Name: Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Découvrez l'évaluation de la bioénergétique cellulaire chez les cellules souches hématopoïétiques de souris en temps réel. Cette méthode à haut débit permet d'analyser les fonctions glycolytiques et mitochondriales avec une grande sensibilité.

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Les travaux en laboratoire Lombard sont soutenus par les NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), doD (CA190267, CA170628, NF170044 et ME200030) et la Glenn Foundation for Medical Research. Le travail en laboratoire Li est soutenu par les NIH (NHLBI 5R01HL150707).

<ol><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
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<li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+%28HSPCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
<li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li>
<li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells%3A+new+perspectives+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%2C+Fourth+Edition%22">Bioenergetics, Fourth Edition</a>. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).</li>
<li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent%3A+mechanism+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Cet article de méthode décrit un protocole optimisé pour l’évaluation de la bioénergétique cellulaire (glycolyse et OxPHOS) dans les HSPC de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse. Cet appareil est un outil puissant qui mesure simultanément l’ECAR et l’OCR des cellules vivantes, qui sont des mesures de la glycolyse et de la respiration mitochondriale, respectivement. Ainsi, il peut être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel. De plus, la plate-forme à base de microplaques...

L’hématopoïèse est le processus par lequel divers types de cellules sanguines matures ayant des fonctions hautement spécialisées sont formés à partir deCSH 1. Les CSH sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en diverses populations progénitrices multipotentes et spécifiques à la lignée. Ces progéniteurs produisent finalement des cellules de lignées lymphoïdes, myéloïdes, érythroïdes et mégacarytaires. Pour maintenir leur capacité d’auto-renouvellement, les CSH restent en grande partie au repos et, comme d’autres cellules souches tissulaires, on pense qu’elles reposent sur la glycolyse plutôt que sur l’OxPHOS mitochondrial pour la production d’ATP 2,3. L’entrée dans le cycle cellulaire entraîne une amélioration de la respiration et de l’OxPHOS, ce qui entraîne des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui nuisent au maintien et à la fonctionHSC 3. Une division cellulaire répétée peut donc conduire à une réduction de la capacité d’auto-renouvellement des CSH et, finalement, à leur épuisement.
Dans l’hématopoïèse adulte, les CSH subissent principalement une division cellulaire asymétrique, au cours de laquelle l’une des cellules filles conserve le potentiel HSC et continue de dépendre du métabolisme glycolytique. L’autre cellule fille devient une cellule progénitrice primitive qui perd sa capacité d’auto-renouvellement mais prolifère et finit par donner naissance à des cellules hématopoïétiques fonctionnelles différenciées4. Lorsque les CSH se différencient pour produire des progéniteurs en aval, on pense qu’un passage de la glycolyse au métabolisme mitochondrial se produit pour fournir l’énergie et les blocs de construction nécessaires pour soutenir cette transition rapide5, comme le suggèrent les observations selon lesquelles les CSH possèdent une masse mitochondriale inactive 6,7,8,9 . En revanche, l’activité mitochondriale (indiquée par les niveaux de ROS liés) est beaucoup plus élevée chez les progéniteurs engagés dans la lignée que dans les CSH 9,10,11. Les changements métaboliques qui se produisent au cours de la première étape de l’hématopoïèse suggèrent donc un rôle direct et crucial des mitochondries dans la régulation du devenir du HSC.
Les mitochondries dysfonctionnelles présentes dans diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité12, peuvent interférer avec la capacité d’auto-renouvellement des CSH, induisant un déséquilibre dans la différenciation des CSH / progéniteurs en produisant des quantités excessives de ROS, en altérant la production d’ATP et / ou en modifiant d’autres processus métaboliques 9,12,13 . Les perturbations de l’homéostasie métabolique dans la différenciation HSC/progéniteur pourraient avoir un impact significatif sur l’hématopoïèse, contribuant potentiellement au développement d’anomalies hématologiques13. Compte tenu des influences critiques de la glycolyse et de l’OxPHOS mitochondrial sur la tige et la différenciation des CSH, il est intéressant d’étudier à la fois les paramètres métaboliques dans des conditions normales et de stress. Des informations précieuses sur la fonction glycolytique et mitochondriale des CSH et des cellules progénitrices peuvent être obtenues en évaluant leur ECAR et leur OCR, qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.
