Name: Génération de transgéniques et de Knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez la microinjection intragonadale pour générer des knockouts et transgéniques chez Strongyloides stercoralis et S. ratti. Cette méthode permet d'étudier le développement et le parasitisme de ces nématodes.

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pPV540 et pPV402 étaient de bons cadeaux du Dr James Lok de l’Université de Pennsylvanie. Nous remercions Astra Bryant pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été financé par un Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, un Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award et National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole de microinjection détaille les méthodes d’introduction de constructions pour la transgénèse et la mutagénèse médiée par CRISPR/Cas9 chez S. stercoralis et S. ratti. Pour S. stercoralis et S. ratti, la survie post-injection et le taux de transgénèse ou de mutagénèse sont soumis à plusieurs variables qui peuvent être affinées.
La première considération critique pour une transgénèse réussie est la façon dont les transgènes plasmidiques sont constr...

Strongyloides stercoralis a longtemps été négligé comme un agent pathogène humain important par rapport aux ankylostomes plus largement reconnus et au ver rond Ascaris lumbricoides1. Des études antérieures sur la charge de vers ont souvent gravement sous-estimé la prévalence de S. stercoralis en raison de la faible sensibilité des méthodes de diagnostic courantes pour S. stercoralis2. Au cours des dernières années, des études épidémiologiques basées sur des outils de diagnostic améliorés ont estimé que la prévalence réelle des infections à S. stercoralis est beaucoup plus élevée que ce qui avait été rapporté précédemment, soit environ 610 millions de personnes dans le monde2.
S. stercoralis et d’autres espèces de Strongyloides, y compris le parasite de rat étroitement apparenté et le modèle de laboratoire commun S. ratti, ont un cycle de vie inhabituel qui est avantageux pour les études génomiques expérimentales car il se compose à la fois de générations parasites et libres (environnementales)3 (Figure 1). Plus précisément, S. stercoralis et S. ratti peuvent traverser une seule génération de vie libre. La génération de la vie libre se compose de larves post-parasites qui se développent en mâles et femelles adultes libres; toutes les descendants des adultes libres se développent en larves infectieuses, qui doivent infecter un hôte pour poursuivre le cycle de vie. De plus, cette génération environnementale ou libre peut être manipulée expérimentalement en laboratoire. Étant donné que les adultes Strongyloides vivant en liberté et les adultes de C. elegans partagent une morphologie similaire, des techniques telles que la microinjection intragonadale qui ont été développées à l’origine pour C. elegans peuvent être adaptées pour être utilisées avec des Strongyloides 4,5 adultes vivant en liberté. Alors que l’ADN est généralement introduit chez les femelles adultes libres, les mâles et les femelles de Strongyloides peuvent être microinjectés6. Ainsi, des outils génomiques fonctionnels sont disponibles pour interroger de nombreux aspects de la biologie des Strongyloides. D’autres nématodes parasites n’ont pas de génération libre et, par conséquent, ne se prêtent pas aussi facilement aux techniques génomiques fonctionnelles3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63023/63023fig01.jpg"> Figure 1 : Cycle de vie de Strongyloides stercoralis. Les femelles parasites de S. stercoralis habitent l’intestin grêle de leurs hôtes mammifères (humains, primates non humains, chiens). Les femelles parasites se reproduisent par parthénogenèse et pondent des œufs dans l’intestin grêle. Les œufs éclosent encore à l’intérieur de l’hôte en larves post-parasites, qui sont ensuite passées dans l’environnement avec des matières fécales. Si les larves post-parasites sont des mâles, elles se développent en mâles adultes libres. Si les larves postparasitaires sont des femelles, elles peuvent se développer en femelles adultes libres (développement indirect) ou en larves infectieuses de troisième stade (iL3s; développement direct). Les mâles et les femelles libres se reproduisent sexuellement pour créer une progéniture qui est contrainte de devenir des iL3. Dans certaines conditions, S. stercoralis peut également subir une auto-infection, dans laquelle certaines des larves postparasitaires restent à l’intérieur de l’intestin hôte plutôt que de passer dans l’environnement dans les matières fécales. Ces larves peuvent se développer en larves auto-infectieuses (L3a) à l’intérieur de l’hôte, pénétrer à travers la paroi intestinale, migrer à travers le corps et éventuellement retourner dans l’intestin pour devenir des adultes reproducteurs. Le cycle de vie de S. ratti est similaire, sauf que S. ratti infecte les rats et n’a pas de cycle auto-infectieux. La génération environnementale est essentielle à l’utilisation des espèces de Strongyloides pour les études génétiques. Les femelles adultes libres (P0) peuvent être microinjectées; leur progéniture, qui deviendront toutes des iL3, sont les transgéniques potentiels F1. Ce chiffre a été modifié à partir de Castelletto et al. 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63023/63023fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
S. stercoralis partage de nombreux aspects de sa biologie avec d’autres nématodes gastro-intestinaux parasitaires humains, y compris l’invasion de l’hôte et la modulation immunitaire de l’hôte. Par exemple, les ankylostomes parasitaires humains des genres Necator et Ancylostoma infectent également par pénétration cutanée, naviguent de manière similaire dans le corps et résident finalement comme des adultes parasites dans l’intestin grêle7. Ainsi, de nombreux nématodes gastro-intestinaux utilisent probablement des comportements sensoriels courants et des techniques d’évasion immunitaire. En conséquence, les connaissances glanées auprès de Strongyloides compléteront les découvertes chez d’autres nématodes moins génétiquement traitables et conduiront à une compréhension plus complète de ces parasites complexes et importants.
Ce protocole de micro-injection décrit la méthode d’introduction de l’ADN dans les femelles adultes strongyloïdes vivant librement pour fabriquer une progéniture transgénique et mutante. Les exigences en matière d’entretien de la souche, y compris le calendrier de développement des vers adultes pour les microinjections et la collecte de la progéniture transgénique, sont décrites. Des protocoles et une démonstration de la technique complète de micro-injection, ainsi que des protocoles pour la culture et le dépistage de la progéniture transgénique, sont inclus, ainsi qu’une liste de tous les équipements et consommables nécessaires.

