Name: In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie haute résolution pour étudier la croissance axonale et la dynamique des cônes de croissance dans des tranches cérébrales embryonnaires de souris ex vivo. Ce protocole permet d'analyser les mécanismes neuronaux in situ.

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Nous tenons à remercier Maria Eugenia Bernis d’avoir photographié les procédures. Nous remercions également Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski et Sina Stern d’avoir lu et discuté du manuscrit. Nous sommes reconnaissants à nos assistants techniques exceptionnels, Jessica Gonyer, Blanca Randel et Anh-Tuan Pham. Nous reconnaissons le soutien précieux de l’installation de microscope optique et de l’installation pour animaux de la DZNE. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), la Fondation internationale pour la recherche sur la paraplégie (IRP) et Wings for Life (à F.B). F.B. est membre du pôle d’excellence ImmunoSensation2, des SFB 1089 et 1158, et est récipiendaire du prix Roger De Spoelberch.

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<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
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<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
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<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
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<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La façon dont les cônes de croissance détectent et réagissent à leur environnement environnant pour coordonner l’extension et le guidage simultanés des axones est encore un sujet de débat 3,18. Des études pionnières sur des substrats 2D ont donné un aperçu des mécanismes moléculaires fondamentaux générant les forces qui stimulent la dynamique des cônes de croissance pendant la formation des axones, l’excroissance et la navigation 2,10,11,12,19. Plus récemment, des études dans des matrices 3D ont révélé l’influence d’une troisième dimension sur le comportement du cône de croissance et par conséquent sur la croissance desaxones 8,9. Néanmoins, les mécanismes complexes instruisant la dynamique des cônes de croissance in vivo restent à examiner en profondeur.
La préparation de cultures de tranches organotypiques à partir de cerveaux IUE ou EUE est largement utilisée et bien documentée. C’est devenu une norme d’or permettant aux scientifiques d’acquérir des connaissances sur le développement et le comportement des neurones dans le tissu cérébral vivant20,21. En effet, cette technique a été utilisée avec succès en combinaison avec diverses techniques d’imagerie à haute résolution pour visualiser des processus moléculaires spécifiques et des événements morphologiques in situ. Ces études incluent, sans toutefois s’y limiter, la formation et l’extension des axones19,22, la migration neuronale corticale 19,22,23,24, la dynamique des centrosomes 25,26, la dynamique des microtubules27, ainsi que la dynamique fonctionnelle des compartiments pré-et postsynaptiques 28,29.
Ce protocole comble une lacune dans la neurobiologie expérimentale, en visualisant la dynamique des cônes de croissance des neurones corticaux en développement in situ, dans les cultures de tranches cérébrales aiguës ex vivo , et les outils pour analyser les données obtenues.
Des cultures de tranches cérébrales aiguës ont été utilisées pour établir ce protocole parce qu’elles (1) avec un peu de pratique, sont faciles à générer; (2) présenter un système accessible pour étudier les cônes de croissance intégrés dans un environnement quasi entièrement physiologique, mais suffisamment transparent pour permettre l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution; (3) peut être élargi pour son utilisation avec une myriade de lignées de souris transgéniques; (4) combinés à l’IUE ou à l’EUE, offrent un potentiel pratiquement illimité pour fournir des outils moléculaires permettant d’évaluer les performances des cônes de croissance et des axones in vivo sous des régimes de perte/gain de fonction, ainsi que des rapporteurs fluorescents et des sondes de cytosquelette.
Cette méthodologie a été décrite dans le contexte de l’EUE et de l’IUE. Bien qu’il s’agisse toujours d’une méthode très fiable, l’EUE a entraîné une augmentation de l’incidence des tranches de cerveau montrant un réseau RG désorganisé par rapport à celles obtenues avec l’IUE comme méthode d’administration (Figure 4C). Les perturbations dans le réseau RG affectent fortement la migration neuronale et le modèle d’allongement axonal30,31. Ce sont des paramètres clés qui prédisent où trouver des axones à analyser à un moment donné et le type d’environnement dans lequel ils naviguent. Les tranches de cerveau avec un réseau RG significativement perturbé ont généralement une stratification altérée des neurones corticaux. Ceci, à son tour, produit des axones avec des trajectoires chaotiques. Par conséquent, il est fortement recommandé de contrôler l’intégrité structurelle du réseau RG. Fait intéressant, une mauvaise intégrité structurelle est en corrélation avec l’augmentation de l’âge du cerveau embryonnaire. En effet, de tels effets chez les embryons E12.5-E13.5 plus jeunes n’ont généralement pas été observés19.
