Technique d’obtention de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux et caractérisation de la fraction vasculaire stromale dans la cryoconservation à long terme

Ici, nous avons démontré le protocole pour obtenir et préserver les cellules bonnes et viables pour des utilisations d’étapes thérapeutiques, comme la perfusion de cellules mésenchymateuses pluripotentes. Le principal avantage de ceci, qu’en utilisant cette technique, nous pouvons obtenir le volume cellulaire viable en fonction du temps gagné dans l’étape d’isolement des cellules à partir du tissu collecté. Cette technique peut être étendue à toutes les maladies ou affections où la médecine hétérogénique et la thérapie cellulaire sont appliquées.

Cette méthode peut également être appliquée aux tests de stabilité cytogénomique dans des domaines tels que les tests de médicaments, où les cultures cellulaires à long terme peuvent être encouragées. Chaque fois que vous manipulez les cellules vivantes, soyez calme et confiant. Prenez des précautions extrêmes avec la septicémie et soyez constamment vigilant avec les yeux d’un scientifique pour observer toute adversité et prendre de bonnes décisions.

Commencez par peser le sac et mesurer la température à l’aide d’un thermomètre clinique infrarouge numérique sans contact. Laissez le sac pendant cinq minutes à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire pour précipiter les couches graisseuses et séparer le tissu contenant les cellules. Injectez 100 millilitres de DPBS avec du calcium dans le sac de transfert et mélangez-le avec les mains.

Laissez-le reposer pendant cinq minutes. Utilisez ensuite une seringue de 60 millilitres fixée à l’adaptateur de sac pour éliminer la majeure partie du liquide basal qui précipite. Répétez ce processus deux fois.

Ajouter 100 millilitres de la solution de digestion dans le sac et laisser à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sous agitation lente. Ensuite, transférez tout le contenu du sac dans quatre tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez-les à 400 G pendant 10 minutes à 22 degrés Celsius. Jeter le surnageant et ajouter 5 millilitres de DMEM à faible teneur en glucose complété par 20% de sérum bovin fœtal à la pastille cellulaire.

Mélanger une solution fraîche de 10 microlitres de bleu de trypan à 0,05% dans de l’eau distillée avec 10 microlitres de suspension cellulaire pendant cinq minutes. Utilisez un microscope à lumière inversée à un grossissement de 20X et comptez les cellules viables dans une chambre de comptage de cellules Neubauer. Suspendre la pastille cellulaire dans un milieu cryoprotecteur à une concentration de 1 million de cellules par millilitre.

Placez ensuite 1 millilitre de ce mélange dans des flacons cryogéniques. Utilisez un contenant congelé avec une vitesse de refroidissement de 1 degré Celsius par minute et conservez à 80 degrés Celsius pendant un an. Après un an, stockez-le dans des boîtes de cassettes standard immergées dans une phase vapeur d’azote liquide.

Les données des différentes étapes de la procédure des neuf patients sont présentées dans ce tableau. Selon le rendement cellulaire initial, un volume variable de cellules pour chaque échantillon a été déterminé. 1 millilitre d’échantillons avec un rendement cellulaire plus élevé, 1,1 millilitre pour les échantillons avec un rendement cellulaire intermédiaire et 2 millilitres par échantillon avec un rendement cellulaire inférieur.

Le rendement cellulaire avant passage variait largement, même lorsque la même confluence avant trypsinisation était observée. Par conséquent, ici, les cellules peuvent avoir grandi en couches. L’image représentative montre les ADSC mésenchymateux adhérents au plastique au premier passage après isolement en microscopie optique.

Les cellules montrent une adhésion à la morphologie de type plastique et fibroblaste. Les cellules viables comptées dans la chambre de Neubauer dans le dosage du bleu de trypan sont montrées ici. Les données de cytométrie en flux de six patients sont présentées dans ce tableau.

À partir de ces cellules CD45 négatives, le pourcentage d’ADSC avec différentes combinaisons de marqueurs de cellules souches a été déterminé. Les images représentatives montrent la sous-population de cellules positives pour les marqueurs associés aux cellules souches dans la SVF du cas neuf après huit mois de cryoconservation. Ici, R1 est la région cellulaire totale analysée dans le diagramme de diffusion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale.

Et R2 est la région CD45 négative. Les populations de CD73, CD90 et CD105 sont positives dans cette région. La différenciation ADSC dans les chondrocytes, les ostéocytes et les adipocytes est illustrée ici.

En essayant cette procédure, n’oubliez pas de remuer lentement, de préférence avec les mains, tout en laissant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour observer les adhérences et les cloques. Maintenez la température de la pièce de travail autour de 25 degrés Celsius et évitez tout choc thermique à des températures beaucoup plus élevées. La technique que nous avons montrée ici peut être utilisée avec succès pour isoler les cellules mésenchymateuses pluripotentes d’autres tissus.