Name: Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Découvrez une technique efficace pour isoler les cardiomyocytes de souris sans appareil de Langendorff. Cette méthode réduit le temps d'ischémie par perfusion in vivo et améliore le rendement cellulaire pour vos expériences cardiovasculaires.

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Ce travail a été soutenu par les subventions R01 HL114940 (Biesiadecki) des National Institutes of Health, R01 AG060542 (Ziolo) et T32 HL134616 (Sturgill et Salyer).

Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Ohio State University conformément aux directives des NIH.
1. Préparation de la solution
NOTA : Veuillez consulter le tableau 2 pour connaître les concentrations de tampons.
<ol><li>Pré-isolement (jusqu’à 2 semaines avant l’isolement des myocytes<ol><li>Base tampon de perfusion : Préparer 1 L de base tampon de perfusion (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Ajuster à pH7,4 avant la filtration stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.</li>
		<li>Tampon de nettoyage: Préparer 1 L de tampon de nettoyage (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA et BDM) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Ajuster à pH7,4 avant une filtration stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.</li>
		<li>Solution mère de CaCl 2 de 100 mM : Peser 1,11 g de CaCl 2 et dissoudre dans 100 mL de 18,2 MΩ·cm H2 O ultrapure. Conserver à température ambiantejusqu’au jour de l’isolement.</li>
		<li>Aliquotes liberase : Dissoudre 5 mg d’enzymes digestives dans 5 mL d’eau stérile sans RNase. Préparer 0,8 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C jusqu’au jour de l’isolement.</li>
		<li>Laminer les plats : Appliquer 100 μL de laminine de souris à 40 μg/mL sur des boîtes de Petri stériles de 30 ml à fond de verre. Laisser reposer pendant 30 minutes et enlever l’excès de laminine. Réglez la laminine sur une boîte de Petri avec incubation UV à température ambiante pendant 30 min. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement (les boîtes de Petri laminées peuvent être utilisées jusqu’à 2 semaines).</li>
		<li>Milieu DMEM : Dans une enceinte de biosécurité, ajouter 2,5 mL de FBS, 0,5 mL de Pénicilline-Streptomycine (50 U/mL-50 μg) et 1 mL de 500 mM de BDM à 46 mL de DMEM. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement (le milieu peut être utilisé jusqu’à 2 semaines).</li>
		<li>Milieu M199 : Préparer 1 L de milieu M199 (NaHCO3, HEPES, L-glutathion, M199, BDM et BSA) dans 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Ajuster à pH 7,4 avant la filtration stérile (filtre de 0,22 μm). Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.</li>
		<li>Stock de BDM 500 mM : Ajouter 0,5 g de BDM à 10 mL de 18,2 MΩ·cm H2O ultrapur. Conserver à 4 °C jusqu’au jour de l’isolement.</li>
		<li>Création de plate-forme stabilisatrice: pâte à modeler autour de la base de l’aiguille vissée dans le robinet d’arrêt Luer. Mouler dans la boîte de Petri qui contiendra le cœur et s’assurer que l’aiguille est à la bonne hauteur pour l’injection du ventricule (~5 mm au-dessus du fond de la boîte).</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour de l’isolement<ol><li>Tampon de perfusion : Le jour de l’isolement, ajouter 9,5 mg de MgCl2 à 100 mL de base tampon de perfusion. Laisser mélanger complètement avant de retirer 30 ml de tampon de perfusion terminé et placer dans une bouteille de verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis (tampon de digestion). REMARQUE : Ces ajouts peuvent être effectués le jour de l’isolement sans ajustement supplémentaire du pH, car leur ajout modifie de façon négligeable le pH.<ol><li>Retirer 12 ml de tampon de perfusion et placer sur le côté (tampon d’arrêt). Versez les 58 ml restants de tampon de perfusion dans une autre bouteille en verre propre et à large ouverture de 100 ml munie d’un couvercle à vis. Entreposer le tampon de perfusion restant à 37 °C pendant toute la durée de l’isolement.</li>
