Name: Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Apprenez l'imagerie calcique in vivo avec miniscope pour étudier la dynamique neuronale chez des souris en comportement libre. Cette méthode chirurgicale permet l'enregistrement à grande échelle et longitudinal de l'activité cérébrale profonde.

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Ce travail est soutenu par des subventions du National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 et UG3NS115608.

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<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
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<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
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<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
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</ol>

Les auteurs ne font état d’aucun intérêt financier concurrent.

Une question centrale en neurosciences est de comprendre comment la dynamique et les circuits neuronaux codent et stockent l’information, et comment ils sont modifiés dans les maladies du cerveau. À l’aide d’un miniscope in vivo Ca2+ système d’imagerie, l’activité neuronale individuelle de plusieurs centaines de neurones dans un microcircuit local peut être surveillée simultanément à partir d’un animal se comportant librement. Ici, un protocole chirurgical détaillé pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est décrit pour préparer les rongeurs à une imagerie cérébrale profonde in vivo Ca2+ via un système d’enregistrement miniscope développé sur mesure. Le tableau 1 montre les comparaisons de notre système de miniscope avec d’autres systèmes de miniscope disponibles dans le commerce et construits sur mesure 7,8,9,10,11,13,25,26. Il convient de noter que l’implantation de lentilles GRIN à l’aide du protocole chirurgical actuel est compatible avec tous les systèmes d’imagerie commerciaux ou sur mesure à photon unique et à deux photons pour une imagerie calcique in vivo du cerveau profond.
De l’injection virale à l’acquisition de données de l’imagerie calcique in vivo miniscope , l’ensemble de la procédure expérimentale prend au moins 2 mois. C’est un processus compliqué et laborieux. Le succès final de l’expérience dépend de multiples facteurs, y compris le choix approprié des GECI, l’injection de virus avec précision dans la zone cérébrale ciblée, une expression virale suffisante dans la population neuronale souhaitée, l’implantation de lentille GRIN précisément à l’endroit souhaité, une récupération adéquate des chirurgies, ainsi que, si une inflammation grave se produit après la chirurgie, et si le comportement de l’animal est gravement affecté par les chirurgies, et ainsi de suite.
Deux étapes critiques comprennent l’injection stéréotaxique du virus et l’implantation de lentilles GRIN. À des fins de démonstration, la microinjection stéréotaxique a été réalisée dans le mPFC de souris, avec le virus adéno-associé (AAV1) codant GCaMP6f sous le contrôle du promoteur CaMKII qui marque sélectivement les neurones pyramidaux dans le mPFC. GCaMP6f a été choisi car c’est l’un des indicateurs de calcium les plus rapides et les plus sensibles avec un temps de demi-désintégration de 71 ms15. De plus, l’expression virale AAV de GCaMP6f est durable (c.-à-d. plusieurs mois), ce qui la rend idéale pour effectuer une imagerie répétitive in vivo Ca2+ sur une longue période pour des études longitudinales sur des modèles murins de maladies neurodégénératives27. Le protocole chirurgical actuel peut être adapté pour cibler différentes populations cellulaires dans toute autre région du cerveau. Divers outils viraux disponibles permettent le marquage sélectif de populations neuronales spécifiques dans la région cérébrale souhaitée à l’âge souhaité. En outre, les chercheurs peuvent tirer parti du système de recombinaison Cre-LoxP et de divers modèles murins transgéniques disponibles pour effectuer des modifications génétiques et étudier le résultat des circuits comportementaux et neuronaux28,29.
Une caractéristique unique du protocole présenté est que l’aspiration automatisée du tissu cérébral couche par couche a été réalisée avant l’implantation de la lentille GRIN (1 mm de diamètre). Ceci est réalisé grâce à une aiguille de 27 G connectée à un système de vide, contrôlé par un bras robotique sur mesure et un logiciel23. Sur la base de notre expérience, cette méthode génère une surface uniforme pour le contact de la lentille GRIN et cause moins de dommages au tissu voisin que l’aspiration manuelledu tissu 23. Pour cette raison, cette procédure apporte un avantage évident pour les lentilles GRIN avec un diamètre relativement plus large (par exemple, 1 mm). Cependant, l’aspiration tissulaire peut ne pas être nécessaire pour implanter une lentille GRIN de plus petit diamètre (0,5 mm ou 0,25 mm). Au lieu de cela, il peut être directement planté le long de la piste de tête faite avec une aiguille de 30 G21.
Outre les deux étapes critiques discutées ci-dessus, de nombreux autres facteurs doivent être soigneusement pris en compte pour une opération réussie. (1) Tous les instruments qui entrent en contact avec le cerveau doivent être stérilisés pour prévenir l’infection. (2) Toutes les étapes de la chirurgie doivent être effectuées pour minimiser les dommages au cerveau afin de prévenir une inflammation supplémentaire et la formation excessive de tissu cicatriciel. (3) Les doses d’anesthésie administrées initialement et maintenues pendant la chirurgie, en particulier celles administrées par voie intrapéritonéale, doivent être soigneusement examinées. Les doses d’anesthésie peuvent être modifiées en fonction de différentes souches de souris, car certaines peuvent être plus sensibles. (4) L’état de la souris doit être surveillé en permanence pendant la chirurgie. Enfin, (5) les souris doivent être surveillées régulièrement après la chirurgie, car de nombreuses complications peuvent survenir après la chirurgie.
Bien qu’un morceau de tissu cérébral soit prélevé unilatéralement lors de l’étape d’implantation de la lentille GRIN, nous n’avons observé aucun déficit comportemental évident 7,12. Le poids du miniscope est d’environ 2 grammes et le câble est conçu sur mesure pour le rendre léger et pour s’assurer que la souris peut facilement le transporter. Le miniscope et le câble ne sont fixés à l’animal qu’avant l’imagerie in vivo et détachés après l’imagerie. L’ensemble du processus d’imagerie ne prend généralement pas plus de 30 minutes. Par conséquent, ces instruments n’empêchent pas la souris de se comporter librement. Les étapes d’installation et de désinstallation du miniscope nécessitent une brève anesthésie (moins de 2 minutes) avec de l’isoflurane à des fins de contention animale. Nous laissons généralement la souris récupérer de la brève exposition à l’isoflurane pendant 30 minutes avant d’effectuer une imagerie in vivo. Nous avons effectué une imagerie calcique in vivo miniscope une fois par semaine pendant quelques semaines sans remarquer d’impact sur la santé et le comportement social de la souris12.
L’une des principales limites du système d’enregistrement miniscope actuel est la nécessité de connecter le microscope à un câble pour l’acquisition de données. La présence du câble limite parfois les performances de la tâche de la souris et limite l’enregistrement d’un animal à la fois. Récemment, un miniscope sans fil a été développé25,26. Cela élargira la performance des tâches et permettra l’imagerie in vivo simultanée de plusieurs animaux d’un groupe. De plus, le développement d’IESC plus sensibles avec des longueurs d’onde séparables spectralement combinées à un miniscope bicolore offrira des possibilités plus intéressantes pour la recherche en neurosciences.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