Le présent protocole est complet et simple. Néanmoins, il y a quelques étapes critiques où un soin et une attention particuliers doivent être pris pour obtenir des résultats optimaux. Ceux-ci ont été expressément notés dans le protocole et comprennent (1) l’ajustement de la quantité d’ADN utilisée dans l’électroporation pour obtenir un marquage clairsemé; (2) éviter les dommages lors de l’extraction des cerveaux; (3) contrôler la température de l’agarose pendant le tubage du cerveau; (4) dépannage du pourcentage idéal d’agarose pour les cerveaux d’un âge donné; et (5) la sélection des fluorophores, dont l’expérience suit. Au cours de l’optimisation du protocole, les performances de plusieurs fluorophores en imagerie in situ à cellules vivantes ont été testées. Les variantes monomères de GFP EGFP et NeonGreen pour la préparation des plasmides marqués LifeAct et Lyn ont été choisies pour ce protocole (Figure 5A,B). De plus, la variante d’appel d’offres mScarlet a été testée et jugée très appropriée pour cette configuration (données non présentées). Le tRFP multimérique (dimère) et le ZsGreen (tétramère) (figure 5C et vidéo supplémentaire 1, à droite) ont également été testés. Ces fluorophores ultra-brillants à pliage rapide sont recommandés lorsque la méthode nécessite une génération rapide de signaux fluorescents après la livraison de l’ADN.
Une pratique courante dans l’utilisation de cultures en tranches consiste à utiliser des tranches de différents cerveaux pour tester le contrôle et les conditions expérimentales. Cela représente une source inhérente de variabilité indésirable. Ici, un système d’expression qui permet une modification indépendante des neurones voisins et de l’expression des rapporteurs pour l’identification a été utilisé. Notez que dans cette démonstration (Figure 5C), il n’y avait aucune différence entre les neurones exprimant l’un ou l’autre des fluorophores. Cependant, à titre d’exemple, un tel mélange de plasmides combiné à une lignée de souris transgénique abritant un gène sensible à la Cre marquera avec des neurones tRFP (sensibles à la Dre) qui sont restés de type sauvage. En revanche, le ZsGreen (également sensible à la Cre) marquera les neurones recombinés. Par conséquent, les cônes de croissance des deux génotypes différents, et probablement aussi les phénotypes, pourraient être étudiés côte à côte simultanément dans la même tranche de cerveau.
La localisation des axones et des cônes de croissance pour l’analyse est une considération importante. Les neurones corticaux se polarisent lors de la migration radiale de la zone ventriculaire (VZ) vers la plaque corticale (CP). Au cours de ce processus, les neurones forment un processus principal (une future dendrite) et un processus de suivi qui deviendra l’axone, rejoignant éventuellement les axones pionniers dans la zone intermédiaire (IZ), établissant les voies axonales32. Par conséquent, pour capturer les cônes de croissance axonale, l’imagerie a été effectuée sur les fibres axonales dans l’IZ, y compris les axones sortant de la CP et les axones générés tôt déjà associés aux faisceaux axonal; ou éventuellement, dans des fibres qui traversent l’IZ et s’étendent en dessous (Figure 7).
Ce protocole permet d’effectuer une imagerie à super-résolution des neurones dans des tranches organotypiques. Historiquement, la diffusion de la lumière était un problème important rencontré lors de l’imagerie de spécimens épais. Au cours des deux dernières décennies, les progrès considérables des technologies optiques ont rendu possible l’imagerie de spécimens épais. Ici, un objectif à longue distance de travail a été utilisé pour mieux visualiser les structures plus petites, telles que les cônes de croissance. Inévitablement, ce protocole ne capture pas des événements plus détaillés tels que l’écoulement rétrograde de l’actine ou la dynamique des microtubules. L’objectif à distance de travail à long terme, qui nécessite une ouverture numérique (NA) plus faible, préserve les informations des tranches épaisses. Cependant, il a également été possible d’adapter ce protocole pour l’utiliser avec des objectifs de distance de travail plus courte. Cela nécessitait un transfert en douceur des tranches dans un plat à fond de verre pour préserver l’intégrité structurelle. Cependant, l’utilisation de cette méthode a entraîné une survie plus courte - ~ 15 h - en raison de la perte d’échange de gaz (données non montrées). Contrairement aux cultures 2D, les cônes de croissance en 3D occupent un volume plus important et nécessitent une compensation mouvement-artefact dans l’axe z. Pour augmenter la capacité d’image d’événements détaillés, la technologie confocale moderne doit être utilisée. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser un moteur z-stack à balayage rapide, tel que le z-Galvo disponible sur les microscopes confocaux très sensibles33.