		</ol></li>
		<li>Tampon de digestion : Ajouter 7,5 μL de CaCl100 mM 2 à 30 mL de tampon de perfusion pour une concentration finale de 25 μM. Immédiatement avant l’isolement, ajouter 770 μL de Liberase au tampon de digestion pour une concentration finale de 26 μg/mL.</li>
		<li>Tampon d’arrêt : Dissoudre 240 mg de BSA dans 12 mL de tampon de perfusion. Conserver à 37 °C pendant toute la durée de l’isolement.</li>
		<li>Tampon d’élimination : Préparez une seringue de 3 ml de tampon de nettoyage et débarrassez-vous de l’aiguille des bulles. Conserver sur de la glace jusqu’à l’isolement.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation du collecteur
<ol><li>Dégagez le collecteur à température contrôlée avec un tampon de perfusion fraîchement préparé, en veillant à ne pas laisser de bulles. À l’aide d’un connecteur Luer lock, vissez une aiguille de 27 G et débarrassez-vous des bulles. Un collecteur dégagé est essentiel pour un isolement réussi.</li>
</ol>3. Préparation des animaux
<ol><li>Injecter à la souris par voie intrapéritonéale 100 mg/kg de kétamine et 20 mg/kg de xylazine en poids corporel immédiatement avant l’isolement. Cette procédure a utilisé une souris C57Bl/6 mâle âgée de 4 mois.</li>
	<li>Si nécessaire, placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé pour encourager la sédation. Tendez les bras de la souris et collez les membres et la base de la queue à une couche de laboratoire bleue. S’assurer que l’animal est complètement anesthésié par le retrait du réflexe de pincement des orteils. Appliquez un champ stérile autour de la zone chirurgicale.</li>
</ol>4. Procédure d’isolement des cardiomyocytes
<ol><li>Exposez le sternum de la souris et, latéralement à la ligne médiane, coupez proximale à travers les côtes et à l’aisselle. Couper doucement complètement à travers le diaphragme, en assurant des coupures peu profondes pour éviter le cœur. Serrez le sternum avec un hémostatique et pliez les côtes vers l’arrière pour exposer la cavité thoracique.</li>
	<li>Retirez doucement le péricarde du cœur et coupez complètement la veine cave inférieure, immédiatement distale au cœur. Utilisez une seringue de 3 mL avec une aiguille de 27 G pour injecter rapidement 3 mL de tampon de nettoyage glacé dans le ventricule droit du cœur pendant 1 min.</li>
	<li>Tenez doucement le cœur à l’aide d’une pince à épiler et éloignez-vous du corps, en exposant autant que possible l’aorte. À l’aide d’un hémostatique, serrez l’aorte ascendante, en prenant soin de ne pas serrer les oreillettes, et excisez le cœur de la poitrine.</li>
	<li>Transférer rapidement le cœur serré sur le couvercle d’une boîte de Petri en polypropylène avec environ 10 ml de tampon de perfusion chaude. Placez le cœur serré dans la plate-forme de support et utilisez une aiguille stabilisée de 27 G fixée au collecteur pour injecter 10 ml de tampon de perfusion à température contrôlée à 37 °C dans le ventricule gauche pendant 5 minutes.</li>
	<li>Transférer le cœur serré et la plate-forme de soutien dans une boîte de Petri avec environ 5 ml de tampon de digestion. Échangez les seringues d’entrée contre une seringue de 50 mL avec 25 mL de tampon de digestion.</li>
	<li>Débarrassez le collecteur de toute bulle et du tampon de perfusion restant avant l’injection. Replacez délicatement l’aiguille dans la même position d’aiguille dans l’apex ventriculaire gauche.</li>