La signalisation intracellulaire Ca2+ est un régulateur essentiel de la croissance cellulaire, de la prolifération, de la différenciation, de la migration, de la transcription des gènes, de la sécrétion et de l’apoptose1. Dans les neurones, la signalisation Ca2+ est contrôlée avec précision puisque son schéma spatio-temporal est lié à des fonctions cruciales telles que l’excitabilité membranaire, la libération de neurotransmetteurs et la plasticité synaptique2.
L’imagerie calcique in vivo est une technique puissante qui peut être utilisée pour décoder la représentation des circuits neuronaux élémentaires aux comportements animaux normaux, identifier les activités neuronales aberrantes dans les modèles animaux de troubles cérébraux et démêler les cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent normaliser ces circuits altérés. Les deux systèmes d’imagerie calcique in vivo courants sont la microscopie à fluorescence à balayage laser à deux photons 3,4,5,6 et la microendoscopie miniaturisée (miniscope) montée sur la tête 7,8,9,10,11,12,13 . La microscopie conventionnelle à deux photons offre des avantages importants tels qu’une meilleure résolution, un bruit réduit et un photoblanchiment plus faible; cependant, les animaux d’expérimentation doivent être fixés à la tête, ce qui limite les études de comportement pouvant être effectuéesà 3,4,5,6. En revanche, le système de miniscope monté sur la tête est petit et portable, ce qui permet d’étudier une grande variété de tests de comportement utilisant des animaux se comportant librement 7,8,9,10,11,12,13.
Il existe deux indicateurs avancés de Ca2+, les indicateurs chimiques 5,14 et les indicateurs de calcium codés génétiquement (GECI)15,16. L’imagerie Ca2+ a été facilitée par l’utilisation de GECI très sensibles délivrés avec des vecteurs viraux qui permettent un marquage spécifique des neurones dans le circuit ciblé. L’effort continu pour améliorer la sensibilité, la longévité et la capacité à marquer même les compartiments subcellulaires rend les GECI idéaux pour diverses études d’imagerie calcique in vivo 17,18,19.
La diffusion de la lumière dans les tissus cérébraux pendant l’imagerie limite la pénétration optique en profondeur, même avec la microscopie à deux photons. Cependant, la lentille GRIN (Gradient Index) surmonte ce problème car la lentille GRIN peut être directement intégrée dans les tissus biologiques et relayer des images de la région profonde du cerveau à l’objectif du microscope. Contrairement à l’objectif conventionnel fait d’un matériau optiquement homogène et nécessitant une surface de forme compliquée pour faire la mise au point et créer des images, la performance de l’objectif GRIN est basée sur un changement progressif de l’indice de réfraction dans le matériau de l’objectif qui permet d’obtenir une mise au point avec une surface plane20. L’objectif GRIN peut être fabriqué jusqu’à 0,2 mm de diamètre. Par conséquent, une lentille GRIN miniaturisée peut être implantée dans le cerveau profond sans causer trop de dommages.
Dans cet article, un protocole chirurgical complet est présenté pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond. À des fins de démonstration, nous décrivons des chirurgies cérébrales ciblant spécifiquement le cortex préfrontal médian (mPFC) du cerveau de la souris et l’enregistrement in vivo de l’imagerie calcique via un système de miniscope sur mesure développé par le groupe du Dr Lin au National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP)7,12. La procédure expérimentale implique deux chirurgies cérébrales majeures. La première chirurgie consiste à injecter stéréotaxiquement un vecteur viral exprimant GCaMP6f (un GECI) dans le mPFC. La deuxième chirurgie consiste à implanter la lentille GRIN dans la même région du cerveau. Après la récupération de ces chirurgies cérébrales, la procédure suivante consiste à apposer le support de miniscope (base) sur le crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire. In vivo L’imagerie Ca2+ peut être effectuée à tout moment après le montage du miniscope sur sa base. Le protocole chirurgical pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est compatible avec tous les systèmes d’imagerie commerciale ou sur mesure à photon unique et à deux photons pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