Il convient de noter que ce protocole présente trois limites principales. Premièrement, il est souvent difficile de contrôler les niveaux d’expression / nombre de cellules exprimant un plasmide donné in vivo. Cela introduit une variabilité entre toutes les tranches, même en maintenant la même concentration de plasmides. Par conséquent, le choix des éléments régulateurs dans les vecteurs d’expression utilisés doit être prédéterminé avec soin. Deuxièmement, il n’est actuellement pas possible d’imager des événements détaillés à l’aide d’inserts membranaires. Cette deuxième limite peut être surmontée avec les mises à jour méthodologiques proposées au paragraphe précédent. Enfin, les cônes de croissance sont très photosensibles et peuvent rapidement devenir photoblanchis. Par conséquent, l’imagerie fréquente des cônes de croissance, pendant aussi peu que 5 minutes à l’aide de microscopes à balayage laser, peut souvent faire s’effondrer les cônes de croissance. À cet égard, les nouvelles avancées dans les dispositifs générés par microscopie à feuille de lumière peuvent être adaptées à l’imagerie à long terme des tranches de cerveau34.
Des protocoles similaires sont envisagés pour ouvrir de nouvelles voies de recherche, permettant une meilleure compréhension de ce qu’il faut pour qu’un cône de croissance lise et réagisse à un environnement in vivo complexe, et plus important encore, pour démêler la mécanique de cette interaction sophistiquée.

Les neurones sont des cellules hautement polarisées qui représentent l’unité de calcul de base du système nerveux. Ils reçoivent et émettent des informations qui reposent sur le cloisonnement des sites d’entrée et de sortie : dendrites et axones, respectivement1. Pendant le développement, les axones s’étendent tout en naviguant dans un environnement incroyablement complexe pour atteindre leur destination. La navigation axonale est guidée par le cône de croissance, une structure sensorielle située à l’extrémité de l’axone en développement. Le cône de croissance est responsable de la détection des signaux environnementaux et de leur traduction en réorganisation spatiale dynamique de son cytosquelette 2,3. Les réactions morpho-mécaniques qui en résultent ordonnent au cône de croissance de s’étendre ou de se rétracter du signal de déclenchement, conduisant à des manœuvres axonales spécifiques.
La compréhension actuelle de l’extension des axones et de la dynamique des cônes de croissance découle d’études évaluant la croissance des axones sur des substrats bidimensionnels (2D) 2,4,5,6,7. Ces études pionnières ont identifié une interaction sophistiquée entre les cônes de croissance et les substrats de croissance et ont révélé des différences frappantes en fonction des caractéristiques du substrat telles que l’adhésivité et la rigidité 8,9. Grâce à ces connaissances, des indices environnementaux extracellulaires ont été supposés dicter la croissance des axones, le cytosquelette du cône de croissance exécutant cette croissance 2,10,11,12. Notamment, les neurones peuvent étendre les axones dans des substrats non adhésifs (p. ex. poly-lysine, poly-ornithine)13. De plus, la rigidité du substrat peut influencer le taux de croissance des axones indépendamment des complexesadhésifs cellulaires 8. Par conséquent, l’étude de la dynamique des cônes de croissance dans les substrats 2D ne peut pas à elle seule modéliser avec précision l’équilibre des forces résultant de l’interaction des cônes de croissance axonaux avec des environnements tridimensionnels (3D) physiologiquement pertinents, tels que ceux trouvés in vivo.
Pour surmonter les limites des essais 2D, la croissance des axones et la dynamique des cônes de croissance ont été étudiées dans des matrices 3D 8,9. Ces matrices posent un contexte plus physiologique mais permettent d’étudier les mécanismes cellulaires intrinsèques de la croissance axonale. Il permet l’examen du cône de croissance de manière unicellulaire dans une variété de conditions et de traitements pharmacologiques9. Dans de tels environnements 3D, les axones présentaient une dynamique cytosquelettique distincte et se développaient plus rapidement que ceux observés dans les neurones cultivés en 2D9. Ces études élégantes ont démontré l’influence d’une dimension supplémentaire sur la réorganisation du cytosquelette du cône de croissance et, par conséquent, sur son comportement.