	<li>Utilisez une pompe de perfusion pour injecter un tampon de digestion à température contrôlée à 37 °C dans le ventricule gauche pendant 15 minutes à l’aide d’une seringue de 50 mL. Contrôler la température de la solution à l’aide d’une chemise d’eau préalablement calibrée pour éjecter une solution à 37 °C à l’extrémité de l’aiguille.</li>
	<li>Retirez les ventricules des oreillettes et transférez-les dans un bécher de 10 mL. Ajouter 3 mL de tampon de digestion dans le bécher et, à l’aide de ciseaux tranchants, couper les ventricules en gros morceaux. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et placer dans un bain-marie en agitation préchauffé à 37 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Jetez le surnageant, en prenant soin d’éviter d’enlever des morceaux de tissu. Remettez en suspension les morceaux de tissu dans 3 mL de tampon de digestion et triturez pendant environ 4 minutes ou jusqu’à ce qu’un mélange homogène soit obtenu.</li>
	<li>Filtrer les cellules à travers une crépine à cellules en nylon de 70 μm dans un tube en polypropylène de 50 mL.</li>
	<li>Remettre le filtrat dans un tube en polypropylène à fond rond de 14 ml et centrifuger pendant 1 min à 100 tr/min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 mL de tampon stop.</li>
	<li>Ajouter 54 μL de 100 mM de CaCl2 aux cellules remises en suspension pourune concentration finale de CaCl2 de 1,8 mM. Cette étape peut également être effectuée étape à pas pour augmenter le rendement cellulaire.</li>
	<li>Laisser les cellules vivantes se déposer par gravité pendant 10 minutes avant de retirer le surnageant contenant les cellules mortes. Remettre en suspension la pastille dans une solution de stockage (solution de perfusion avec 200 μM de CaCl2). Ces cellules peuvent maintenant être utilisées pour des expériences fonctionnelles (c.-à-d. imagerie / contraction du calcium, pince de patch, etc.), la culture, etc. REMARQUE: Les cellules peuvent également être remises en suspension dans des solutions dépendantes du laboratoire ou de l’expérience.</li>
</ol>5. Culture cellulaire
<ol><li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou par un comptage de vue de champ à l’aide d’un bordereau de couverture quadrillé. Comme les myocytes sont très gros, le comptage à l’aide d’un hémocytomètre n’est pas toujours précis. Ceci est utilisé pour avoir une idée approximative du nombre de cellules obtenues à partir de l’isolement.</li>
	<li>Diluer les cellules à ~25 000 cellules/ml avec un milieu DMEM. Ajouter 1 mL de solution cellulaire à chaque puits.</li>
	<li>Incuber à 37 °C, 95%O2, 5% CO 2 pendant2 h.</li>
	<li>Aspirer doucement le média DMEM de chaque puits et ajouter 2 ml de média M199.</li>
	<li>Incuber à 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 jusqu’à 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li>
<li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li>
<li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
<li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2%2B+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).</li>
<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le principal avantage de notre technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff est qu’elle limite l’hypoxie et le temps ischémique en ne nécessitant pas de canulation à un appareil de Langendorff. Alternative aux techniques classiques de Langendorff qui prennent plusieurs minutes pour enlever, nettoyer et suspendre le cœur, entraînant souvent des dommages ischémiques au myocyte, notre méthode comprend une élimination in vivo du sang via une solution de nettoyage glacée. Le tampon de nettoyage ...