<table><tbody><tr><td>(&minus ;)-Nicotine, &ge ; 99 % (GC), liquide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876-5ML</td><td>nicotine pour paralyser les vers</td></tr><tr><td>Fer 3 » C-clamp, 3 » x 2 » (capacité x profondeur)</td><td>VWR</td><td>470121-790</td><td>C-clamp pour sécuriser l’installation sur paillasse</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Phenix</td><td>RBA-500</td><td>agarose pour lames</td></tr><tr><td>Charbon d’os, seau de 4 lb, 10 x 28 mailles</td><td>Ebonex</td><td>n/a</td><td>charbon de bois pour cultures</td></tr> <tr><td>de charbon de bois fécalCharbon d’os, granulés, 10 x 28 mailles</td><td>Reade</td><td>bonechar10x28</td><td>charbon de bois pour cultures fécales (alternative à ce qui précède)</td></tr><tr><td>Micromanipulateur grossier</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td>Micromanipulateur grossier</td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X filtres à tube</td> centrifuge <td>Fisher</td><td>07-200-385</td><td>Colonne</td></tr> de <tr><td>couverture Verre de couverture, 48 x 60 mm, épaisseur n° 1</td><td>Brain Research Lab</td><td>4860-1</td><td>lamelles de protection (48 x 60 millimètres)</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri profondes, version lourde avec 6 évents, diamètre 100 mm</td><td>VWR</td><td>82050-918</td><td>Boîtes de Pétri de 10 cm (pour les cultures de charbon de bois fécal)</td></tr><tr><td>Base d’autoclave Eisco avec tige</td><td>Fisher</td><td>12-000-101</td><td>support pour appareil Baermann</td></tr><tr><td>Micro-injecteur Eppendorf FemtoJet Embouts de microchargeur</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>pour le remplissage d’aiguilles de micro-injection</td></tr><tr><td>Coussinets absorbants Fisherbrand</td><td></td> Fisher<td>14-206-62</td><td>Papier d’établi (pour la préparation)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Anneaux en fonte</td><td>Fisher</td><td>14-050CQ</td><td>Baermann Joint torique</td></tr><tr><td>Fisherbrand Béchers triangulaires en polypropylène Fisherbrand</td><td></td><td>Fisher 14-955-111F</td><td>Bécher en plastique (pour mélange)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Bécher triangulaire en polypropylène</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>Bécher en plastique (pour seau de récupération/seau d’eau)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Bécher triangulaire en polypropylène</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>Bécher en plastique (x2) (pour faire le support)</td></tr><tr><td>Gorilla epoxie dans une seringue</td><td>Colle McMaster-Carr</td><td>7541A51</td><td>(pour fixer le tube)</td></tr><tr><td>Huile d’halocarbure 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td> Huile <td>d’halocarbure</td></tr><tr><td>Tube en caoutchouc de silicone haute température pour aliments et boissons, 1/2 » ID, 5/8 » OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>3038K24</td><td>Tube (pour entonnoir</td></tr><tr><td>)Entonnoirs KIMAX, longue tige, 60&deg ; Angle, Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>89001-414</td><td>Entonnoir Baermann</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science protecteurs de paillasse</td><td>Fisher</td><td>15-235-101</td><td>papier de paillasse (pour préparation)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Leica avec fluorescence</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>GFP stéréomicroscope pour l’identification et le tri des vers transgéniques</td></tr><tr><td>microINJECTOR en laiton porte-aiguille à bras droit</td><td>Tritech</td><td>MINJ-4</td><td>porte-aiguille</td></tr> de <tr><td>micro-injection système microINJECTOR</td> Système de <td>micro-injection</td><td>Tritech</td><td>MINJ-1</td></tr><tr><td>Gerbilles mongoles</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>213-Gerbilles gerbilles mongoles</td><td>pour l’entretien de S. stercoralis, mâle 4-6 semaines</td></tr><tr><td>Nasco Whirl-Pak sacs faciles à