<table><tbody><tr><td>Fraises de foret de 0,6 mm et 1,2 mm</td><td>Technologie KF</td><td>8000037800</td><td>Pour craniotomie</td></tr><tr><td>Aiguille BD 27-G et 30-G</td><td>Aiguille BD PrecisionGlide REF</td><td>305109 et REF305106</td><td>Pour les deux chirurgies</td></tr><tr><td>45 pinces coudées</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11251-35</td><td>Pour les chirurgies</td></tr> Solution de <tr><td>povidone iodée à 7,5 % (bétadine)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>Désinfectant de surface</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L</td><td>Nettoyant pour lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>Pour l’implantation de lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Pommade antibiotique</td><td>Technologie HeliDerm</td><td>81073087</td><td>Pour l’injection</td></tr><tr><td>de virus Médicament anti-inflammatoire (ibuprofène)</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>Agit comme analgésique après des interventions chirurgicales</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>Pour l’implantation de lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Logiciel de recodage de comportement (Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>Pour l’enregistrement du comportement</td></tr><tr><td>Écrou hexagonal en laiton</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>Pour l’implantation de lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td><td>Pour l’implantation de la lentille GRIN</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td>Pour la préparation d’un collecteur ACVR</td></tr><tr><td></td><td>NIDA/IRP</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Composant du système d’acquisition d’images</td></tr><tr><td>Réservoir d’oxygène comprimé et de dioxyde de carbone</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>Pour lentille GRIN implantation</td></tr><tr><td>Réservoir d’oxygène comprimé</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>Pour l’injection de virus</td></tr><tr><td>Microdrill sans fil</td><td>Technologie KF</td><td>8000037800</td><td>Pour craniotomie</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Henkel Coorporation</td><td># 1811182</td><td>Pour l’implantation de lentille GRIN</td></tr><tr><td>Contrôleur d’acquisition de données</td><td>NIDA/IRP</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Composant d’acquisition d’images système</td></tr><tr><td>Câble de transmission de données</td><td>NIDA/IRP</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Composant du système d’acquisition d’images</td></tr><tr><td>Set de ciment dentaire</td><td>C& B Metabond et catalyseur</td><td>A00253revA306 et A00168revB306</td><td>Pour l’implantation de lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Set de ciment dentaire</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>Pour l’implantation de lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>Pour l’implantation de lentilles GRIN</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Pour la préparation d’un</td></tr><tr><td>gel diététique</td> aCSF <td>Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>Complément alimentaire pour souris</td></tr><tr><td>lentille GRIN</td><td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>Pour implantation de lentille GRIN</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>Pour garder le corps de la souris au chaud pendant les chirurgies</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>Anesthésie</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>Pour l’implantation de lentille GRIN</td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>Anesthésie locale</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>Pour préparer un</td></tr><tr><td>microlitre de LCR seringue (Hamilton)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Pour l’injection de virus</td></tr><tr><td>MicroSeringue Pump</td><td>Controller World Precision Instrument</td><td>#178647</td><td>Pour l’injection de virus</td></tr><tr><td>Miniscope</td><td>NIDA/IRP</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Base du miniscope</td><td>Protolabs</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Pour le montage de la base</td></tr><tr><td>Bras de maintien du miniscope</td><td>NIDA/IRP</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Pour le montage de la base</td></tr><tr><td>Capuchon de protection du miniscope</td><td>Protolabs</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Pour la protection du miniscope</td></tr><tr><td>Contrôleur motorisé</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>Pour le montage de la base</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Puralube Vet Pommade</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>Tube PCR ophtalmique</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>Pour l’implantation de la lentille GRIN</td></tr><tr><td>Pinch</td><td>Clamp World Precision Instrument</td><td>14040</td><td>Pour le serrage du tube</td></tr><tr><td>Ruban en polytétrafluoroéthylène (PTFE)</td><td>TegaSeal Ruban PTFE</td><td>A-A-58092</td><td>Pour la fixation du miniScope à la base</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>Pour la préparation d’un CSF</td></tr><tr><td>BRAS ROBOTIQUE</td><td>NIDA/IRP</td><td>Conçu sur mesure</td><td>Pour l’implantation de lentille GRIN</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>Pour les deux chirurgies Vis de</td></tr><tr><td>réglage</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>Pour visser l’écrou hexagonal en laiton dans la base du miniscope</td></tr><tr><td>&nbsp ; Tube en caoutchouc de silicone, 0,062 « ID, 1/8 » OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>Pour l’irrigation du</td></tr><tr><td>bicarbonate de sodium</td><td>aCSF Sigma</td><td>144-55-8</td><td>Pour la préparation</td></tr> du <tr><td>chlorure de sodium</td><td>aCSF Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>Pour la préparation</td></tr> du <tr><td>phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>Pour la préparation de l’aCSF</td></tr><tr><td>Stade stéréotaxique</td><td>KOPF</td><td>Modèle 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td><td>Pour les deux chirurgies</td></tr><tr><td>Coton-tige stérile</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td>Pour les deux chirurgies</td></tr><tr><td>Outils chirurgicaux</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-35</td><td>Pour les chirurgies</td></tr><tr><td>Suture</td><td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>Pour injection de virus</td></tr><tr><td>&nbsp ; Filtre à seringue (0,22 & micro ; m)</td><td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>Pour filtrer l’aCSF lors de l’implantation du cristallin GRIN</td></tr><tr><td>Suspension virale (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td><td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>Pour l’injection</td></tr><tr><td></td><td></td> virale <td>Titre : 2.8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>Pour l’implantation du cristallin GRIN</td></tr></tbody></table>

injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Un microscope à fluorescence miniature (miniscope) est un outil puissant pour l’imagerie calcique in vivo d’animaux se comportant librement. Il offre plusieurs avantages par rapport aux systèmes d’imagerie calcique multiphotoniques conventionnels : (1) compact ; 2° légère; 3° abordable; et (4) permet l’enregistrement d’animaux se comportant librement. Ce protocole décrit les chirurgies cérébrales pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond à l’aide d’un système d’enregistrement miniscope développé sur mesure. La procédure de préparation comprend trois étapes, y compris (1) l’injection stéréotaxique du virus dans la région cérébrale souhaitée du cerveau d’une souris pour marquer un sous-groupe spécifique de neurones avec un capteur de calcium génétiquement codé; (2) implantation d’une lentille à indice de gradient (GRIN) capable de relayer l’image calcique de la région profonde du cerveau vers le système miniscope; et (3) l’apposition du support de miniscope sur le crâne de la souris où le miniscope peut être fixé plus tard. Pour effectuer une imagerie calcique in vivo , le miniscope est fixé sur le support et des images neuronales du calcium sont collectées avec des enregistrements de comportement simultanés. Le protocole chirurgical actuel est compatible avec tous les systèmes d’imagerie à photon unique et à deux photons commerciaux ou construits sur mesure pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