Pendant des décennies, une idée essentielle dans la littérature en biologie cardiaque est le mécanisme moléculaire de l’action. Le mécanisme d’action doit être établi afin de publier des études fiables. Une stratégie bien établie pour déterminer le mécanisme moléculaire consiste en des études de cardiomyocytes isolés, qui nécessitent des cardiomyocytes de haute qualité pour obtenir des données fiables. Les expériences cellulaires et moléculaires effectuées sur les cardiomyocytes pour déterminer le mécanisme d’action sont l’étalon-or pour étudier la contraction1, l’électrophysiologie2, le cycle du calcium (Ca 2+)3, la sensibilité du myofilament Ca2+ 4, le cytosquelette5, le métabolisme6, les effets des hormones7, les molécules de signalisation8, les études sur les médicaments9 etc. La souris est devenue l’espèce de choix pour la plupart des expériences de biologie cardiaque en raison de la facilité de manipulation génétique, de sa petite taille, de sa durée de vie relativement courte, de son faible coût, etc.10. Cependant, l’isolement fiable des cardiomyocytes de souris de haute qualité n’est pas trivial avec les techniques actuelles.
Les laboratoires isolent les cardiomyocytes depuis près de 70 ans11. Pratiquement toutes les techniques d’isolement des cardiomyocytes reposent sur la digestion du cœur via diverses enzymes (collagénase, protéase, trypsine, etc.). Dans les premières périodes (années 1950-1960), la méthode des morceaux a été utilisée, qui consistait à retirer le cœur, à couper en morceaux beaucoup plus petits et à incuber en solution avec collagénase / protéase / trypsine12. Dans les années 1970, les laboratoires ont mis en œuvre la méthode améliorée « Langendorff »13, qui isolait les cardiomyocytes à l’aide d’une technique d’isolement basée sur la perfusion des artères coronaires (perfusion rétrograde avec enzyme via l’appareil de Langendorff); Cette technique reste la méthode dominante d’isolement des myocytes dans le domaine aujourd’hui, ~50 ans plus tard14,15,16. Des travaux récents se sont tournés vers la canulation du cœur in vivo pour limiter le temps d’hypoxie et les dommages ischémiques, ce qui a entraîné des isolements de cardiomyocytes supérieurs (meilleurs rendements et meilleure qualité)17. Récemment, cela a évolué pour effectuer in vivo, des perfusions cardiaques sans Langendorff 18,19,20,21,22. Nous avons fait évoluer la technique d’isolation des cardiomyocytes sans Langendorff basée sur la technique d’Ackers-Johnson et al.18 et adapté divers composants des nombreuses techniques d’isolement précédentes. Ces adaptations clés comprennent l’injection d’un tampon de nettoyage glacé et l’incorporation d’une plate-forme de soutien pour stabiliser l’aiguille, ce qui permet de réduire la manipulation du cœur. Cette technique détaille également le contrôle de la température des tampons injectés (37 °C), qui réduit le temps entre l’injection in vivo et la digestion en raison d’une perfusion réduite d’EDTA, comme publié précédemment18. En diminuant la manipulation du cœur et donc en minimisant la taille du site de ponction, on obtient une perfusion complète et constante des artères coronaires. Nous avons également affiné la technique avec une méthode de digestion secondaire en morceaux, la quantité d’EDTA dans le tampon de compensation injecté et modifié le pH. Notre technique décrite est plus fiable, plus efficace et ne nécessite pas la formation / pratique approfondie par rapport à l’utilisation de l’appareil Langendorff (tableau 1).

