Interfaces d’hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries

Ce protocole est conçu pour isoler rapidement les cellules des interfaces de criblage pour la caractérisation génomique et cette capacité est importante car il peut combiner des caractéristiques cellulaires macroscopiquement observables avec des informations génomiques. Les cellules bactériennes ciblées à partir des interfaces de criblage peuvent être isolées avec une position spatiale élevée d’une manière simple sur le plan opérationnel en utilisant cette technique. Les hydrogels peuvent être implémentés dans d’autres interfaces de criblage.

Le matériau de l’hydrogel peut être facilement incorporé dans des canaux microfluidiques pour la récupération à la demande de cellules à partir de dispositifs microfluidiques. Commencez par inoculer le tampon de réticulation avec la densité cellulaire souhaitée. Préparer la solution de précurseur d’hydrogel dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre en ajoutant 12,5 microlitres du tampon de réticulation et 5,6 microlitres de solution de diacrylate de PEG ONB.

Et enfin, ajoutez 6,9 microlitres de solution de thiol PEG pour l’avant-bras au mélange. Pour l’encapsulation cellulaire dans la solution de précurseur d’hydrogel, placez les couvercles de base thiolés sur une boîte de Petri propre et placez deux entretoises sur les deux côtés opposés du couvercle. Fixez les entretoises sur le couvercle de base en collant les entretoises sur la boîte de Pétri.

Après avoir ajouté le volume souhaité de la solution précurseur sur une lame de verre perfluoroalkylé non réactive, placez la lame sur le couvercle de base et laissez la formation d’hydrogel se terminer à température ambiante pendant 25 minutes. Une fois la gélification terminée, retirez délicatement la lame de verre perfluoroalkylé. Placez le substrat dans la boîte de Petri de 60 x 15 millimètres contenant des milieux ATGN complétés par un antibiotique.

Ensemencez 700 microlitres de suspensions de cellules bactériennes avec une OD 600 de 0,1 sur le substrat du réseau de micropuits et fabriquez la solution précurseur d’hydrogel comme démontré précédemment en utilisant 12,5 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate ATGN de pH huit. Pipette 12,5 microlitres de la solution précurseur sur une lame de verre perfluoroalkylé non réactif et placer deux entretoises en acier de 38 micromètres sur deux côtés opposés du substrat du réseau de micropuits innoculé avec des cellules. Ensuite, inverser la lame de verre perfluoroalkylé avec la gouttelette de solution précurseur et placer une gouttelette au milieu du substrat du micropuit.

Lorsque l’hydrogel est formé après une incubation de 25 minutes à température ambiante, retirez doucement la lame de verre du substrat du micropuit et placez le substrat dans une boîte de Petri contenant un milieu ATGN complété par un antibiotique. Placez l’échantillon dans un support PDMS et ajoutez le support défini sur le dessus de l’échantillon pour éviter la déshydratation de l’échantillon et fournir une solution porteuse pour les cellules libérées. Après avoir mis le miroir d’étalonnage en position, ajustez la mise au point du microscope pour obtenir une image nette des colonies dans le réseau d’hydrogel ou de micropuits et inspectez pour identifier les colonies ou les puits d’intérêt.

Ici, concevez les motifs lumineux tandis que la vue de la caméra montre les colonies à l’intérieur de l’échantillon pour tester différents modèles pour l’extraction de cellules et enregistrer le motif défini. Sélectionnez ensuite la section de contrôle de session, ajoutez la séquence enregistrée sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs. Choisissez l’option permettant de stimuler le motif pour afficher et ajuster l’emplacement d’exposition souhaité.

Ensuite, ajustez l’intensité lumineuse à 60% et le temps d’exposition à 40 secondes sous l’onglet de contrôle LED et démarrez le processus d’exposition. Surveillez la dégradation de l’hydrogel en temps réel et en mode Brightfield pour assurer la libération de la cellule. Pour collecter la cellule libérée, changez le filtre du microscope de Brightfield à TRITC pour visualiser la zone exposée de l’échantillon à l’œil nu.

Une fois la zone exposée localisée, placez l’extrémité du tube sur l’endroit irradié, puis remplacez le filtre du microscope par Brightfield pour surveiller la récupération des cellules en temps réel. Utilisez la seringue fixée à l’autre extrémité du tube pour prélever soigneusement 200 microlitres de solution contenant les cellules libérées et transférer la solution dans un tube centrifuge de 1,5 millimètre pour l’analyse ou le placage de l’ADN. Différents micro-motifs de lumière UV ont été utilisés pour l’extraction cellulaire à partir d’hydrogels en vrac, ce qui a influencé la morphologie des cellules libérées.

L’exposition aux UV dans un anneau a entraîné la libération de toute la colonie encapsulée dans un hydrogel PEG protecteur. En revanche, en exposant une partie ou la totalité de la colonie à la lumière UV, les cellules pourraient être extraites soit sous forme de grappes de cellules agrégées, soit sous forme de cellules individuelles libres. La densité d’ensemencement cellulaire et l’épaisseur de l’hydrogel sont importantes pour l’encapsulation cellulaire.

Les hydrogels plus minces ont donné lieu à des micro-colonies avec un chevauchement minimal des colonies, tandis que les hydrogels avec une épaisseur accrue ont entraîné le chevauchement des colonies, ce qui pourrait entraîner l’extraction de plusieurs colonies. Les colonies qui se chevauchent peuvent provoquer une contamination croisée pendant l’extraction en raison de la nature bidimensionnelle du motif lumineux. Lorsqu’une colonie supérieure était ciblée, la colonie sous-jacente était également extraite avec elle.

L’effet de divers micromoyages de lumière UV sur la viabilité cellulaire a également été évalué. Lorsque les micro-colonies ont été exposées à des doses contrôlées de lumière UV dans un motif circulaire ou croisé, la récupération cellulaire et la pureté de l’ADN n’ont pas été affectées. Les cellules ont été récupérées avec succès à partir de réseaux de micropuits en utilisant cette approche, ce qui était évident à partir des images de microscopie confocale représentatives, où lors de l’irradiation dans le motif circulaire et en anneau, les cellules ont été retirées dans le motif respectif.

Après extraction à partir de réseaux de micropuits, la viabilité cellulaire et la quantité d’ADN ont été évaluées. Les profils d’exposition n’affectaient ni le nombre de cellules viables ni la qualité de l’ADN, ce qui indique que les cellules bactériennes viables pouvaient être récupérées sélectivement dans des micropuits avec un minimum de dommages, et que leur ADN pouvait être isolé à haute pureté pour une analyse génomique en aval. Vérifiez toujours que l’hydrogel s’est formé avant de retirer le couvercle perfluoroalkylé.

La précision et le soin sont nécessaires pour placer les entretoises pour le dépôt d’hydrogel et utiliser les tubes pour l’extraction des cellules.