La figure 1 montre la procédure expérimentale schématique, y compris l’injection virale, l’implantation de lentilles GRIN, l’apposition de la base du miniscope sur le crâne de la souris et l’imagerie calcique in vivo via un miniscope. L’ensemble de la procédure prend environ 2 mois. La figure 2 montre les principaux composants décrits dans le protocole d’imagerie calcique in vivo miniscope. La figure 3 montre les interfaces du logiciel AutoStereota lors de l’implantation de la lentille GRIN. La figure 4 montre les interfaces de NeuView et du logiciel d’enregistrement du comportement lors de l’imagerie calcique in vivo.
Le résultat de l’imagerie calcique in vivo dépend du succès des chirurgies d’injection virale et d’implantation de lentilles GRIN. La figure 5 montre une gamme de résultats (c.-à-d. infructueux, sous-optimaux et bons) provenant d’enregistrements d’imagerie calcique in vivo . En cas d’échec, l’image du calcium peut apparaître sombre ou brillante, mais ne révèle généralement pas ou très peu de neurones actifs. Nous ne poursuivons généralement pas d’expériences d’enregistrement in vivo du calcium s’il y a moins de cinq neurones actifs. Une bonne imagerie calcique in vivo révèle généralement plusieurs centaines de neurones actifs. Si un enregistrement contient moins d’une centaine de neurones actifs, nous le considérons comme un enregistrement sous-optimal.
Dans des enregistrements sous-optimaux et bons, des expériences d’imagerie calcique in vivo ont été poursuivies et l’analyse ultérieure des données a été effectuée. Le film 1 montre un enregistrement représentatif de l’imagerie calcique in vivo de la souris mPFC. Les vidéos comportementales et les données d’imagerie calcique sont généralement traitées séparément. Les vidéos sur le comportement de la souris peuvent être notées manuellement. Les fichiers d’imagerie calcique sont traités à l’aide de la boîte à outils de traitement d’image calcium CaImAn24. La figure 6 montre une carte cellulaire représentative et plusieurs traces de calcium provenant d’un bon enregistrement in vivo par imagerie calcique.
Après avoir terminé l’imagerie calcique in vivo , la dernière étape consiste à confirmer si l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN ont eu lieu dans la région cérébrale souhaitée. À cette fin, la souris a été perfusée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 4% de paraformaldéhyde (PFA). Le cerveau de la souris a été récolté, postfixé dans 4% de PFA pendant 12 h et stocké dans du PBS à 4 °C. Le cerveau de la souris a ensuite été sectionné en tranches de 50 μm d’épaisseur avec un vibratome. Les tranches de cerveau ont été colorées avec du DAPI et observées au microscope (non décrites dans le protocole)12. La figure 7 est une tranche de cerveau de souris d’environ 1,94 mm antérieure à bregma d’une souris expérimentale, montrant la piste où la lentille GRIN a été implantée. La région de fluorescence verte sous et autour de la piste de lentille GRIN indique l’expression de GCaMP6f dans la région mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figure 1: Aperçu schématique de la procédure expérimentale. (A) Injection stéréotaxique de virus dans le mPFC. (B) Implantation de lentilles GRIN dans le mPFC. (C) Fixation de la base du miniscope sur le crâne de la souris. (D) Montage du miniscope et imagerie calcique in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figure 2 : Principaux composants nécessaires à l’imagerie calcique in vivo. (A) Un objectif GRIN de 1 mm de diamètre et 4,38 mm de longueur. (B) Aiguille à extrémité émoussée polie manuellement de 27 G utilisée pour l’aspiration du tissu cérébral. (C) Le bras robotique couplé au porte-aiguille. (D) Un capuchon sur mesure à partir d’un tube PCR pour protéger la lentille GRIN exposée jusqu’à l’apposition de la base du miniscope sur le crâne de la souris. (E) Le support de miniscope (base) avec un écrou hexagonal. (F) Un miniscope dont la partie filetée est enveloppée avec le ruban PTFE. (G) Un miniscope fixé à sa base avec une vis de verrouillage. (H) Le bras de maintien du miniscope. (I) Un contrôleur motorisé 3D sur mesure utilisé pour faciliter le mouvement du miniscope dans les positions XYZ. (J) Un capuchon de protection fixé à la base pour protéger la lentille GRIN exposée pendant que la souris n’effectue pas d’imagerie calcique in vivo. (K) Le miniscope connecté au câble. (L) Le système d’acquisition de données pour l’imagerie in vivo Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figure 3 : Interfaces du logiciel AutoStereota lors de l’aspiration du tissu cérébral couche par couche. (A) Interface correspondant aux étapes 2.17.1 à 2.17.3. B) L’interface correspondant aux étapes 2.17.4 à 2.17.6. (C) L’interface correspondant aux étapes 2.17.7 à 2.17.9. D) L’interface correspondant aux étapes 2.17.10 à 2.17.12. Les zones rouges mettent en surbrillance les valeurs d’entrée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figure 4 : Interfaces du logiciel NeuView et du logiciel d’enregistrement du comportement lors de l’imagerie calcique in vivo. (A) L’interface de NeuView. (B,C) Les interfaces du logiciel d’enregistrement de comportement. Les cases rouges mettent en surbrillance les boutons sur lesquels il faut cliquer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figure 5 : Cartes des cellules de fluorescence de projection maximale pour montrer l’éventail des résultats possibles. (A,B) Imagerie calcique in vivo infructueuse qui n’est pas acceptable pour l’analyse ultérieure des données. (A) est sombre et contient moins de 5 neurones actifs. (B) est brillant mais n’a pas de neurones actifs. (C) La carte cellulaire d’une imagerie calcique in vivo sous-optimale qui contient des neurones actifs. (D) La carte cellulaire d’une bonne imagerie calcique in vivo qui comprend plusieurs centaines de neurones actifs. Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figure 6 : Carte cellulaire représentative et transitoires calciques provenant d’une imagerie calcique in vivo réussie. Le panneau de gauche est la carte de la cellule de fluorescence de projection maximale d’un enregistrement in vivo d’imagerie calcique dans le mPFC lors d’un test en champ ouvert. L’enregistrement dure 5 min. Le panneau de droite montre les transitoires de calcium de 15 régions d’intérêt (couleur assortie). Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figure 7 : Évaluation post-mortem d’une souris expérimentale. L’évaluation post-mortem de l’expression de GCaMP6f et de l’implantation de lentilles GRIN dans le mPFC d’une souris expérimentale. La zone rectangulaire indique le chemin d’implantation de la lentille GRIN. La zone verte sous la région implantée de la lentille GRIN confirme que GCaMP6f a été exprimé et que la lentille GRIN a été implantée avec précision dans la région cérébrale souhaitée. Cg, cortex cingulaire; PrL, cortex prélimbique; IL, cortex infralimbique. Barre d’échelle: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Comparaisons du système de miniscope sur mesure du NIDA avec d’autres systèmes de miniscope 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Film 1 : Un enregistrement in vivo d’imagerie calcique de la souris mPFC lors d’un test en champ ouvert. À des fins de démonstration, cette vidéo ne montre que 1 min d’enregistrement. La fréquence d’images d’enregistrement d’origine est de 10 images/s. La vidéo est 6 fois plus rapide que l’enregistrement original. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>