<table><tbody><tr><td>10 cc Bd Luer-Lok Seringue</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mL bouchon en polypropylène Bouteille de stockage en verre</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tubes à essai en polypropylène à fond rond avec bouchon</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanedione Monoxime</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td>>98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok Seringue</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL BD Seringue sans aiguille</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95 % O2 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Space Gel Heating Pad</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 g x 1/2" Aiguilles hypodermiques</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3803</td><td>Fraction de choc thermique, poudre lyophilisée, essentiellement sans acides gras, >98 %</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>>99 %</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Convient pour la culture cellulaire, >99,5 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC Plat de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Circulateurs à immersion chauffés</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Pince hémostatique</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber</td><td>Set Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99.5 %</td></tr><tr><td>Ruban d’étiquetage</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Pousse-seringue</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathion</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH Research Grade</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>Concentration élevée de thermolysine</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de magnésiumInvitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Corning</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>>99 %</td></tr><tr><td>Precision Digital Bain d’eau alternatif</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Convient pour la cellule culture</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma</td><td>S5886</td><td>>99 %</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>>99 %</td></tr><tr><td>Passoire à cellules stériles 70 &micro ; m</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins d’étudiant</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sous-couches absorbantes VWR</td><td>Fisher Sci NC9481815</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Le besoin de méthodes reproductibles mais techniquement simples produisant des cardiomyocytes de haute qualité est essentiel pour la recherche en biologie cardiaque. Les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires (p. ex. contraction, électrophysiologie, cycle du calcium, etc.) sur les cardiomyocytes sont l’étalon-or pour établir le(s) mécanisme(s) de la maladie. La souris est l’espèce de choix pour les expériences fonctionnelles et la technique décrite est spécifiquement pour l’isolement des cardiomyocytes de souris. Les méthodes antérieures nécessitant un appareil de Langendorff nécessitent des niveaux élevés d’entraînement et de précision pour la canulation aortique, entraînant souvent une ischémie. Le domaine évolue vers des méthodes d’isolement sans Langendorff qui sont simples, reproductibles et produisent des myocytes viables pour l’acquisition de données physiologiques et la culture. Ces méthodes diminuent considérablement le temps d’ischémie par rapport à la canulation aortique et permettent d’obtenir des cardiomyocytes obtenus de manière fiable. Notre adaptation à la méthode sans Langendorff comprend une perfusion initiale avec une solution de nettoyage glacé, l’utilisation d’une plate-forme stabilisatrice qui assure une aiguille stable pendant la perfusion et des étapes de digestion supplémentaires pour garantir un obtention fiable de cardiomyocytes pour une utilisation dans les mesures fonctionnelles et la culture. Cette méthode est simple et rapide à réaliser et nécessite peu de compétences techniques.

