Name: Détermination de la dépense énergétique basale et de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie chez les souris obèses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Découvrez la calorimétrie indirecte pour mesurer la dépense énergétique et la capacité thermogénique des adipocytes chez les souris obèses. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes du métabolisme énergétique.

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ML est financé par le département de médecine de l’UCLA, des subventions pilotes de P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) et P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Toutes les expériences ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Les souris ont reçu leur régime alimentaire et de l’eau ad libitum dans la cage métabolique, logée dans un environnement à température contrôlée (~ 21-22 ou 30 ° C) avec un cycle lumière / obscurité de 12h. Des souris femelles de 8 semaines nourries avec un régime riche en graisses ou un régime chow pendant 8 semaines ont été utilisées pour cette étude.
1. Mesure du taux métabolique basal (BMR)
<ol><li>Mesurez le poids corporel total de la souris à l’aide d’une balance de poids avec une précision de l’ordre de 0,1 g. REMARQUE: Cela doit être fait avant de loger les souris dans des cages métaboliques et après les 2-3 jours de période d’acclimatation aux cages métaboliques.</li>
	<li>Mesurer la composition corporelle, y compris la masse grasse et maigre chez les souris non anesthésiées, à l’aide d’un système d’analyse de la composition corporelle approprié (voir tableau des matériaux). REMARQUE: Ces mesures sont nécessaires pour déterminer la dépense énergétique et sont exécutées parallèlement aux mesures du poids corporel total (étape 1.1).</li>
	<li>Installez les cages métaboliques et commencez la période d’acclimatation. REMARQUE: Le système de cages métaboliques comprend un boîtier qui permet à l’utilisateur de contrôler la température et la lumière du boîtier de 12 cages (Figure 1A, B). Chaque cage est munie d’une bouteille d’eau, d’une mangeoire et d’une grille (Figure 1C). La grille sépare la souris du fond de la cage, ce qui permet la collecte des matières fécales. Une fois la cage installée sur chaque espace prédéterminé, un couvercle qui scelle la cage comprend la fente de la bouteille d’eau, l’air d’échantillonnage du tube, le système de circulation d’air et le capteur d’activité physique (Figure 1D).<ol>
<li>Allumez le boîtier de température, le système de circulation d’air et l’ordinateur 2 h avant de commencer le test.</li>
		<li>Après 2 h, ouvrez le logiciel contrôlant le boîtier (voir Tableau des matériaux) et le flux d’air et laissez le logiciel tester la communication de l’ordinateur avec l’équipement. NOTE: Le logiciel Oxymax a été utilisé pour le présent travail.</li>
		<li>Une fois la communication établie, cliquez sur Fichier, puis sur Ouvrir la configuration de l’expérience (Figure 2A) et sélectionnez la configuration de l’expérience prédéfinie par le fournisseur (ou configurée à partir d’un test précédent).</li>
		<li>Cliquez sur Expérience, puis sur Propriétés, ce qui ouvrira la fenêtre Propriétés de l’expérience (Figure 2B).</li>
		<li>Dans la fenêtre Propriétés, configurez les paramètres de l’enceinte environnementale, y compris la température ambiante (21 °C) et les cycles de lumière de 12 h. REMARQUE: Garder le logiciel ouvert et en cours d’exécution permet à l’air de circuler dans les cages et le boîtier pour maintenir les cycles de température et de lumière sélectionnés. Ainsi, l’ensemble du système peut fonctionner avec des souris à l’intérieur des cages pendant plusieurs jours, même sans mesurer l’oxygène et le CO2.
</li>
		<li>Cliquez sur Expérience, puis sur Configuration, et la fenêtre Configuration de l’expérience s’ouvrira, où les paramètres de chaque cage métabolique sont définis.</li>
		<li>Attribuez chaque ID de souris à la cage individuelle où la souris est logée (Figure 2C).</li>
		<li>Inclure la masse maigre ou le poids corporel total pour chaque souris uniquement si aucune différence de poids corporel n’est observée entre les groupes. REMARQUE: L’obtention des valeurs brutes de consommation d’oxygène et de dépense énergétique facilite les analyses ANCOVA.</li>
		<li>Réglez le débit d’air sur la cage métabolique à 0,5-0,6 L / min.</li>
		<li>Dans la fenêtre Installation de l’expérience, sélectionnez le chemin d’enregistrement et le nom du fichier. Sélectionnez le répertoire de sauvegarde (Figure 2D).</li>
		<li>Ajoutez une quantité prépondérée de nourriture aux mangeoires qui couvre au moins l’apport alimentaire pendant 1 jour. REMARQUE: Si les cages ont des balances intégrées, la nourriture peut être ajoutée directement et le logiciel l’enregistrera.</li>
		<li>Ajouter les bouteilles d’eau. Vérifiez que la bouteille est correctement scellée et ne fuit pas.</li>
		<li>24 h après avoir ajouté la nourriture, peser la nourriture qui reste sur la cage. REMARQUE: Les grammes d’aliments ajoutés moins les grammes de nourriture restants mesureront l’apport alimentaire.</li>
		<li>Commencez les mesures d’oxygène, de CO2 et d’activité (étape 1.4.10) une fois que les valeurs d’apport alimentaire sont les mêmes que celles des souris logées dans des cages ordinaires. REMARQUE: Ici, la période d’acclimatation (généralement 2-3 jours) est terminée et les mesures de la dépense énergétique peuvent commencer.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesures indirectes de la calorimétrie et de l’activité pour évaluer la dépense énergétique<ol>
<li>Mesurez le poids corporel, la graisse et la masse maigre de toutes les souris avant de commencer les mesures. REMARQUE: Ce sont les valeurs de poids corporel et de masse maigre utilisées pour effectuer des analyses ANCOVA.</li>
		<li>Calibrer le détecteur à base d’O2 et de CO2 zircone du système CLAMS (voir tableau des matériaux) avec la concentration d’oxygène recommandée; toujours recalibrer le détecteur avant de commencer une nouvelle expérience.</li>
		<li>Utilisez un gaz d’étalonnage de composition connue (20,50 % d’oxygène et 0,50 % de CO2). REMARQUE: Les fournisseurs de gaz se réfèrent souvent à ce gaz comme « primary standard grade ».</li>
		<li>Allumez et assurez-vous que la pression de sortie du réservoir est de 5 à 10 psi.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel Calibration Utility pour étalonner et tester les capteurs de gaz (Figure 2E). Cliquez sur Expérimenter, puis sur Calibrer.</li>