L’imagerie calcique in vivo Miniscope est une technique puissante pour étudier la dynamique neuronale et les microcircuits chez des souris qui se comportent librement. Ce protocole décrit la réalisation de chirurgies cérébrales pour obtenir une bonne imagerie calcique in vivo à l’aide d’un miniscope.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

L’imagerie calcique in vivo Miniscope permet aux chercheurs d’examiner l’activité coordonnée spatialement et temporellement de centaines de neurones dans les structures cérébrales profondes d’animaux se comportant librement. L’imagerie calcique in vivo Miniscope offre de nombreux avantages, notamment la possibilité d’effectuer des enregistrements spécifiques au type de cellule, à grande échelle et longitudinal. Notre protocole chirurgical pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est compatible avec tous les systèmes d’imagerie à photon unique et à deux photons commerciaux ou personnalisés pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.Rashmi Thapa, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir désinfecté la zone chirurgicale rasée d’une souris anesthésiée, utilisez un scalpel pour faire une incision de deux centimètres à travers la peau le long de la ligne médiane pour exposer le lambda et le bregma du crâne. Après avoir localisé la bavure de forage dentaire de 0,5 millimètre dans une position antérieure postérieure de 1,94 millimètre et latérale médiale de 0,5 millimètre à partir de la bregma, commencez à percer le crâne.Ensuite, chargez le virus dans la seringue de microlitre à l’aide du panneau de commande de la micropompe et retirez 500 nanolitres de bulle d’air suivis de 800 nanolitres du virus à un débit de 50 nanolitres par seconde. Descendez lentement l’aiguille dans le tissu cérébral jusqu’à la coordonnée Z ciblée de 1,75 millimètre ventral dorsal, puis déplacez-la légèrement jusqu’à la coordonnée Z de ventral dorsal de 1,65 millimètre. Sur le panneau de commande, réglez la micro-pompe pour injecter 500 nanolitres du virus au débit de 50 nanolitres par minute avant d’appuyer sur le bouton Exécuter pour injecter le virus.Lorsque l’injection est terminée, alignez les bords de la peau et fermez soigneusement l’incision avec une suture 4-0. Appliquez une pommade antibiotique sur la zone cousue pour prévenir l’infection. Pour implanter un indice de gradient ou une lentille GRIN, excisez une zone triangulaire de la peau de 1,5 centimètre de hauteur et une base de 1,5 centimètre de la face antérieure entre les yeux vers la face postérieure derrière le lambda à l’aide de ciseaux fins.Une fois le crâne soigneusement nettoyé et séché, appliquez du cyanoacrylate sur les bords de la peau et attachez la peau au crâne. Après cinq minutes, lorsque le cyanoacrylate sèche, localisez une bavure de forage dentaire de 1,2 millimètre de diamètre à une position postérieure antérieure de 1,94 millimètre, latérale médiale de 0,8 millimètre du bregma. Percez à travers le crâne, puis retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de calibre 30.Nettoyez tous les débris osseux avec des pinces pointues inclinées à 45 degrés. Ensuite, fixez une aiguille d’extrémité émoussée polie manuellement de calibre 27 au porte-aiguille couplé à un bras robotique incliné avec un angle de 10 degrés et connectez l’autre extrémité du porte-aiguille au système d’aspirateur de la maison. Localisez la pointe de l’aiguille pour simplement toucher le bregma avant de cliquer sur le bouton Bregma pour régler la coordonnée Z du bregma sur zéro.Définissez la valeur x d’entrée sur 0,8, la valeur d’entrée Y sur 1,94, la valeur d’entrée Z sur 1,0 et cliquez sur le bouton Rechercher pour déplacer l’aiguille sur le dessus du trou percé sur le crâne. Centrez la pointe de l’aiguille sur le trou percé et ramenez-la à la position Z zéro. Allumez le vide et commencez à rincer la zone cérébrale exposée avec du liquide céphalo-rachidien artificiel, ou ACSF, à l’aide d’un système de tuyauterie à gravité contrôlée relié à une aiguille de calibre 30 avec une pointe pliée.ACSF est continuellement bouillonné avec un mélange gazeux de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone tout en étant filtré à travers un filtre de 0,2 micron. En utilisant le logiciel AutoStereota, l’aspiration du tissu cérébral se terminera en quatre tours. Pour le premier tour d’aspiration, assurez-vous que la valeur Z affiche zéro.Ensuite, dans la session zStep, cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 0,2 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4.En mode session, réglez la taille de l’aiguille 27 jauge et 1.2. Réglez Dims 0,9. Toutes les autres valeurs seront par défaut.Pour démarrer l’aspiration, cliquez séquentiellement sur les boutons NotSet, KeepZero et Start. Le premier cycle d’aspiration génère une poche colonne de 0,8 millimètre de profondeur et 1 millimètre de diamètre. Dans le troisième cycle d’aspiration, cliquez et vérifiez la première ligne de la session zStep et définissez les valeurs de la première ligne sur 1,8 et 1.En mode session, réglez la taille de l’aiguille 27 jauge et 2.2. Commencez l’aspiration en gardant les autres valeurs les mêmes que celles du tour précédent. Après le troisième cycle d’aspiration, la profondeur de la poche de la colonne est de 1,8 millimètre.La dernière série d’aspirations consiste à nettoyer le sang accumulé au fond de la poche. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,6 et 1 dans la session zStep et définissez la taille de l’aiguille 27 jauge et 2,2 et Dims 0,6 dans la session Mode avant de commencer l’aspiration. Une fois que la poche est libre de sang, arrêtez le vide, arrêtez l’irrigation de l’ACSF et amenez l’aiguille de 2 millimètres en coordonnée Z et de 0,5 millimètre avant au centre.Placez la lentille GRIN stérile de 1 millimètre dans la poche de tissu cérébral. Ensuite, appliquez l’agarose fondue dans l’espace entre la lentille GRIN et le tissu cérébral à l’aide d’une spatule. Après que l’agarose a formé un gel, éliminer l’excès d’agarose à l’aide d’une micro lame.Mélangez la poudre de ciment dentaire et le liquide catalyseur dans un puits de mélange pré-refroidi et appliquez une couche de ciment de résine adhésive auto-durcissant sur le crâne, en commençant par entourer la lentille GRIN, puis en recouvrant tout le crâne exposé. Dans un puits en plastique propre, mélangez la poudre de ciment dentaire et le charbon de bois noir avec du liquide pour appliquer une fine couche du mélange sur la première couche de ciment dentaire. Laissez durcir pendant cinq minutes.Connectez le Miniscope au câble et allumez le logiciel personnalisé NuView. Dans NuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1 et cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct. Pour arrêter la diffusion en direct, cliquez sur le bouton Arrêter.Ensuite, installez le Miniscope dans un bras de maintien Miniscope sur mesure. À l’aide de contrôleurs motorisés, localisez le Miniscope juste au-dessus de l’objectif GRIN exposé, en le rendant parallèle à la surface de l’objectif. Abaissez lentement le Miniscope vers l’objectif GRIN et ajustez sa position Z jusqu’à ce que le meilleur plan de mise au point soit trouvé.Appliquez la première couche de ciment dentaire autour de la base du Miniscope sans modifier la position du Miniscope. Une fois le ciment durci, retirez doucement le bras de maintien de sorte que le Miniscope puisse se tenir seul sur la tête de la souris. Appliquez une deuxième couche de ciment dentaire autour de la base pour combler tous les espaces, en vous assurant qu’il n’y a pas de fuite de lumière LED des espaces.Laissez le ciment dentaire durcir. Après avoir brièvement anesthésié la souris avec de l’isoflurane, desserrez la vis de verrouillage de la base avec un petit tournevis avant de retirer le capuchon de protection et nettoyez la surface de la lentille GRIN avec un coton-tige imbibé d’acétone. Connectez le Miniscope au câble et démarrez le logiciel NuView pour commencer à identifier le meilleur plan focal en ajustant la position du Miniscope par rapport à la base en resserrant ou en desserrant légèrement à l’aide de pinces contondantes.Une fois le meilleur plan focal déterminé, serrez la vis de verrouillage avant de déconnecter le câble et de replacer la souris dans sa cage d’origine. Activez le logiciel de la caméra de comportement pour afficher l’arène de comportement de la souris via une fonction de diffusion en direct. Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo supérieur.Sélectionnez Trigger Strobe et cochez activer/désactiver le déclencheur, puis cliquez sur le bouton Enregistrer. Utilisez ensuite Parcourir pour sélectionner un emplacement où les enregistrements de comportement seront enregistrés. Sélectionnez le format d’image souhaité.Rapprochez la souris de l’arène et connectez le Miniscope au câble relié au système d’acquisition de données. Placez ensuite la souris au centre de l’arène. Dans le logiciel de la caméra de comportement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement.Dans NuView, cochez LED1, cliquez sur Capturer, puis déclenchez des boutons pour démarrer l’enregistrement. Cela permet des enregistrements simultanés de l’imagerie calcique et du comportement de la souris. Appuyez sur Arrêter après 3 000 images et enregistrez les fichiers.Lorsque l’enregistrement est terminé, anesthésiez brièvement la souris avec de l’isoflurane, détachez le Miniscope de la base et placez le capuchon de protection sur la base avant de replacer la souris dans sa cage d’origine. La carte cellulaire de l’imagerie calcique in vivo sous-optimale contenait des neurones actifs, tandis que celle de l’imagerie réussie comprenait plusieurs centaines de neurones actifs dans la zone ciblée. Dans l’exemple typique d’une imagerie calcique in vivo infructueuse, on a observé que la région était sombre et contenait moins de cinq neurones actifs, ou que la région était brillante mais n’avait pas de neurones actifs.Dans l’analyse représentative, la carte cellulaire de fluorescence de projection maximale et les transitoires calciques d’un enregistrement in vivo successif d’imagerie calcique sont montrés. L’évaluation post-mortem de l’expression de GCaMP6f et de l’implantation de lentilles GRIN dans le PFC médial d’une souris expérimentale a indiqué que GCaMP6f a été exprimé et que la lentille GRIN a été implantée avec précision dans la région cérébrale souhaitée. Pour obtenir une bonne imagerie calcique, il est nécessaire de s’assurer que le saignement s’est complètement arrêté et que le champ est exempt de caillots sanguins avant d’implanter la lentille GRIN.Cette technique peut être utilisée pour étudier les changements de circuit neuronal dans le modèle murin de différents troubles cérébraux humains et tester si un candidat médicament peut normaliser les circuits altérés.