fermer, 18 oz</td><td>VWR</td><td>11216-776</td><td>Sacs d’échantillons Whirl-Pak</td></tr><tr><td>Tulle en nylon (maille)</td><td>Jo-Ann Fabrics</td><td>zprd_14061949a</td><td>maille de nylon pour support Baermann</td></tr><tr><td>Fil de platine, calibre 36, par pouce</td><td>Thomas Scientific</td><td>1233S72</td><td>fil de platine/iridium pour pics à vis sans fin</td></tr><tr><td>Abaisse-langue puritains, 152 mm (L) x 17,5 mm (L) x 17,5 mm (L)</td><td>VWR</td><td>62505-007</td><td>bâtonnets en bois (pour mélanger des échantillons)</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAGEN miniprep kit</td></tr><tr><td>Rats-Long Evans</td><td>Envigo</td><td>140 HsdBlu :LE Rats Long Evans</td><td>pour l’entretien de S. ratti, femelle 4-6 semaines</td></tr><tr><td>Rats-Sprague Dawley</td><td>Envigo</td><td>002 Hsd :Sprague Dawley SD</td><td>rats pour l’entretien de S. ratti, femelle 4-6 semaines</td></tr><tr><td>Really Useful Boxes Boîtes de rangement translucides avec couvercles, capacité de 1,6 L, 7-5/8 » x 5-5/16 » x 4-5/16</td> » <td>Office Depot</td><td>452369</td><td>boîtes en plastique pour chambre</td></tr> <tr><td>humidifiéeShepherd techboard, 8 x 16,5 pouces</td><td>Newco</td><td>999589</td><td>techboard</td></tr><tr><td>Plancher en fil surélevé en acier inoxydable</td><td>Ancare</td><td>R20SSRWF</td><td>fonds de cage métallique Cuillères</td></tr> à <tr><td>couverts compostables StalkMarket, 6", blanc, paquet de 1 000</td><td>cuillères</td>à <td>9587303</td><td>Office Depot</td></tr><tr><td>Plat Stender, type empilable, 37 x 25 mm</td><td>Carolina (Science)</td><td>741012</td><td>verres de montre (petits, ronds)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Motic</td><td>K-400 LED</td><td>Dissection lunette</td></tr> de <tr><td>préparation Sac de rangement, couleur clair/blanc, hauteur extérieure 4-7/8 po, longueur extérieure 13-5/8 po, Sterilite</td><td>Grainger</td><td>53GN16</td><td>boîtes en plastique pour chambre humidifiée</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette Sutter P-30</td><td>Extracteur</td> d’aiguille Sutter <td>P-30/P</td><td>avec filament de platine/iridium</td></tr><tr><td>Lunettes de montre Syracuse</td><td>Fisher</td><td>S34826</td><td>lunettes de montre (grandes, rondes)</td></tr><tr><td>Pinces à angle fixe Thermo Scientific Castaloy</td><td>Fisher</td><td>05-769-2Q</td><td>Pinces à entonnoir (2x)</td></tr><tr><td>Micromanipulateur hydrolique à huile suspendu à trois axes</td><td>Narishige</td><td>MM0-4</td><td>Micromanipulateur fin</td></tr><tr><td>United Mohr Pinces à soudron</td><td>Fisher</td><td>S99422</td><td>Pinces à pince (2x)</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri ventilées à arêtes vives (60 mm de diamètre)</td><td>Tritech Recherche</td><td>T3308P</td><td>Boîtes de Pétri de 6 cm (pour les cultures de charbon de bois fécal à petite échelle)</td></tr><tr><td>Essuie-tout léger VWR</td> Doublure <td>VWR</td><td>82003-820</td><td>pour support de montre Baermann</td></tr><tr><td>en verre, carré, 1-5/8 en</td><td>Caroline (Science)</td><td>742300</td><td>lunettes de montre (petites, carrées)</td></tr><tr><td>Cercles unis de qualité qualitative Whatman, grade 1, 5,5 cm de diamètre</td><td>Papier filtre Fisher</td><td>09-805B</td><td>(pour Petri de 6 cm platsCercles</td></tr> <tr><td>simples de qualité qualitative Whatman, grade 1, 9 cm de diamètre</td><td>Papier filtre Fisher</td><td>09-805D</td><td>(pour boîtes de Pétri de 10 cm)</td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilicaté World Precision Instrument, 1,2 mm x 4 po</td><td></td> Fisher <td>50-821-813</td><td>Capillaires en verre pour aiguilles de micro-injection</td></tr><tr><td>Couteaux X-Acto, couteau n° 1 avec lame n° 11</td><td>Office Depot</td><td>238816</td><td>couteaux X-Acto sans lames pour tenir les pics à vis sans fin</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver A1</td><td>Microscope inversé</td> <td>Zeiss</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