		<li>Appuyez sur Démarrer. Ensuite, attendez que les capteurs soient testés et que le logiciel demande à l’utilisateur de tourner les boutons du capteur de gaz (Figure 2F) jusqu’à ce que la valeur de l’identité O2 soit 1 (Figure 2G-H). Cliquez sur Suivant lorsque l’étape est terminée. REMARQUE: Si l’utilitaire d’étalonnage effectue toutes les étapes en cours, l’étalonnage passera automatiquement à l’étape suivante lorsque la barre de progression est remplie.</li>
		<li>Vérifiez les résultats de l’étalonnage lorsque toutes les étapes ont été effectuées et que les résultats sont présentés.</li>
		<li>Éteignez le gaz d’étalonnage.</li>
		<li>Changez de nourriture et ajoutez suffisamment de nourriture pour une période de 48 à 72 heures. REMARQUE: Bien que des cages puissent être ouvertes pendant les mesures de la dépense énergétique pour surveiller le poids corporel et changer la nourriture quotidiennement, les souris peuvent être stressées par ces manipulations et les mesures sont perdues lorsque les cages sont ouvertes. Ainsi, il est recommandé d’éviter toute manipulation pendant la période de mesure.</li>
		<li>Dans le logiciel, cliquez sur Expérimenter , puis sur Exécuter pour démarrer les mesures d’oxygène, de CO2 et d’activité (Figure 3A). REMARQUE: L’exécution des mesures peut être suivie en temps réel dans une boîte située en bas à gauche du logiciel (rectangle rouge, Figure 3B). Le rectangle rouge de la figure 3B montre que le système mesure la cage #1 à l’intervalle #3, à savoir la 3ème mesure. Une mesure dans une cage peut prendre environ 1 min. Ainsi, avec 12 cages connectées, la consommation d’oxygène peut être mesurée environ toutes les 12 minutes. Des mesures continues pendant au moins 48 h sont recommandées.</li>
		<li>Arrêtez l’expérience en cliquant sur Expérience , puis sur Arrêter (Figure 3C).</li>
		<li>Ouvrez les cages, pesez les souris et la nourriture. Recueillir les matières fécales pour calculer le nombre de calories et de lipides excrétés au cours de la période de mesure de 48 à 72 heures. REMARQUE: Les matières fécales peuvent être stockées à -20 °C pour des analyses ultérieures. Ces cages ne peuvent pas être utilisées efficacement pour recueillir l’urine.</li>
		<li>Cliquez sur Expériences, puis sur Exporter et Exporter tous les sujets sous forme de fichier CSV (Figure 3D). NOTE: Pour faciliter les analyses ANCOVA, il est essentiel d’exporter les valeurs de consommation brute d’oxygène (VO2) et de production de CO2 (VCO2) sans être normalisées par le poids corporel.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données et contrôle de la qualité<ol>
<li>Dans la feuille CSV exportée (Figure 3D) (à partir de l’étape 1.4.13), utilisez les valeurs brutes de la consommation d’oxygène (VO2) et de la production de CO2 (VCO2) mesurées toutes les 12 minutes au cours de la période de 2 à 3 jours qui sont automatiquement répertoriées par le logiciel et incluent un horodatage, à savoir l’heure et la date à laquelle elles ont été mesurées. REMARQUE: Les valeurs vo2 et VCO2 seront automatiquement corrigées si des valeurs de poids corporel ou de masse maigre sont ajoutées.</li>
		<li>Dans la feuille CSV exportée, utilisez les valeurs brutes du rapport d’échange respiratoire (RER: VCO2/VO2) qui sont automatiquement calculées et répertoriées par le logiciel en fonction de leur horodatage. REMARQUE: Des valeurs proches de 1 montrent que la souris oxyde principalement les glucides, tandis que des valeurs plus proches de 0,7 représentent que la souris oxyde principalement les graisses. Un TR supérieur à 1 peut survenir pendant l’exercice anaérobie, car le corps expulse plus de CO2 pour compenser l’acidose causée par le lactate. Un RER supérieur à 1 peut indiquer un stress. Le fichier CSV exporté contient également les valeurs brutes de la dépense énergétique (EE) ou de la production de chaleur en calories par minute et par souris, mesurées toutes les 12 minutes dans les 2-3 jours. Ici, toutes les valeurs répertoriées incluent un horodatage.</li>
		<li>Comme des valeurs EE uniques par souris sont nécessaires pour un ANCOVA, faites la moyenne des valeurs EE enregistrées entre 09h00 et 16h00 pour la phase légère (jour) et 19h00-04h00 pour la phase sombre (nuit) par souris et par jour. REMARQUE: Cela peut être fait manuellement à l’aide d’Excel ou de Graph Pad. La sélection de ces fenêtres à deux temps évite de faire la moyenne des valeurs EE intermédiaires, progressives et instables associées à la transition de phase clair-foncé.</li>
		<li>Pendant une période de 48 heures, calculez la moyenne des deux valeurs de lumière du jour et des deux valeurs de phase sombre par souris à l’aide d’Excel ou du Pavé graphique.</li>
		<li>Pour quantifier l’activité physique totale, utilisez Excel ou Graph Pad pour additionner les nombres de ruptures de faisceau x, y et z mesurés dans les cages métaboliques et répertoriés dans le fichier CSV pour chaque souris. REMARQUE: L’activité totale x, y, z est calculée en faisant d’abord la valeur moyenne de chaque X, Y, Z par souris et par cycle. Ensuite, la somme de chaque valeur moyenne X, Y, Z par souris et par cycle est déterminée pour tracer les données comme dans la figure 5E (soit la moyenne de 2 jours).</li>
		<li>Vous pouvez également représenter les données montrant chaque valeur de mesure au fil du temps, ce qui génère des courbes qui illustrent les changements dans l’EE pendant la transition des cycles de lumière à sombre. REMARQUE : Veuillez vous référer à la section de discussion sur comment et quand effectuer des analyses ANCOVA, et les différentes formules utilisées pour calculer la VO2, le VCO2 et l’EE sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mesure de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie
<ol><li>Configurez les mesures et les traitements de la souris. Voir l’étape 1 pour plus de détails sur les préparations expérimentales pour surveiller la consommation d’oxygène, car la capacité thermogénique des adipocytes est déterminée indirectement par la consommation d’oxygène en suivant les étapes 2.1.1-2.2.2. REMARQUE: Ce protocole nécessite une anesthésie chez la souris et un traitement aigu avec l’agoniste du récepteur bêta-3 CL-316,243 (voir le tableau des matériaux), ce qui donne une évaluation rapide de la capacité thermogénique BA.<ol>