L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse est un appareil puissant équipé de deux sondes par puits pour mesurer simultanément l’ECAR et l’OCR dans les cellules vivantes et peut donc être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel, en réponse à divers substrats ou inhibiteurs. La cartouche de dosage utilisée avec l’analyseur contient des orifices d’injection pour contenir jusqu’à quatre médicaments pour injection automatisée pendant le test. Un schéma d’un test de stress typique de glycolyse est illustré à la figure 1A. Le test commence par la mesure de l’ECAR des cellules, incubées dans un milieu de test de stress de glycolyse contenant de la glutamine mais pas du glucose ou du pyruvate. Cela représente l’acidification due aux activités non glycolytiques des cellules et est rapporté comme une acidification non glycolytique. Ceci est suivi par l’injection de glucose à une concentration saturante. Par glycolyse, le glucose dans la cellule est converti en pyruvate, qui est ensuite métabolisé dans le cytoplasme pour produire du lactate, ou dans les mitochondries pour produire du CO2 et de l’eau.
La conversion du glucose en lactate provoque une production nette et une libération ultérieure de protons dans le milieu extracellulaire, ce qui entraîne une augmentation rapide de l’ECAR 14,15,16. Ce changement stimulé par le glucose dans l’ECAR est rapporté comme glycolyse dans des conditions basales. La deuxième injection consiste en oligomycine (un inhibiteur de l’ATP synthase, alias complexe V17), qui inhibe la production mitochondriale d’ATP. Au cours de l’inhibition de l’OxPHOS médiée par l’oligomycine, les cellules régulent au maximum la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cela provoque une augmentation supplémentaire de l’ECAR, révélant la capacité glycolytique maximale des cellules. La différence entre la capacité glycolytique maximale et la glycolyse basale est appelée réserve glycolytique. Enfin, le 2-DG est injecté, ce qui provoque une baisse significative de l’ECAR, généralement proche des niveaux d’acidification non glycolytique. Le 2-DG est un analogue du glucose qui se lie de manière compétitive à l’hexokinase, ce qui entraîne une inhibition de la glycolyse18. Ainsi, la diminution de l’ECAR induite par le 2-DG confirme en outre que la glycolyse est bien la source d’ECAR observée après des injections de glucose et d’oligomycine.
La figure 1B montre le schéma d’un test de stress mitochondrial typique. Le test commence par la mesure OCR de base des cellules, incubées dans un milieu de test de stress mitochondrial contenant du glucose, de la glutamine et du pyruvate. Après des mesures OCR basales, l’oligomycine est injectée dans ce test, qui inhibe le complexe V, réduisant ainsi le flux d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons (ETC)17. Par conséquent, l’OCR est réduite en réponse à l’injection d’oligomycine, et cette diminution de l’OCR est liée à la production mitochondriale d’ATP. La deuxième injection consiste en cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un protonophore et un découpleur d’OxPHOS17 mitochondrial. FccP effondre le gradient de protons mitochondriaux en permettant le flux de protons à travers la membrane interne mitochondriale. En raison de l’injection de FCCP, le flux d’électrons à travers l’ETC est déprimé et le complexe IV consomme de l’oxygène au niveau maximal. La différence entre l’OCR maximal et l’OCR basale est appelée capacité respiratoire de rechange, qui est une mesure de la capacité de la cellule à répondre à une demande d’énergie accrue dans des conditions de stress. Enfin, un mélange de deux inhibiteurs de l’ETC (roténone, un inhibiteur du complexe I, et antimycine A, un inhibiteur du complexe III17) est injecté, ce qui arrête complètement le flux d’électrons et l’OCR diminue à un faible niveau. L’OCR mesurée après injection de roténone et d’antimycine A correspond à l’OCR non mitochondriale entraînée par d’autres processus à l’intérieur des cellules. L’OCR non mitochondriale permet de calculer la respiration basale, la fuite de protons et la respiration maximale.