génération de transgéniques et de knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

Le genre Strongyloides se compose de plusieurs espèces de nématodes pénétrant dans la peau avec différentes gammes d’hôtes, y compris Strongyloides stercoralis et Strongyloides ratti. S. stercoralis est un nématode parasite humain, pénétrant dans la peau, qui infecte environ 610 millions de personnes, tandis que le parasite du rat S. ratti est étroitement lié à S. stercoralis et est souvent utilisé comme modèle de laboratoire pour S. stercoralis. S. stercoralis et S. ratti se prêtent facilement à la génération de transgéniques et de knockouts grâce à la technique exogène d’administration d’acides nucléiques de la microinjection intragonadale et, en tant que tels, sont devenus des systèmes modèles pour d’autres helminthes parasites qui ne se prêtent pas encore à cette technique.
Les adultes parasites Strongyloides habitent l’intestin grêle de leur hôte et libèrent de la progéniture dans l’environnement via les matières fécales. Une fois dans l’environnement, les larves se développent en adultes libres, qui vivent dans les excréments et produisent une progéniture qui doit trouver et envahir un nouvel hôte. Cette génération environnementale est unique à l’espèce Strongyloides et sa morphologie est suffisamment similaire à celle du nématode vivant librement Caenorhabditis elegans pour que les techniques développées pour C. elegans puissent être adaptées pour être utilisées avec ces nématodes parasites, y compris la microinjection intragonadaire. En utilisant la microinjection intragonadienne, une grande variété de transgènes peuvent être introduits dans Strongyloides. Les composants CRISPR/Cas9 peuvent également être microinjectés pour créer des larves mutantes de Strongyloides . Ici, la technique de microinjection intragonadale en Strongyloides, y compris la préparation d’adultes libres, la procédure d’injection et la sélection de la progéniture transgénique, est décrite. Des images de larves transgéniques de Strongyloides créées à l’aide de la mutagénèse CRISPR/Cas9 sont incluses. L’objectif de cet article est de permettre à d’autres chercheurs d’utiliser la microinjection pour créer des Strongyloides transgéniques et mutants.

Si l’expérience est couronnée de succès, les larves F1 exprimeront le phénotype transgénique et/ou mutant d’intérêt (Figure 4). Cependant, les taux de transformation sont très variables et dépendent des constructions, de la santé des vers, des conditions de culture post-injection et de l’habileté de l’expérimentateur. En général, une expérience réussie donnera &gt;15 larves F1 par femelle injectée et un taux de transformation de &gt;3% pour les marqueurs fluorescents. S...

La boîte à outils génomique fonctionnelle pour les nématodes parasites Strongyloides stercoralis et Strongyloides ratti comprend la transgénèse, la mutagénèse médiée par CRISPR / Cas9 et l’ARNi. Ce protocole montrera comment utiliser la microinjection intragonadienne pour introduire des transgènes et des composants CRISPR dans S. stercoralis et S. ratti.