<li>Effectuez une analyse de la composition corporelle et pesez les souris. Allumez le CLAMS, réglez la température à 30 °C (thermoneutralité) et attendez 2 h que l’ensemble du système se réchauffe.</li>
		<li>Configurez le reste des conditions d’essai, y compris la lumière, attribuez un ID de souris à chaque cage et ajoutez la valeur de poids corporel de chaque souris dans la cage correspondante si aucune différence de poids corporel n’est observée entre les groupes.</li>
		<li>Étalonner le détecteur d’oxygène/CO2 comme aux étapes 1.4.2-1.4.7.</li>
		<li>Démarrez l’expérience dans le logiciel.</li>
		<li>Injecter à chaque souris du pentobarbital (60-120 mg/kg) et placer chaque souris dans la cage métabolique qui lui a été assignée (étape 2.1.2). REMARQUE: La dose de pentobarbital nécessaire pour maintenir les souris endormies à la thermoneutralité (30 ° C) varie en fonction de la souche et du génotype de la souris. Il est recommandé de tester différentes doses de pentobarbital de 50 à 120 mg/kg et de choisir celle qui maintient la souris anesthésiée pendant 2-3 h à 30 °C. Une anesthésie efficace est essentielle pour éliminer la contribution de l’activité physique à la dépense énergétique.</li>
		<li>Pour assurer l’anesthésie, observez les souris après l’injection de pentobarbital jusqu’à ce qu’elles soient complètement endormies et que leur consommation d’oxygène diminue régulièrement.</li>
		<li>Attendez d’obtenir au moins 3 taux de consommation d’oxygène consécutifs stables avant d’injecter CL-316,243. REMARQUE: En attendant la stabilisation de la consommation d’oxygène, préparez les seringues avec CL-316,243 pour chaque souris (1 mg / kg).</li>
		<li>Ouvrez la cage #1 et injectez CL-316,243 par voie sous-cutanée immédiatement après qu’une mesure de VO2 et de VCO2 ait eu lieu dans la cage #1. Remettez la souris dans la cage #1 immédiatement après l’injection. REMARQUE: Les mesures sont indiquées en temps réel dans la section inférieure gauche du logiciel (Figure 3B, rectangle rouge).</li>
		<li>Attendez que la cage #2 soit mesurée (Figure 3B, rectangle rouge), puis procédez comme à l’étape 2.1.8 pour la cage #2. REMARQUE: L’injection de CL-316,243 immédiatement après une mesure permet de maintenir la constante de temps entre les injections. Par exemple, s’il y a 12 souris / cages en cours d’exécution, avec des mesures collectées dans des cages individuelles séquentiellement et la collecte d’une durée de 55 s par cage, vous devez injecter une souris toutes les minutes. Avec ces taux d’injection, la première mesure aura lieu après 12 minutes après l’injection dans les 12 cages.</li>
		<li>Continuez les mesures de dépense énergétique jusqu’à ce que les valeurs de dépense énergétique plafonnent pendant 5 à 6 mesures consécutives, généralement 90 à 180 minutes après l’injection. REMARQUE: Les souris pourraient se réveiller de l’anesthésie pendant les expériences. Ces souris doivent être retirées de l’analyse. Par conséquent, tester les doses de pentobarbital à l’avance augmentera l’efficacité des études.</li>
		<li>Arrêtez les mesures de dépense énergétique, mais gardez les souris dans leur cage à 30 ° C, jusqu’à ce qu’elles se réveillent.</li>
		<li>Une fois que les souris sont complètement éveillées, inspectez la santé des souris et retournez-les dans leurs cages initiales.</li>
		<li>Exportez les données de chaque souris sous forme de fichier CSV à l’aide du logiciel de l’équipement, comme décrit dans la section 1.4.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données REMARQUE: L’analyse des données a été effectuée par Excel ou Graphpad<ol>
<li>Tracez les 3 à 5 valeurs consécutives de VO2, VCO2 et EE qui sont stables et constantes dans le temps, car ce sont les valeurs représentant le taux métabolique lorsque les souris sont complètement anesthésiées.</li>
		<li>Ensuite, tracez la première et les suivantes mesures consécutives de VO2, VCO2 et EE obtenues après injection. REMARQUE: Les valeurs absolues d’EE et l’augmentation du pli de l’EE induite par injection indiquent une fonction thermogénique BA7.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+energy+expenditure%3A+advances+in+organ-tissue+prediction+models%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models.</a> Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).</li>
<li>Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+tissue%2Forgan+energy+expenditure+to+metabolic+fluxes+in+mouse+and+human%3A+experimental+data+integrated+with+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling.</a> Physiological Reports. 2 (9), 12159(2014).</li>
<li>Tschop, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+analysis+of+mouse+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A guide to analysis of mouse energy metabolism.</a> Nature. 9 (1), 57-63 (2011).</li>
<li>Mina, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalR%3A+A+Web-Based+Analysis+Tool+for+Indirect+Calorimetry+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments.</a> Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).</li>
<li>Shum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCB10+exports+mitochondrial+biliverdin%2C+driving+metabolic+maladaptation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity.</a> Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).</li>
<li>Assali, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCLX+prevents+cell+death+during+adrenergic+activation+of+the+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue.</a> Nature Communication. 11 (1), 3347(2020).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).</li>
<li>Schena, G., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+You+Always+Wanted+to+Know+about+beta3-AR+%2A+%28%2A+But+were+afraid+to+ask%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask).</a> Cells. 8 (4), 357(2019).</li>
<li>Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+contributes+to+UCP1-independent+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).</li>
<li>Szentirmai, E., Kapas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+brown+adipose+tissue+in+beta3-adrenergic+receptor+activation-induced+sleep%2C+metabolic+and+feeding+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 958(2017).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts à ce document de protocole. M.L. est co-fondateur et consultant pour Enspire Bio LLC.