La respiration basale représente la différence entre l’OCR de base et l’OCR non mitochondriale. La fuite de protons fait référence à la différence entre l’OCR après injection d’oligomycine et l’OCR non mitochondriale. La respiration maximale représente la différence entre l’OCR après injection de FCCP et l’OCR non mitochondriale. L’efficacité du couplage est calculée comme le pourcentage du taux de production d’ATP au taux de respiration basale. Ce document de méthode fournit un protocole détaillé pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les HSPC à l’ordre négatif à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96. Ce protocole décrit les approches pour isoler les HSPC négatifs à la lignée de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de divers médicaments utilisés dans les tests de flux extracellulaire et décrit les stratégies de traitement médicamenteux.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu ; Filtre m</td><td>Corning</td><td>430626</td><td>Utilisé pour filtrer-stériliser le milieu d’essai</td></tr><tr><td>100 mM pyruvate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Composant du milieu d’essai d’essai d’effort mitochondrial</td></tr><tr><td>15 mL Tubes Falcon coniques</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>Utilisé lors de la récolte des HSPC et pour préparer des solutions médicamenteuses d’essai</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Composant du support de test d’effort de glycolyse et de test d’effort mitochondrial</td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>3e injection de médicament pendant le test d’effort de glycolyse</td></tr><tr><td>5x Tampon d’enrichissement (MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480017</td><td>Utilisé pour les lavages pendant la récolte des HSPC</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-3</td><td>Composant de la lyse ACK tampon</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>3e injection de médicament pendant le test de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>Bio-Rad Kit de dosage des protéines DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td>Utilisé selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>2e injection de médicament pendant le test de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Adhésif pour cellules. Utilisé pour l’enrobage de microplaques</td></tr><tr><td>cellulaires Comte 3 Compteur de cellules automatisé</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td>Composant du tampon de lyse ACK et du tampon de lyse RIPA</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu ; m filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Utilisé comme passoire cellulaire pendant la récolte des HSPC</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal Gibco (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>26400044</td><td>Utilisé pour préparer le tampon de dosage pendant la récolte des HSPC</td></tr><tr><td>Gibco HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175095</td><td>Utilisé pour préparer le tampon de test pendant la récolte des HSPC</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Composant du milieu d’essai de stress mitochondrial et première injection du test d’effort de glycolyse</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>2e injection de médicament pendant le test d’effort de glycolyse et 1ère injection de médicament pendant le test d’effort mitochondrial</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Utilisé pour laver les cellules après le test de quantification des protéines</td></tr><tr><td>Bicarbonate de potassium (KHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P235-500</td><td>Composant du tampon de lyse ACK Cocktail d’inhibiteurs de</td></tr><tr><td>protéase (PIC)</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Fourni sous forme de comprimés. Un comprimé a été dissous dans 10 mL de tampon RIPA pour obtenir 1x PIC.</td></tr><tr><td>Anti-souris biotine de rat-B220, ID de clone : RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103203</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée pendant la récolte de HSPCs</td></tr><tr><td>Anti-souris de biotine de rat-CD2, ID de clone : RM2-5</td><td>Biolegend</td><td>100103</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée pendant la récolte de HSPC</td></tr><tr><td>Biotine de rat anti-souris-CD3, ID de clone : 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100243</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée pendant la récolte de HSPCs</td></tr><tr><td>Anti-biotine de rat-CD5, Clone ID : 53-7.3</td><td>Biolegend</td><td>100603</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée lors de la récolte des HSPC</td></tr> Mine <tr><td>de biotine anti-souris de rat-CD8, ID de clone : 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée lors de la récolte de HSPC</td></tr><tr><td>Antisouris de rat-Gr-1, ID de clone : RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108403</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée lors de la récolte</td></tr> de <tr><td>biotine de rat antisouris-Ter-119, ID de clone : TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116203</td><td>Utilisé pour l’appauvrissement de la lignée lors de la récolte des HSPC</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>3e injection de médicament pendant le test de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96</td><td>Seahorse Biosciences maintenant Agilent</td><td></td><td>Pour les mesures ECAR et OCR en temps réel.