Utilisation de Crystal Violet pour améliorer la lecture visuelle basée sur les effets cytopathiques pour la tittration virale à l’aide des tests TCID50
12 février 2022
Ce protocole montre une approche précise et objective pour visualiser les titrages viraux à l’aide de violet cristallin, en le comparant à la microscopie optique et à la coloration immunocytochimique.
L’objectif de ce protocole est de produire un titrage de stock de virus et de le visualiser à l’aide d’une coloration violette cristalline. Pour ce faire, un titrage viral général sera démontré suivi de la coloration. Ce titrage sera effectué dans une plaque de 96 puits pendant une période de sept jours dans une armoire de biosécurité au sein d’un laboratoire de niveau de biosécurité 2.
Pour ce faire, une plaque de 96 puits de la lignée cellulaire préférée sera ensemencée à l’aide du milieu correspondant et laissée croître jusqu’à confluent. Le stock de virus sera dilué en utilisant des dilutions décuplées, en mélangeant 900 microlitres de milieu et 100 microlitres de virus, ou la dilution correspondante. Assurez-vous de vortexer chaque tube pour assurer un bon mélange du milieu et du virus et éviter les erreurs sur les dilutions.
Écrivez la disposition de votre plaque dans le plomb ainsi que chaque dilution pour aider pendant le processus d’infection. Avant l’infection, laver à l’aide de 200 microlitres de PBS. Ajoutez 50 microlitres de votre inoculum dans les puits correspondants.
Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de CO2 pendant sept jours. Après l’incubation de sept jours, laver à l’aide de 200 microlitres de PBS. Fixez les cellules en ajoutant 50 microlitres par puits de PFA à 4% dans pbS et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.
Après l’incubation, laver à nouveau les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS avant l’ajout de 50 microlitres par puits de violet cristallin dans l’eau et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Enfin, aspirez le cristal violet des puits et, éventuellement, laissez les plaques sécher à l’air libre pendant deux à cinq minutes à température ambiante ou lavez-les avec 200 microlitres d’eau pour éliminer les taches excessives avant la visualisation. En conséquence, après une nouvelle coloration, les cellules négatives seront colorées.
Les puits positifs seront dégagés. Cette information sera utilisée dans l’une des deux formules décrites pour calculer votre titre viral final. Lorsque le titre obtenu avec chaque méthode a été comparé, il a montré que dans la monocytochimie, la coloration pouvait dans certains cas détecter des puits positifs supplémentaires par rapport au violet cristallin, et que de même, les deux méthodes de coloration pouvaient détecter plus de puits positifs que l’évaluation visuelle par microscopie.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode précise pour visualiser les titrages viraux à l'aide d'une coloration au violet de crésyl. Il compare cette méthode à la microscopie optique et à la coloration immunocytochimique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Biologie cellulaire
- Techniques de laboratoire
Contexte
- La titration virale est essentielle pour quantifier les stocks viraux.
- La coloration au violet de crésyl fournit une représentation visuelle de la présence virale.
- Les méthodes comparatives incluent la microscopie optique et la coloration immunocytochimique.
- Les techniques adéquates de dilution sont cruciales pour des résultats précis.
Objectif de l'étude
- Produire une titration de stock viral.
- Visualiser la titration à l'aide d'une coloration au violet de crésyl.
- Garantir la précision des méthodes de quantification virale.
Méthodes utilisées
- Ensemencement d'une lignée cellulaire choisie dans une plaque de 96 puits.
- Réalisation de dilutions décimales de la souche virale.
- Vortexage de chaque dilution pour un mélange adéquat.
- Coloration au violet de crésyl après une période d'incubation de sept jours.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des titrages viraux à l'aide de violet de crésyl.
- La comparaison avec d'autres méthodes de coloration a montré une bonne concordance.
- Une quantification précise des stocks viraux a été obtenue.
- Le protocole fournit une méthode fiable pour les études futures.
Conclusions
- La coloration au violet de cristal est une méthode efficace pour visualiser les titrages viraux.
- Le protocole améliore la précision de la quantification virale.
- Des études ultérieures peuvent s'appuyer sur cette méthode pour diverses applications.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La titration virale précise est essentielle pour le criblage antiviral et le développement de vaccins, car une détection incohérente des effets cytopathogènes (CPE) peut compromettre l'identification des candidats prometteurs ainsi que les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin. La coloration au violet de crésyl offre une alternative économique et reproductible à la coloration immunocytochimique, améliorant la standardisation des tests et réduisant la variabilité dans les flux de travail de découverte précoce. Cela renforce la fiabilité prédictive des évaluations de l'efficacité antivirale et permet un criblage fondé sur la TCID50, évolutif et à haut débit, pour les virus induisant des effets cytopathogènes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une quantification objective de l'infectiosité virale, réduisant ainsi la dépendance à la microscopie subjective et soutenant la détection mécanistique des cibles antivirales à faible risque.
- Valeur opérationnelle : Offre une méthode de coloration rapide et peu coûteuse qui augmente le débit et la reproductibilité du test lors de la validation des candidats antiviraux.
Élaboration de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des points terminaux clairs et quantifiables pour les essais de TCID50, améliorant le rapport signal-sur-bruit dans les campagnes de criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Supprime le besoin de réactifs coûteux pour l'immunocytochimie, réduisant le coût par essai et permettant une application plus large sur diverses plateformes de découverte d'antiviraux.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit des mesures reproductibles du titre viral entre les études, soutenant une modélisation fiable de la relation dose-réponse dans les études précliniques d'efficacité.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation inter-laboratoires de la préparation des stocks viraux, réduisant la variabilité entre expériences dans les études préparatoires à l'autorisation de mise en essai clinique (IND).
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte d'antiviraux, depuis la confirmation précoce des composés actifs jusqu'à l'optimisation des candidats, où la titration virale précise permet d'établir des relations structure-activité et d'analyser le profil de résistance.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en fournissant des modèles reproductibles de défi viral pour des études sur le mécanisme d'action.
- Criblage : Fournit des résultats standardisés et quantifiables essentiels à la progression du « hit » au « lead » dans les cascades de criblage antiviral.
- Analyse : Permet le calcul précis des valeurs de TCID50, autorisant une comparaison exacte de la puissance des composés dans différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité entre le criblage antiviral in vitro et les modèles de défi in vivo grâce à une quantification cohérente des stocks viraux.
- Utilisation en entreprise : Représente une capacité évolutible et peu coûteuse, applicable à plusieurs cibles virales et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive de l'efficacité antivirale en réduisant les faux négatifs liés à l'évaluation visuelle des effets cytopathogènes.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité des essais TCID50 grâce à une coloration simplifiée et standardisée.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital dans les programmes antiviraux en réduisant les coûts des essais sans compromettre la qualité des données.
- Impact sur le portefeuille : Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données fiables de titrage viral pour les critères de poursuite ou d'abandon.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation de base en virologie et une technique aseptique pour la manipulation sécuritaire des virus en environnement BSL-2.
- Dépend d'un équipement de laboratoire standard incluant des incubateurs, des centrifugeuses et des lecteurs de plaques pour une quantification facultative.
- Exige un accord entre les équipes sur la durée de coloration et les protocoles de lavage afin d'assurer la reproductibilité interlaboratoire.
- S'applique aux lignées cellulaires adhérentes supportant la formation d'effets cytopathogènes ; une optimisation peut être nécessaire pour les virus non adhérents ou n'induisant pas d'effet cytopathogène.
- Limité aux virus induisant un effet cytopathogène détectable ; n'est pas adapté aux modèles d'infection non cytopathogènes ou persistants sans modification.