La calorimétrie indirecte est utilisée depuis des années pour évaluer la dépense énergétique de l’ensemble du corps4. Ce protocole décrit ici fournit une méthode simple pour mesurer le taux métabolique de base et déterminer la capacité thermogénique BA in vivo à l’aide de cages métaboliques.
La méthode de calorimétrie indirecte décrite ici confirme que la division des valeurs de dépense énergétique par les valeurs de poids corporel peut être trompeuse. Par exem...

Le métabolisme peut être défini comme l’intégration des réactions biochimiques responsables de l’absorption, du stockage, de la transformation et de la dégradation des nutriments que les cellules utilisent pour se développer et remplir leurs fonctions. Les réactions métaboliques transforment l’énergie contenue dans les nutriments en une forme qui peut être utilisée par les cellules pour synthétiser de nouvelles molécules et exécuter des travaux. Ces réactions biochimiques sont intrinsèquement inefficaces pour transformer cette énergie en une forme utilisable pour soutenir la vie1. Une telle inefficacité entraîne une dissipation d’énergie sous forme de chaleur, cette production de chaleur étant utilisée pour quantifier le taux métabolique standard (TMS) d’un organisme1. La condition standard était classiquement définie comme la production de chaleur se produisant chez un adulte éveillé mais au repos, n’ingérant ni digérant les aliments, à la thermoneutralité et sans stress1. Le taux métabolique basal (BMR) ou dépense énergétique basale chez la souris est appelé SMR, mais chez les individus qui ingèrent et digèrent des aliments sous un léger stress thermique (températures ambiantes de 21 à 22 ° C)1. Les défis et les difficultés de la mesure directe de la production de chaleur ont fait de la calorimétrie indirecte, à savoir le calcul de la production de chaleur à partir de mesures de consommation d’oxygène, l’approche la plus populaire pour déterminer le BMR. Le calcul du BMR à partir de la consommation d’oxygène est possible car l’oxydation des nutriments par les mitochondries pour synthétiser l’ATP est responsable de 72% de l’oxygène total consommé dans un organisme, 8% de la consommation totale d’oxygène se produisant également dans les mitochondries mais sans générer d’ATP (respiration non couplée)1. La majorité des 20 % restants de l’oxygène consommé peut être attribuée à l’oxydation des nutriments dans d’autres emplacements subcellulaires (oxydation des acides gras peroxysomaux), aux processus anabolisants et à la formation d’espèces réactives de l’oxygène1. Ainsi, en 1907, Lusk a établi une équation, basée sur des mesures empiriques, largement utilisée pour transformer la consommation d’oxygène et la production de CO2 en dissipation d’énergie sous forme de chaleur. Chez l’homme, le cerveau représente environ 25% du BMR, le système musculo-squelettique environ 18,4%, le foie environ 20%, le cœur environ 10% et le tissu adipeux environ 3 à 7%2. Chez la souris, la contribution tissulaire à la BMR est légèrement différente, le cerveau représentant ~6,5%, le muscle squelettique ~13%, le foie ~52%, le cœur ~3,7% et le tissu adipeux ~5%3.
Remarquablement, les réactions biochimiques définissant le BMR ne sont pas fixes et changent en réponse à différents besoins, tels que le travail externe (activité physique), le développement (croissance des tissus), les stress internes (contre-infections, blessures, renouvellement tissulaire) et les changements de température ambiante (défense contre le froid)1. Certains organismes recrutent activement des processus pour générer de la chaleur lors de l’exposition au froid, ce qui implique que la chaleur produite par le métabolisme n’est pas seulement un sous-produit accidentel. Au lieu de cela, l’évolution a sélectionné des mécanismes de régulation qui pourraient spécifiquement réguler à la hausse la production de chaleur en modifiant le taux de réactions métaboliques1. Ainsi, ces mêmes mesures de consommation d’oxygène peuvent être utilisées pour déterminer la capacité d’un organisme à générer de la chaleur en réponse au froid.
Deux processus majeurs contribuent à la production de chaleur lors de l’exposition au froid. Le premier est le frisson, qui génère de la chaleur en augmentant la phosphorylation oxydative mitochondriale et la glycolyse dans les muscles pour couvrir le travail physique effectué par contraction musculaire involontaire. Par conséquent, l’exposition au froid augmentera la consommation d’oxygène dans les muscles1. La seconde est la thermogenèse non frissonnante, qui se produit par une augmentation de la consommation d’oxygène dans les adipocytes bruns et beiges (BA). La dissipation de l’énergie en chaleur dans BA est médiée par la protéine de découplage mitochondrial 1 (UCP1), qui permet la rentrée des protons dans la matrice mitochondriale, diminuant ainsi le gradient de protons mitochondriaux. La dissipation du gradient de protons mitochondriaux par UCP1 augmente la production de chaleur par l’élévation du transfert d’électrons et de la consommation d’oxygène et l’énergie libérée par la dissipation de protons en soi sans générer d’ATP (découplé). De plus, le BA thermogénique peut recruter des mécanismes supplémentaires qui augmentent la consommation d’oxygène sans provoquer une dissipation importante dans le gradient de protons, en activant des cycles futiles de synthèse et de consommation d’ATP oxydatif. Les cages métaboliques décrites ici, à savoir le système CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, offrent la possibilité de mesurer la dépense énergétique à différentes températures ambiantes. Cependant, pour déterminer la capacité thermogénique BA à l’aide de mesures de la consommation d’oxygène du corps entier, il faut: (1) éliminer la contribution des frissons et d’autres processus métaboliques non BA à la dépense énergétique, et (2) activer spécifiquement l’activité thermogénique BA in vivo. Ainsi, un deuxième protocole décrit comment activer sélectivement le BA in vivo en utilisant la pharmacologie chez des souris anesthésiées à la thermoneutralité (30 °C), l’anesthésie et la thermoneutralité limitant d’autres processus thermogéniques non BA (c.-à-d. l’activité physique). La stratégie pharmacologique pour activer ba consiste à traiter des souris avec l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques CL-316,246. La raison en est que l’exposition au froid favorise une réponse sympathique libérant de la noradrénaline pour activer les récepteurs β-adrénergiques dans BA, qui active uCP1 et l’oxydation des graisses. De plus, l’expression des récepteurs β3-adrénergiques est fortement enrichie dans le tissu adipeux chez la souris.