Génération de transgéniques et de Knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

L’utilisation de la microinjection pour fournir des constructions d’ADN dans strongyloides nous permet de générer des knockouts et des transgéniques, qui peuvent être utilisés pour étudier comment ces vers se développent, naviguent dans leur environnement et parasitent les hôtes. Jusqu’à présent, c’est la seule technique efficace pour générer des knockouts et des transgéniques chez ces parasites. Un jour avant la microinjection, ajouter 180 microlitres de la solution d’agarose sur un bordereau de couverture à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, puis déposer immédiatement un deuxième glissement de couvercle sur le dessus pour aplatir l’agarose dans un tampon mince.Après 5 à 10 secondes, retirez le glissement du couvercle supérieur en faisant glisser les deux et déterminez sur quelle glissière se trouve le coussinet de gélose et posez-le face vers le haut. Ensuite, sélectionnez un minuscule morceau de fragment de verre à partir d’un couvercle cassé et, à l’aide d’une pince, appuyez doucement dans la gélose près du bord supérieur du tampon. Le jour de la microinjection, tapissez le support Baermann, qui est un tamis fabriqué à partir de deux anneaux en plastique avec deux couches de filet de tuile en nylon fixé entre eux avec trois morceaux de tissu de laboratoire qui se chevauchent.Ajoutez ensuite le mélange fécal-charbon de bois au support Baermann. Ensuite, placez le support Baermann avec le mélange fécal-charbon de bois dans l’entonnoir, pliez les morceaux de tissus autour du mélange fécal-charbon de bois et ajoutez suffisamment d’eau pour submerger la majeure partie du charbon fécal. Ensuite, recouvrez l’entonnoir avec un couvercle de boîte de Petri en plastique de 15 centimètres pour contenir l’odeur et étiquetez l’entonnoir au besoin.Après une à deux heures, tenez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres sous le tube en caoutchouc au bas de l’entonnoir et ouvrez soigneusement les pinces au fond pour distribuer 30 à 40 millilitres d’eau contenant des vers dans le tube de 50 millilitres. Alors. transférer 15 millilitres d’eau Baermann contenant les vers dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Faites tourner le tube, retirez jusqu’à 13 millilitres du surnageant et jetez-le dans un récipient à déchets liquides avec de l’iode pour tuer les vers.Après avoir collecté tous les vers, inspectez la pastille de vers au fond du tube. Si aucun ver n’est visible, attendez une à deux heures, puis collectez d’autres vers de l’appareil Baermann. Transférez les vers dans le moins d’eau possible dans une plaque de milieu de croissance de nématode de six centimètres à 2% avec une pelouse d’E. coli HB101 et utilisez cette plaque comme plaque source pour la microinjection.Sous le microscope à dissection, recouvrez le tesson de verre sur le couvercle du tampon de micro-injection avec de l’huile d’halocarbure à l’aide d’un pic à ver de platine standard. Ensuite, placez le couvercle du tampon de micro-injection sur la lunette de micro-injection et localisez le tesson de verre recouvert d’huile. Alignez le tesson de verre de manière à ce qu’un bord soit perpendiculaire à la direction de l’aiguille pour servir de surface utilisée pour casser l’aiguille.Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, assurez-vous que l’aiguille n’a pas de bulles ou de débris dans l’arbre conique, puis fixez l’aiguille de 1 à 1,5 centimètre dans le support sous pression. Positionnez la pointe de l’aiguille au centre du champ de vision du microscope à l’œil nu et sous un faible grossissement, positionnez la pointe de l’aiguille dans le champ de vision perpendiculairement au côté du tesson de verre. Ensuite, passez à un grossissement plus élevé et alignez la pointe de l’aiguille avec le bord du verre, près, mais sans le toucher.Ensuite, pour casser la pointe de l’aiguille et permettre à l’écoulement du liquide, tapotez doucement l’aiguille sur le côté du morceau de verre tout en appliquant une pression continue du gaz. Une fois que le liquide commence à couler, vérifiez la forme de la pointe et assurez-vous qu’elle est tranchante avec un liquide qui s’écoule facilement. Lorsque le liquide s’écoule bien de l’aiguille, déplacez la lame de micro-injection vers la lunette de dissection et ajoutez un à deux microlitres d’huile d’halocarbure sur le tampon de gélose pour le placement des vers.Transférer 20 à 30 strongyloïdes jeunes adultes sur une plaque de milieu de croissance de nématodes à 2 % sans bactéries pendant au moins cinq minutes pour éliminer les bactéries de surface en excès et sélectionner des vers uniques pour la microinjection. Ajoutez plus de vers à la plaque au besoin lors de l’injection. En utilisant une petite quantité d’huile d’halocarbure sur un pic à vers, sélectionnez une jeune femelle adulte Strongyloides avec un à quatre œufs dans sa gonade de la plaque sans bactéries et transférez le ver dans une petite goutte d’huile sur le tampon de gélose.