</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Utilisé pour fabriquer une solution adhésive cellulaire pour le revêtement de microplaques</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Composant du tampon de lyse RIPA</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Composant du tampon de lyse RIPA</td></tr><tr><td>Fluorure de sodium (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td>Composant du tampon de lyse RIPA</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Solution préparée à 1 N. Utilisé pour la normalisation du pH</td></tr><tr><td>Nanobilles de streptavidine (MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480015</td><td>Utilisé pour l’épuisement de la lignée pendant la récolte des HSPC</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153</td><td>Composant du tampon de lyse</td></tr><tr><td>RIPA Milieu de base XF</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Milieu de base utilisé pour préparer le test de stress de glycolyse et le milieu de test de stress mitochondrial Station de</td></tr><tr><td>préparation XF</td><td>Seahorse Biosciences</td><td></td><td>Utilisé pour les non2 37 &deg ; C incubations</td></tr><tr><td>XFe96 extracellulaire FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100 ou 102601-100</td><td>Comprend des cartouches de dosage avec plaques utilitaires, des plats de guidage de chargement pour le chargement des médicaments sur la cartouche de dosage, une solution de calibrant XF et une microplaque de culture cellulaire XF</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

À l’état d’équilibre, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) restent en grande partie au repos et on pense qu’elles dépendent principalement de la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cependant, dans des conditions de stress telles qu’une infection ou une perte de sang, les CSH deviennent prolifératifs et produisent rapidement des cellules progénitrices en aval, qui à leur tour se différencient davantage, produisant finalement des cellules sanguines matures. Au cours de ce processus de transition et de différenciation, les CSH sortent de la quiescence et subissent rapidement un passage métabolique de la glycolyse à la phosphorylation oxydative (OxPHOS). Diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité, peuvent avoir un impact négatif sur la fonction mitochondriale et peuvent donc modifier la reprogrammation métabolique et la différenciation des CSH et des progéniteurs pendant l’hématopoïèse. Des informations précieuses sur les fonctions glycolytiques et mitochondriales des CSH et des progéniteurs dans des conditions normales et de stress peuvent être obtenues grâce à l’évaluation de leur taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et de leur taux de consommation d’oxygène (OCR), qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement. 
Ici, un protocole détaillé est fourni pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les populations de cellules de lignée négative dérivées de la moelle osseuse de souris, qui comprennent à la fois des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices primitives (HSPC), à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole décrit des approches pour isoler les cellules de lignée négative de la moelle osseuse de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de 2-désoxy-D-glucose (2-DG, un analogue du glucose qui inhibe la glycolyse) et de divers médicaments ciblant OxPHOS (oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A) utilisés dans ces tests, et décrit les stratégies de traitement médicamenteux. Les paramètres clés du flux glycolytique, tels que la glycolyse, la capacité glycolytique et la réserve glycolytique, et les paramètres OxPHOS, tels que la respiration basale, la respiration maximale, la fuite de protons, la production d’ATP, la capacité respiratoire de rechange et l’efficacité du couplage, peuvent être mesurés dans ces essais. Ce protocole permet des mesures ECAR et OCR sur des HSPC non adhérents et peut être généralisé pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules de suspension.

En utilisant ce protocole, le nombre de cellules et les concentrations de divers médicaments ciblant OxPHOS (utilisés dans les tests de flux extracellulaire) ont été optimisés pour mesurer l’ECAR et l’OCR des HSPC isolés chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 24 semaines. Tout d’abord, le test de stress de glycolyse a été effectué pour optimiser le nombre de cellules et la concentration d’oligomycine. Un nombre variable de HSPC par puits allant de 5 × 104 à 2,5 × 105 ont été utilisés dans ce test...