<table><tbody><tr><td>Système CLAMS-Oxymax</td><td>Columbus Instruments</td><td>CLAMS-center feeder-ENC</td><td>Y compris enceinte environnementale et capteur d’oxygène en zircone</td></tr><tr><td>PC de bureau avec logiciel Oxymax</td><td>HP/Columbus</td><td>N/A</td><td>PC à acheter séparément</td></tr><tr><td>Pichet de séchérite (sulfate de calcium avec indicateur de chlorure de cobalt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-116681</td><td>Nécessaire pour sécher le gaz entrant dans le capteur d’oxygène, l’humidité peut endommager le capteur</td></tr><tr><td>RMN pour la composition corporelle</td><td>Echo-MRI</td><td>Echo-MRI 100</td><td>Mesurez la masse maigre et grasse chez les souris vivantes. Il est nécessaire pour les analyses ANCOVA.</td></tr><tr><td>CL-316-243</td><td>Sigma</td><td>C5976</td><td>Injecté aux souris par voie sous-cutanée pour activer la thermogenèse</td></tr><tr><td>Régime riche en graisses</td><td>Recherche sur les régimes</td><td>D12266B</td><td>Fourni aux souris avant et pendant les mesures</td></tr><tr><td>Pentobarbital/Nembutal</td><td>Pharmacie chez DLAM</td><td>N/A</td><td>Anesthésie pour les souris</td></tr><tr><td>Gaz primaire de qualité standard (réservoir et régulateur)</td><td>Praxair</td><td>NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590</td><td>20,50 % d’oxygène, 0,50 % de CO2 équilibrés avec l’azote utilisé pour l’étalonnage</td></tr></tbody></table>