Il y a quelques éléments à examiner pour déterminer le succès d’un isolement. Tout d’abord, les cardiomyocytes doivent être en forme de bâtonnets sans blebs membranaires, tels que les cellules isolées à la figure 1. Un isolement typique donnera ~80% des myocytes étant en forme de bâtonnet. Si l’isolement produit moins de 50% de cellules en forme de bâtonnet, il est considéré comme un isolement infructueux et les cardiomyocytes ne sont pas utilisés. Enfin, les cardiomyocytes doivent être au r...

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Cette technique est plus fiable et efficace et ne nécessite pas de pratique ou de formation approfondie par rapport aux techniques d’appareils Langendorff les plus couramment utilisées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle limite le temps ischémique puisque la perfusion initiale se produit in vivo. Lors de l’exécution de cette technique, il est essentiel d’éviter les bulles dans le collecteur et d’éviter les mouvements excessifs du cœur pendant la digestion, ceux-ci peuvent diminuer le rendement.Sarah Sturgill, étudiante diplômée dans le laboratoire du Dr Mark Ziolo, fera la démonstration de cette technique. Commencez par nettoyer le collecteur à température contrôlée à l’aide d’un tampon de perfusion fraîchement préparé. Pour ce faire, vissez une aiguille de calibre 27 et éliminez les bulles à l’aide d’un connecteur de verrouillage luer.Assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles. Pour isoler le cardiomyocytes, exposer le sternum de la souris entièrement anesthésiée et, latéralement à la ligne médiane, couper proximale à travers les côtes et à l’aisselle. Ensuite, coupez à travers le diaphragme, en assurant des coupures peu profondes pour éviter le cœur.Serrez le sternum avec un hémostatique et repliez les côtes vers l’arrière pour exposer la cavité thoracique. Retirez doucement le péricarde du cœur avant de couper à travers la veine cave inférieure immédiatement distale au cœur. Injectez trois millilitres de tampon de nettoyage glacé dans le ventricule droit du cœur pendant une minute à l’aide d’une aiguille de calibre 27.Ensuite, tenez le cœur à l’aide d’une pince à épiler. Éloignez-le du corps et exposez autant que possible l’aorte. Ensuite, serrez l’aorte ascendante à l’aide d’un hémostatique et excisez le cœur.Transférez rapidement le cœur serré sur le couvercle d’une boîte de Petri en polypropylène contenant 10 millilitres de tampon de perfusion chaude. Placez le cœur serré dans la plate-forme de support et injectez 10 millilitres de tampon de perfusion à température contrôlée à 37 degrés Celsius dans le ventricule gauche pendant cinq minutes à l’aide d’une aiguille stabilisée de calibre 27 fixée au collecteur. Ensuite, transférez le cœur serré et la plate-forme de support dans une boîte de Petri avec environ cinq millilitres de tampon de digestion.Échangez des seringues d’entrée contre une seringue de 50 millilitres contenant 25 millilitres de tampon de digestion. Débarrassez le collecteur de toute bulle et du tampon de perfusion restant avant l’injection. Replacez délicatement l’aiguille dans la même position d’aiguille dans l’apex ventriculaire gauche.À l’aide d’une pompe à perfusion, injectez un tampon de digestion de 37 degrés Celsius dans le ventricule gauche pendant 15 minutes à l’aide d’une seringue de 50 millilitres. Contrôlez la température de la solution avec une chemise d’eau calibrée pour éjecter une solution à 37 degrés Celsius. Retirez les ventricules des oreillettes avant de les transférer dans un bécher de 10 millilitres.Ajouter trois millilitres de tampon de digestion au bécher et couper les ventricules en gros morceaux à l’aide de ciseaux tranchants. Couvrez le bécher avec du papier d’aluminium et placez-le dans un bain-marie tremblant préchauffé à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension les morceaux de tissu dans trois millilitres de tampon de digestion et triturer pendant environ quatre minutes ou jusqu’à ce qu’un mélange homogène soit obtenu.Une fois cela fait, filtrez les cellules dans un tube en polypropylène de 50 millilitres à l’aide d’une crépine à cellules en nylon de 70 micromètres. Lavez la passoire à cellules en nylon avec trois millilitres de tampon de digestion. Remettez le filtrat dans un tube en polypropylène à fond rond de 14 millilitres et centrifugez-le.Jeter le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans trois millilitres de tampon d’arrêt. À la suspension cellulaire, ajoutez 54 microlitres de chlorure de calcium de 100 millimolaires pour obtenir une concentration finale de chlorure de calcium de 1,8 millimolaire. Laissez les cellules vivantes se déposer pendant 10 minutes et retirez le surnageant contenant des cellules mortes.Après avoir remis en suspension la pastille dans une solution de stockage, les cellules peuvent être utilisées pour des expériences fonctionnelles et des cultures. Les images au microscope à fond clair de cellules isolées ont montré que l’isolement des cardiomyocytes de souris produisait des cellules quiescentes en forme de bâtonnets sans blebs membranaires ni bords arrondis. Les cellules ont montré un rendement d’environ 80% et des taux de survie élevés déterminant le succès de la technique d’isolement.Pour une isolation réussie, il est très important de retirer les bulles du collecteur et d’insérer l’aiguille dans le même trou dans le cœur. Une fois isolés, les cardiomyocytes peuvent être utilisés pour des expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires.

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Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

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Procédé de perfusion antegrade pour l’isolement de cardiomyocytes de souris

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Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Ce protocole décrit les modifications de la méthode de Langendorff, y compris la profondeur de la canulation de l’aorte pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes.

Modifications de la méthode de Langendorff pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes

Découvrez une technique efficace pour isoler les cardiomyocytes de souris sans appareil de Langendorff. Cette méthode réduit le temps d'ischémie par perfusion in vivo et améliore le rendement cellulaire pour vos expériences cardiovasculaires.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

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