.

Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.

Microcristallographie des cristaux de protéines et<em&gt; Dans Cellulo</em&gt; Diffraction

Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.

Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète

Par spectroscopie de résonance paramagnétique (EPR) est une méthode non équivoque pour mesurer des radicaux libres. L’utilisation de sondes de spin sélectif permet une détection des radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires. Nous présentons une méthode pratique et efficace pour collecter des échantillons biologiques qui facilitent le traitement, stockage et transfert des échantillons pour des mesures de l’EPR.

Utilisation de résonance paramagnétique électronique dans des échantillons biologiques à température ambiante et à 77 K

Nous présentons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli en exprimant conjointement un ARN chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt à un échafaudage viroïde et une usine ligase d’ARNt. Le produit principal est une molécule circulaire qui facilite la purification jusqu'à homogénéité.

Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli

Découvrez la cristallisation sur puce pour la diffraction X à température ambiante. Cette méthode permet l'étude des états conformationnels des protéines sans cryo-crystallographie.

Cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante

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