détermination de la dépense énergétique basale et de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie chez les souris obèses

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Les mesures de la dépense énergétique sont nécessaires pour comprendre comment les changements dans le métabolisme peuvent conduire à l’obésité. La dépense énergétique basale peut être déterminée chez la souris en mesurant la consommation d’oxygène du corps entier, la production de CO2 et l’activité physique à l’aide de cages métaboliques. Les adipocytes thermogéniques bruns/beiges (BA) contribuent de manière significative à la dépense énergétique des rongeurs, en particulier à basse température ambiante. Ici, les mesures de la dépense énergétique basale et de la capacité totale de BA à dépenser de l’énergie chez les souris obèses sont décrites dans deux protocoles détaillés: le premier expliquant comment mettre en place le test pour mesurer la dépense énergétique basale à l’aide de l’analyse de la covariance (ANCOVA), une analyse nécessaire étant donné que la dépense énergétique co-varie avec la masse corporelle. Le deuxième protocole décrit comment mesurer la capacité de dépense énergétique BA in vivo chez la souris. Cette procédure implique une anesthésie, nécessaire pour limiter les dépenses causées par l’activité physique, suivie de l’injection d’agoniste bêta3-adrénergique, CL-316,243, qui active la dépense énergétique en BA. Ces deux protocoles et leurs limites sont décrits de manière suffisamment détaillée pour permettre une première expérience réussie.

La figure 4 montre la VO2, le VCO2, la production de chaleur/dépense énergétique (EE), le rapport d’échange respiratoire (RER) et les valeurs d’activité physique X, Y, Z obtenues à l’aide des cages métaboliques du système CLAMS. Le VO2 et le VCO2 fournis par le système CLAMS sont le volume de gaz (mL) par minute et peuvent déjà être divisés par le poids corporel ou les valeurs de masse maigre en entrant ces valeurs de poids dans le logiciel CLAMS a...

Ce manuscrit décrit un protocole pour mesurer le taux métabolique basal et la capacité oxydative des adipocytes thermogéniques chez les souris obèses.