La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Au cours de l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques subissent un passage métabolique de la glycolyse à la phosphorylation oxydative. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions glycolytiques et mitochondriales des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de souris. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel.La plate-forme à base de microplaques de 96 puits offre une quantification à haut débit avec une sensibilité élevée, permettant l’analyse simultanée de plusieurs échantillons à l’aide d’une seule plaque. Cette technique peut être utilisée pour sonder les effets de produits chimiques ou de manipulations génétiques sur le métabolisme des CSH dans des conditions variées. Il peut aider à élucider les voies métaboliques qui soutiennent la pluripotence HSC.Bien que la présente étude soit principalement axée sur les souches hématopoïétiques de souris et les cellules progénitrices, le protocole et cette approche pourraient facilement être adaptés pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules en suspension. Un jour avant le test, ouvrez le kit de dosage de flux extracellulaire pour retirer la cartouche de capteur et l’ensemble de plaques utilitaires. Enregistrez les plats du guide de chargement pour les utiliser le lendemain.Maintenant, séparez manuellement la cartouche de capteur de la plaque utilitaire et placez-la à l’envers à côté de la plaque utilitaire. À l’aide d’une pipette multicanal, remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microlitres d’étriquant inclus avec le kit de dosage de flux, puis replacez la cartouche de capteur sur la plaque utilitaire, en veillant à immerger complètement les capteurs dans l’étrier. Ensuite, incubez la plaque utilitaire avec de l’étrier et une cartouche de capteur assemblée dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit après les conditions d’humidification mentionnées dans le manuscrit.Le jour de l’essai, préparez 2,5 millilitres de la solution adhésive cellulaire par microplaque de culture cellulaire de 96 puits, comme décrit dans le manuscrit textuel. Ouvrez la microplaque de culture cellulaire à 96 puits incluse avec le kit de dosage de flux et distribuez 25 microlitres de la solution adhésive cellulaire préparée au fond de chaque puits. Couvrir la microplaque avec le couvercle et incuber pendant 30 minutes à température ambiante à l’intérieur de la hotte.Après l’incubation, retirez et jetez l’excès de solution adhésive cellulaire à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur multicanal et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres d’eau ultrapure stérile. Sécher à l’air libre la plaque sans le couvercle à l’intérieur de la hotte pendant 30 à 45 minutes. Centrifugez les HSPC négatifs de la lignée de souris préparée à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans le milieu d’essai approprié et centrifuger à nouveau la suspension cellulaire. Répétez cette procédure une fois de plus et remettez en suspension les cellules dans le milieu d’essai réchauffé approprié à la concentration de 250 000 cellules par 50 microlitres ou cinq millions de cellules par millilitre. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de la suspension cellulaire le long du côté de chaque puits de la microplaque de culture cellulaire de 96 puits revêtue d’adhésif cellulaire, puis ajoutez 50 microlitres du milieu d’essai dans les puits de mesure de fond d’angle.Créez une plaque d’équilibre de centrifugeuse en ajoutant 50 microlitres d’eau par puits d’une microplaque de culture cellulaire non revêtue de 96 puits. Centrifugez les cellules à 200 fois G pendant une minute à température ambiante. Incuber la plaque dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 25 à 30 minutes pour la fixation cellulaire.Après 30 minutes, confirmez visuellement au microscope que les cellules adhèrent de manière stable à la surface de la microplaque. Commencez par préparer toutes les solutions requises dans le milieu de test de stress de glycolyse préchauffé comme mentionné dans le manuscrit du texte et retirez la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur. Retirez la cartouche du capteur de l’étrier et remplacez-la sur la même plaque utilitaire par l’étrier pour éliminer les bulles d’air.Placez le guide de chargement 80 à plat sur le dessus de la cartouche du capteur en l’orientant de manière à ce que la lettre A soit située dans le coin supérieur gauche. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer 20 microlitres de solution de glucose de 100 millimolaires dans le port A.Remplacez le guide de chargement 80 à plat par le guide de chargement BC à plat, en orientant la lettre B dans le coin supérieur gauche. Distribuer 22 microlitres de 20 micromolaires solution d’oligomycine dans le port B.Réorienter le guide de chargement BC à plat pour localiser la lettre C dans le coin supérieur gauche du port de chargement C et distribuer 25 microlitres de solution de 2-désoxy-d-glucose de 500 millimolaires dans le port C.Ensuite, retirez et jetez les plats du guide de chargement.Maintenant, créez ou chargez le modèle pour le test de stress de glycolyse sur le contrôleur. Entrez les détails concernant les stratégies d’injection, les conditions de traitement et les types de cellules, puis appuyez sur Générer des groupes. Allez sur la carte des plaques et attribuez des puits à chaque groupe à analyser.Dans le protocole, assurez-vous que l’étalonnage et l’équilibrage sont vérifiés à l’étape d’initialisation. Pour la mesure de base et les mesures après chaque injection, réglez le nombre de cycles de mesure sur trois et mélangez, attendez, mesurez les temps à trois minutes, zéro minute, trois minutes. Cliquez sur Démarrer l’exécution sur le logiciel.Retirez le couvercle de la cartouche de capteur chargée et hydratée et placez-le sur le plateau de travail de l’analyseur de flux extracellulaire. Commencez l’exécution de l’étalonnage. Retirez la microplaque contenant les cellules ensemencées de l’incubateur.Sans perturber les cellules, ajoutez lentement 130 microlitres du milieu de test de stress de glycolyse préchauffé par puits pour augmenter le volume moyen dans chaque puits à 180 microlitres et retournez la plaque à l’incubateur pendant 15 à 20 minutes supplémentaires. Cliquez sur Ouvrir le plateau sur le logiciel pour ouvrir le plateau thermique de Seahorse. Une fois l’étalonnage terminé, remplacez la plaque utilitaire par cette microplaque de dosage contenant les cellules et appuyez sur la plaque de cellule de charge pour démarrer les mesures.Une fois les mesures terminées, retirez le milieu d’essai de la plaque sans perturber les cellules et lavez-les doucement avec 250 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate sans déloger les cellules. Maintenant, ajoutez 10 microlitres de tampon de lyse de radioimmunoprécipitation complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 1X à chaque puits et agitez la plaque sur un shaker pendant 10 minutes. Congeler toute la plaque à moins 80 degrés Celsius.Décongelez la plaque et effectuez un test de mesure des protéines pour la normalisation des données en suivant les instructions du fabricant. Récupérez et analysez les données en ouvrant le fichier de données à l’aide du logiciel de bureau Wave. Cliquez sur Normaliser, collez les valeurs de normalisation pour chaque puits, puis cliquez sur Appliquer pour normaliser les données.Cliquez sur Exporter et sélectionnez générateur de rapports de test de stress de glycolyse pour exporter les données analysées vers un générateur de rapports. Le taux d’acidification non glycolytique augmente avec l’augmentation du nombre de cellules de 50 000 à 250 000, mais n’augmente que très peu entre 200 000 et 250 000. L’injection de glucose de 10 millimolaires stimule la glycolyse à tous les nombres de cellules avec une augmentation maximale de l’ECAR observée à 250 000 cellules par puits.Cependant, l’injection de deux micromolaires d’oligomycine n’augmente pas davantage l’ECAR. Les données OCR obtenues dans le même ensemble de tests de stress de glycolyse montrent une baisse significative après l’injection d’oligomycine en raison de l’inhibition du complexe 5. Les paramètres du test d’effort de glycolyse ont été calculés et 250 000 cellules par puits dans deux micromolaires d’oligomycine ont été sélectionnées pour d’autres études.Le test de stress mitochondrial a montré que deux injections micromolaires d’oligomycine provoquent une réduction significative de l’OCR via l’inhibition du complexe 5. Le FCCP stimule l’OCR dans les HSPC de manière dose-dépendante avec une augmentation maximale observée à deux micromolaires. Un mélange de 0,5 roténone micromolaire et de 0,5 injection d’antimycine A micromolaire diminue l’OCR à son niveau minimal correspondant à la consommation d’oxygène non mitochondrial.Les paramètres du test de stress mitochondrial ont été calculés et deux micromolaires de FCCP ont été sélectionnés pour d’autres études. Compte tenu de la nature à haut débit de cette technique, le protocole décrit ici pourrait facilement être adapté pour dépister un grand nombre de modulateurs bioénergétiques dans les cellules souches hématopoïétiques, les progéniteurs hématopoïétiques et les cellules hématopoïétiques malignes. L’analyse des hippocampes est largement utilisée dans la littérature pour mesurer le métabolisme dans une grande variété de contextes en présence de divers substrats et inhibiteurs.

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Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal

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