À l’aide du pic à ver, positionnez doucement le ver de sorte qu’il ne soit pas enroulé et que la gonade soit visible et facile d’accès. Ensuite, positionnez le ver dans le champ de vision du microscope à micro-injection, en vous assurant que la gonade est du même côté que l’aiguille et positionnée de manière à ce que l’aiguille entre en contact avec la gonade à un léger angle. Ensuite, amenez la pointe de l’aiguille sur le côté du ver dans le même plan focal.Ensuite, en visant le bras de la gonade près du milieu du ver, insérez doucement l’aiguille dans la gonade à l’aide d’un micro-injecteur. Appliquez immédiatement une pression sur l’aiguille pour remplir doucement tout le bras de la gonade avec la solution d’ADN. Une fois que suffisamment de liquide a été injecté, retirez l’aiguille et observez que la plaie se ferme.Répétez la procédure avec l’autre bras de la gonade, si elle est visible. Une fois l’injection terminée, vérifiez rapidement que l’aiguille n’est pas obstruée en appliquant une pression avec la pointe de l’aiguille sur le tampon de gélose, puis transférez la lame avec le ver injecté au microscope à dissection. Pour récupérer le ver injecté, placez d’abord quelques gouttes de solution saline tamponnée par le ver sur le ver pour le faire flotter hors du tampon de gélose.Ensuite, collectez une petite quantité de bactéries sur un pic à vers et touchez le ver avec les bactéries adhérentes pour l’éliminer du liquide. Transférez doucement le ver sur la plaque de récupération. Pour les expériences comportementales, transférez 20 à 30 larves sur une plaque de milieu de croissance de nématodes à 2% avec une pelouse épaisse de bactéries HB101 et, sous un microscope à dissection par fluorescence, identifiez les larves exprimant le transgène d’intérêt.Ensuite, à l’aide d’un pic à vers, sélectionnez les larves transgéniques et placez-les dans un petit verre de montre avec une solution saline tamponnée par les vers. Pour la microscopie, à l’aide d’une lame de rasoir, marquez une grille sur le fond en plastique d’une plaque de chimiotaxie de 10 centimètres pour suivre facilement l’emplacement des vers sur la plaque. Ensuite, ajoutez trois microlitres de larves dans une solution saline tamponnée par les vers dans un carré de la grille, en remplissant autant de carrés que nécessaire.Ajoutez ensuite des gouttes de 15 à 20 microlitres de nicotine à 1% dans l’eau aux gouttes de ver. Après quatre minutes, lorsque les vers sont paralysés, filtrez-les à l’aide d’un microscope à dissection à fluorescence. Les larves transgéniques de Strongyloides stercolaris avec un modèle d’expression de l’acte-2 mRFPmars incomplet et complet sont montrées ici.L’expression inégale dans le muscle de la paroi corporelle est plus fréquente lorsque le transgène n’est pas intégré dans le génome. En revanche, une expression cohérente dans tout le muscle de la paroi corporelle indique souvent que le transgène s’est intégré dans le génome. L’étape clé consiste à positionner l’aiguille dans le même plan de mise au point que la gonade pour s’assurer que l’ADN est injecté dans la gonade et sera incorporé dans les œufs en développement.Le développement de cette technique a permis d’étudier la fonction des gènes chez les nématodes parasites, ce qui fournit de nouvelles informations sur les mécanismes du parasitisme et les interactions hôte-parasite.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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L’efficacité de la méthode I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) est comparable à celle de la micro-injection traditionnelle, qui nécessite la collecte de zygotes sur les femelles donneuses et le transfert à des femelles pseudo-enceintes. Ce protocole démontre son efficacité en introduisant des mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le locus ROSA26 sur le chromosome 6.

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Cet article démontre l’ingénierie du génome médiée par CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum, un nématode entomopathogène (EPN : parasite insecte) et un modèle génétique émergent. La technologie décrite est utile pour créer des mutants, permettant d’élucider les fonctions géniques en biologie des nématodes pertinentes pour la symbiose mutualiste et parasitaire.

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