Détermination de la dépense énergétique basale et de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie chez les souris obèses

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Ce protocole permet à un chercheur de déterminer s’il existe des différences dans l’équilibre énergétique des souris, ce qui peut aider à identifier les processus physiologiques responsables d’un changement de poids corporel. Il peut également être utilisé pour déterminer la capacité de la graisse brune à dépenser de l’énergie. Cette technique quantifie l’oxygène consommé et le CO2 produit par une souris individuelle dans un environnement contrôlé.Il permet aux utilisateurs de calculer la dépense énergétique de cette souris individuelle et de déterminer si différents traitements ou manipulations génétiques peuvent modifier la dépense énergétique. Pour commencer, ouvrez le logiciel contrôlant le boîtier et le flux d’air et laissez le logiciel tester la communication de l’ordinateur avec l’équipement. Une fois la communication établie, cliquez sur fichier, puis ouvrez la configuration de l’expérience et sélectionnez la configuration de l’expérience préconçue par le fournisseur ou configurée à partir d’un test précédent.Ensuite, cliquez sur expérience, puis cliquez sur propriétés pour ouvrir la fenêtre des propriétés de l’expérience. Dans la fenêtre des propriétés, configurez les paramètres de l’enceinte environnementale, y compris la température ambiante et les cycles de lumière de 12 heures. Cliquez ensuite sur expérience, puis sur configuration pour ouvrir la fenêtre de configuration de l’expérience où les paramètres de chaque cage métabolique sont définis.Ensuite, ajoutez une quantité pré-pesée de nourriture aux mangeoires dans les cages métaboliques abritant des souris femelles de huit semaines. Placez également les bouteilles d’eau et vérifiez que les bouteilles sont correctement scellées et ne fuient pas. Après 24 heures, pesez la nourriture restante dans les cages et pesez les souris.Deux à trois jours après que les souris ont été logées dans le système, commencez la calorimétrie indirecte et les mesures d’activité. Tout d’abord, calibrer le détecteur à base d’oxygène et de dioxyde de carbone à base de zircone des systèmes CLAMS à l’aide d’un gaz d’étalonnage de composition connue. Après avoir allumé et vérifié que la pression de sortie du réservoir est comprise entre 5 et 10 livres par pouce carré, ouvrez le logiciel utilitaire d’étalonnage pour calibrer et tester les capteurs de gaz.Cliquez sur expérimenter, puis calibrez et appuyez sur Démarrer. Attendez que les capteurs soient testés et que le logiciel demande à l’utilisateur de tourner les boutons du capteur de gaz jusqu’à ce que la valeur de l’identité de l’oxygène soit un. Cliquez sur Suivant lorsque l’étape est terminée.Après avoir mesuré le poids corporel et la composition des souris, commencez les mesures d’oxygène, de dioxyde de carbone et d’activité en cliquant sur l’expérience et exécutez. Après un minimum de 48 heures, arrêtez l’expérience en cliquant sur expérience, puis arrêtez. Pour exporter les données, cliquez sur fichier, puis exportez et exportez tous les sujets sous forme de fichier CSV.Pendant la phase sombre, les souris ont une consommation d’oxygène et une production de dioxyde de carbone plus élevées, et ont donc une dépense énergétique plus élevée. Les souris suivant un régime alimentaire régulier et un état nourri avec une ingestion de nourriture survenant dans le cycle sombre sont caractérisées par des valeurs de rapport d’échange respiratoire proches de un, indiquant une préférence pour l’utilisation de glucides. Pendant le cycle de lumière, lorsque les souris dorment principalement et donc rapidement, il y a un passage à l’oxydation des graisses avec des valeurs DE RER plus proches de 0,7.En conséquence, l’activité physique mesurée lorsque le nombre de ruptures de faisceau laser XYZ augmente pendant la phase sombre et diminue pendant la phase lumineuse. L’alimentation riche en graisses augmente le poids corporel et la masse grasse sans modifier la masse maigre. Les souris nourries avec un régime riche en graisses mangeaient plus de kilocalories par jour, principalement en raison d’une densité calorique plus élevée par gramme de nourriture.Cependant, l’activité physique est similaire entre le chow et les souris nourries avec un régime riche en graisses, même pendant la période sombre. Les valeurs du coefficient respiratoire inférieur des souris nourries avec un régime riche en graisses indiquent une préférence pour l’utilisation de la graisse comme substrat primaire pour l’oxydation. La consommation d’oxygène, mais pas la production de dioxyde de carbone, augmente chez les souris nourries avec un régime riche en graisses, ce qui entraîne une augmentation significative de la dépense énergétique par souris.La dépense énergétique est augmentée par une injection d’agoniste bêta-3, principalement à la suite de l’activation adrénergique des adipocytes thermogéniques, ce qui augmente la consommation d’oxygène, la production de dioxyde de carbone et donc la dépense énergétique elle-même. Pour mesurer la dépense énergétique avec le CLAMS, l’étalonnage doit être effectué et le poids corporel doit être mesuré pour effectuer l’analyse ANCOVA. En outre, l’apport alimentaire doit être mesuré à la fois pendant la période d’adaptation et pendant les mesures.La période d’adaptation est terminée lorsque les souris récupèrent l’apport alimentaire initial et le poids corporel. Cette procédure peut également être utilisée pour tester les effets aigus des médicaments sur l’activité et le comportement de la souris. Nous utilisons également ce système dans une étude collaborative qui a démontré quelle population de neurones contrôlait Cette technique est essentielle pour étudier les maladies liées à la prise de poids et pour identifier les processus contrôlant la préférence nutritionnelle ainsi que l’activité physique, la thermogenèse et l’équilibre énergétique.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Une méthode d'imagerie fonctionnelle du tissu adipeux brun de la souris (BAT) est décrit dans lequel froide stimulée par l'absorption de 18F-fluorodésoxyglucose (FDG) dans la MTD est non-invasive évaluée avec un protocole standardisé micro-PET/CT. Cette méthode est robuste et sensible pour détecter des différences dans les activités de BAT dans des modèles murins.