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Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.

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Dans cet article, nous montrons une méthode pour faire des aiguilles capillaires en verre avec une lumière de 50 um. Cette technique réduit considérablement les dommages au cerveau, minimise la diffusion passive des médicaments et permet un ciblage précis dans le cerveau des rongeurs.

Ciblage des structures cérébrales profondes avec des microinjections de livraison des médicaments, des vecteurs viraux, ou de cellules

Source : Lee, H. et. al., Imagerie calcique in vivo réussie avec un microscope miniaturisé monté sur la tête dans l’amygdale d’une souris se comportant librement. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’imagerie calcique in vivo chez une souris à l’aide d’un indice de réfraction à gradient, ou lentille GRIN, et d’un microscope miniaturisé. La configuration combine la fixation de la tête dans un système de cage mobile sans friction, stimulant les neurones et déclenchant l’afflux d’ions calcium.

Imagerie calcique microendoscopique en temps réel chez une souris en mouvement libre

Source : Thapa, R., et. al., Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à gradient d’indice pour le cerveau profond Imagerie calcique in vivo.  J. Vis. Exp. (2021)La vidéo démontre l’imagerie calcique en temps réel à l’aide d’un miniscope chez une souris transduction, en corrélant l’activité neuronale avec le comportement.

Imagerie calcique en temps réel du cortex préfrontal médian d’une souris à l’aide d’un miniscope

Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l'imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle.

Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

L’imagerie microendoscopique in vivo de calcium est un outil inestimable qui permet la surveillance en temps réel des activités neuronales chez les animaux qui se comportent librement. Cependant, l’application de cette technique à l’amygdale a été difficile. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour cibler avec succès les cellules d’amygdale avec un microscope miniaturisé chez la souris.

Imagerie au calcium In vivo réussie avec un microscope miniaturisé head-mount dans l’Amygdale de la souris qui se comporte librement

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Le retrait du ciment dentaire pendant le durcissement déplace la plaque de base. Ce protocole minimise le problème en créant une fondation initiale du ciment dentaire qui laisse de l’espace pour cimenter la plaque de base. Quelques semaines plus tard, la plaque de base peut être cimentée en position sur cet échafaudage en utilisant peu de ciment neuf, réduisant ainsi le retrait.

Utilisation d’un baseplatage et d’un miniscope préancré avec une lentille objective pour la recherche transitoire de calcium chez la souris

Le gyrus denté de l’hippocampe remplit des fonctions essentielles et distinctes dans l’apprentissage et la mémoire. Ce protocole décrit un ensemble de procédures robustes et efficaces pour l’imagerie calcique in vivo des cellules granulaires dans le gyrus denté chez des souris se déplaçant librement.

Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris 

Ce protocole détaille l’imagerie calcique in vivo des neurones hypothalamiques à l’aide d’un microscope miniaturisé (miniscope) chez des souris se comportant librement lors de manipulation de l’état social (isolement social et retrouvailles sociales). Cette méthode permet d’imager, à résolution neuronale unique, de l’activité hypothalamique représentant le besoin social et la satiété, permettant des études mécanistes de l’homéostasie sociale.

In Vivo Imagerie calcique avec un microscope miniaturisé dans l’hypothalamus pour comprendre les comportements sociaux chez la souris

Apprenez l'imagerie calcique in vivo avec miniscope pour étudier la dynamique neuronale chez des souris en comportement libre. Cette méthode chirurgicale permet l'enregistrement à grande échelle et longitudinal de l'activité cérébrale profonde.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond (Vidéo) | JoVE Journal

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

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