Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote

Les protocoles sont importants, car ils évitent l’utilisation d’isotopes radioactifs et éliminent une barrière qui peut empêcher de nombreux travailleurs d’étudier les enzymes du métabolisme du glycogène. Les procédures décrites sont peu coûteuses et ne nécessitent que l’accès à un simple spectrophotomètre. Pour commencer par la détermination de l’activité de la glycogène synthase, décongelez les solutions mères préalablement préparées de glucose UDP, d’ATP, de phosphoénolpyruvate et de kinase NDP sur de la glace.

Préchauffez un bain-marie à 30 degrés Celsius. Lorsque les solutions mères sont prêtes, préparer suffisamment de mélange de dosage en fonction du nombre de dosages de glycogène synthase en ajoutant les réactifs dans un tube de 15 millilitres, comme décrit dans le protocole texte. Préparer une réaction à blanc en remplaçant le NADH du mélange réactionnel par de l’eau, et transférer la réaction dans une cuvette de méthacrylate jetable.

Utilisez la réaction à blanc pour mettre zéro sur le spectrophotomètre à la longueur d’onde de 340 nanomètres. Prenez une aliquote de 770 microlitres du mélange réactionnel dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez séquentiellement deux microlitres chacun de la kinase NDP et du mélange de lactate déshydrogénase pyruvate kinase dans le tube. Après mélange, incuber doucement le tube à 30 degrés Celsius au bain-marie pendant trois minutes pour préchauffer le mélange réactionnel.

Ajouter ensuite 30 microlitres de l’échantillon contenant la glycogène synthase dans un tampon Tris 20 millimolaires à pH 7,8, et mélanger doucement avant de transférer le mélange réactionnel dans une cuvette de méthacrylate d’élimination. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez l’absorbance à 340 nanomètres à intervalles chronométrés pendant 10 à 20 minutes. Ensuite, tracez les absorbances obtenues en fonction du temps.

Pour mesurer le glucose libéré, transférer 40 microlitres du surnageant des échantillons de glycogène chauffés vers les cuvettes de méthacrylate jetables. Et ajoutez les volumes mesurés de triéthanolamine, de tampon de sulfate de chlorhydrate de magnésium, de mélange ATP NADP et d’eau comme décrit dans le manuscrit. Mélanger le mélange en pipetant doucement de haut en bas sans créer de bulles d’air.

Ajouter 0,5 microlitre de glucose-6-phosphate déshydrogénase à chaque cuvette. Après mélange par pipetage, incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes, puis enregistrer l’absorbance à 340 nanomètres. Ensuite, mélangez 0,5 microlitre d’hexokinase à chaque cuvette comme décrit précédemment, et incuber pendant 15 minutes avant d’enregistrer l’ensemble absorbant de 340 nanomètres.

Continuez ensuite l’incubation à température ambiante pendant cinq minutes, puis enregistrez l’absorbance. Si l’absorption a augmenté par rapport à celle enregistrée à 15 minutes, poursuivre l’incubation pendant cinq minutes avant d’enregistrer l’absorption finale à 340 nanomètres. Pour déterminer la ramification du glycogène, combinez 650 microlitres de stock de réactif de couleur chlorure de calcium iodé avec 100 microlitres d’eau dans un tube de 1,5 millilitre et mélangez soigneusement la solution avant de la transférer dans une cuvette de méthacrylate jetable.

Placez la cuvette dans le spectrophotomètre pour effectuer un passage en mode de balayage de longueur d’onde pour collecter le spectre de fond de 330 à 800 nanomètres. Dans un tube séparé de 1,5 millilitre, mélanger 650 microlitres du réactif de couleur au chlorure de calcium iodé avec 50 microgrammes de glycogène de l’huître et compléter le volume final à 750 microlitres avec de l’eau. Après avoir bien mélangé le mélange, transférer la solution dans une cuvette de méthacrylate jetable pour recueillir un spectre d’absorption de 330 à 800 nanomètres.

De même, obtenir un spectre d’absorption avec 50 microgrammes d’amylopectine et 30 microgrammes d’amylose comme décrit précédemment. Pour obtenir une indication de la structure ramifiée d’un échantillon de glycogène non caractérisé, combiner 25 à 50 microgrammes du glycogène avec 650 microlitres du réactif de couleur chlorure de calcium iodé fonctionnel, et procéder comme expliqué précédemment pour acquérir le spectre d’absorption. Dans les essais de glycogène synthase, une diminution linéaire de l’absorption à 340 nanomètres au fil du temps a été observée.

L’ajout d’une trop grande quantité de glycogène synthase au test a permis à la réaction d’atteindre son achèvement dans les deux premières minutes. La réaction de contrôle, qui ne contenait pas de glycogène synthase, ne montre aucune diminution mesurable de l’absorbance. Les données d’un test de glycogène phosphorylase utilisant une enzyme purifiée avaient une phase linéaire d’une durée de trois minutes.

Un taux d’augmentation de l’absorbance d’environ 0,01 à 0,04 unité par minute est optimal. Dans le test de l’enzyme de déramification du glycogène, la réaction a montré une phase linéaire persistant pendant au moins 10 minutes. Les données représentatives des essais d’enzymes ramifiées du glycogène ont montré la différence d’absorbance entre les échantillons témoins dépourvus d’enzymes ramifiées et les réactions contenant une enzyme ramifiée.

La plage dynamique étroite du test est illustrée. La variation maximale de l’absorbance qui peut être produite est de 0,4 unité d’absorbance, et la linéarité est perdue lorsque la variation de l’absorption est d’environ 0,2 unité d’absorbance. Les masses de glycogène, d’amylopectine et d’amylose utilisées dans l’évaluation de la ramification du glycogène ont affiché une lecture d’absorbance maximale d’environ 0,7 à 0,8, chacune à des maxima d’absorbance différents.

L’échantillon de glycogène a produit deux pics à environ 400 nanomètres et 460 nanomètres. Le réactif de couleur chlorure de calcium iodé est très dense. Il est important de s’assurer que les échantillons de glycogène sont complètement mélangés avec le réactif avant de prélever un spectre d’absorption.