Imagerie fonctionnelle de la graisse brune chez les souris avec FDG micro-PET/CT

La méthode présentée ici utilise 18 F-fluorodésoxyglucose (18 F-FDG) par émission de positons / tomodensitométrie (TEP-TDM) et l'imagerie graisse eau séparée résonance magnétique (IRM), chaque numérisé suivante 2 exposition h à thermoneutre (24 ° C ) et froid (17 ° C) dans le but de cartographier le tissu adipeux brun (BAT) chez des sujets humains adultes.

Dépôts de tissus humains adipeux brun segmentés automatiquement par tomographie par émission de positons / informatisée et la résonance magnétique images enregistrées

Ce protocole décrit la méthode de détermination de la lipolyse basale et stimulée par la forskoline dans des tampons de graisse inguinal obtenus à partir d'une alimentation normale (NCD) ou d'un régime alimentaire à forte teneur en graisse (HFD), la capsaicine alimentée avec des souris de type sauvage. En tant qu'indice pour la lipolyse, la libération de glycérol a été mesurée à partir de tampons de graisse adipeuse inguinale.

Mesure de la lipolyse basale et stimulée par Forskolin dans des tampons de graisse adipeuse inguinale

Ce protocole décrit l’utilisation d’un analyseur de composition corporelle et le système de surveillance animale métabolique pour caractériser la composition corporelle et des paramètres métaboliques chez les souris. Un modèle de l’obésité induit par l’alimentation riche en graisses est utilisé à titre d’exemple pour l’application de ces techniques.

Composition corporelle et l’analyse mise en cage métabolique in Mice Fed graisse haute

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Cet article fournit trois tests faciles et accessibles pour évaluer le métabolisme des lipides chez la souris.

Évaluation de la capacité de manipulation des lipides du corps entier chez la souris

Imagerie fonctionnelle et quantification des dépôts adipeux thermogéniques chez la souris à l’aide d’une approche basée sur l’imagerie micro-TEP/IRM.

Visualisation et quantification des tissus adipeux bruns et beiges chez la souris à l’aide de l’imagerie micro-PET/MR [18F]FDG

Nous présentons ici un protocole pour quantifier l’importance physiologique de l’impact de l’activité du tissu adipeux brun (MTD) sur le métabolisme humain. Ceci est réalisé en combinant la charge glucidique et la calorimétrie indirecte avec des mesures des changements supraclaviculaires de température. Cette nouvelle approche peut aider à développer une cible pharmacologique pour la thermogenèse des MTD chez l’homme.

Utilisation d’une combinaison de calorimétrie indirecte, de thermographie infrarouge et de glycémie pour mesurer la thermogenèse du tissu adipeux brun chez l’homme

Nous présentons ici un protocole de mesure de l’activité du tissu adipeux brun après un repas chez l’homme et les animaux de laboratoire.

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Dans ce protocole, les méthodes pertinentes pour la métabolomique artérioveineuse optimisée pour les MTD utilisant la GC-MS dans un modèle murin sont décrites. Ces méthodes permettent d’acquérir des informations précieuses sur l’échange de métabolites médié par les MTD au niveau de l’organisme.

Métabolomique artérioveineuse pour mesurer l’échange de métabolites in vivo dans le tissu adipeux brun

Nous présentons ici un protocole de transplantation de tissu adipeux blanc et brun qui offre une stratégie prometteuse pour inverser l’hypofertilité, l’obésité et l’hyperglycémie, tout en améliorant la fonction rénale chez les souris BTBR diabétiques et obèses.

Greffes adipeuses blanches et brunes : une approche pour corriger les déficits reproductifs, métaboliques et rénaux chez les souris obèses obèses noires et bronzées (BTBR)

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Détermination de la dépense énergétique basale et de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie chez les souris obèses

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