Malgré les avantages apparents présentés par les matrices 3D par rapport aux surfaces 2D pour soutenir le développement neuronal natif et la croissance des axones, elles restent un échafaudage synthétique simplifié qui ne peut pas refléter la complexité de la dynamique observée dans les tissus du système nerveux central (SNC). Ici, l’administration de plasmides rapporteurs par électroporation ex utero et in utero a été combinée à une culture de tranches organotypiques cérébrales et à une imagerie in situ à super-résolution en direct pour analyser la dynamique des cônes de croissance dans un contexte physiologique. Cette méthodologie permet de visualiser les axones en développement tout en expérimentant la 3-dimensionnalité des environnements in vivo et la complexité de sa composition physico-chimique. Enfin, des procédures conviviales pour mesurer la croissance des axones et la dynamique des cônes de croissance à l’aide de logiciels sous licence courante et accessibles au public sont décrites.

<table><tbody><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Chèvre Anti-Souris</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Chèvre Anti-Souris</td></tr><tr><td>Anti-Vimentine</td><td>anticorps sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>Souris monoclonale, clone LN-6, liquide d’ascite</td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Bétadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml ; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ unvirsal électrode extracteur</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir électrique</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed</td></tr><tr><td>modèle Enrofloxacine (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2,5 % (poids/vol)</td></tr><tr><td>Eppendorf pointes de pipette à microchargeur</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Teneur en colorant &ge ; 85 %</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Plat de culture cellulaire</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Montage aqueux moyen</td><td>sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5 %</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplément</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>calcium, magnésium, sans phénol rouge</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Saline isotonique solution</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90 %</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S vibratome</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 avec Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Pot de stockage de micropipettes</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp ; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Insert de culture cellulaire Millicell</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp ; mm, PTFE hydrophile, 0,4&nbsp ; et micro ; m</td></tr><tr><td>Moria Cuillères perforées</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium, moins le rouge de phénol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2 supplement</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Porte-aiguille avec ciseaux</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrodes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxi kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Fermeture reflex Clip</td><td>World Precision Instruments</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>Système d’électroporation à ondes carrées ECM830</td><td>Harvard Appareil</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Gaze stérile</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant stérile pommade oculaire</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux stériles</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 Sutures chirurgicales en soie</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre à paroi mince</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas</td><td>Outils de science fine</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro ;-Slide 8 puits fond en verre</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Au cours du développement neuronal, les axones naviguent dans l’environnement cortical pour atteindre leur destination finale et établir des connexions synaptiques. Les cônes de croissance - les structures sensorielles situées aux extrémités distales des axones en développement - exécutent ce processus. L’étude de la structure et de la dynamique du cône de croissance est cruciale pour comprendre le développement axonal et les interactions avec le système nerveux central (SNC) environnant qui lui permettent de former des circuits neuronaux. Ceci est essentiel lors de la conception de méthodes pour réintégrer les axones dans les circuits neuronaux à la suite d’une blessure dans la recherche fondamentale et les contextes précliniques. Jusqu’à présent, la compréhension générale de la dynamique des cônes de croissance est principalement fondée sur des études de neurones cultivés en deux dimensions (2D). Bien qu’elles soient sans aucun doute fondamentales pour les connaissances actuelles sur la dynamique structurelle des cônes de croissance et la réponse aux stimuli, les études 2D déforment l’environnement physiologique tridimensionnel (3D) rencontré par les cônes de croissance neuronale dans les tissus intacts du SNC. Plus récemment, des gels de collagène ont été utilisés pour surmonter certaines de ces limitations, permettant l’étude du développement neuronal en 3D. Cependant, les environnements synthétiques 2D et 3D manquent d’indices de signalisation dans le tissu du SNC, qui dirigent l’extension et la recherche d’axones en développement. Ce protocole fournit une méthode pour étudier les axones et les cônes de croissance à l’aide de tranches de cerveau organotypiques, où les axones en développement rencontrent des indices physiques et chimiques physiologiquement pertinents. En combinant l’électroporation in utero et ex utero affinée pour fournir des rapporteurs fluorescents à faible résolution avec la microscopie à super-résolution, ce protocole présente un pipeline méthodologique pour la visualisation de la dynamique des axones et des cônes de croissance in situ. En outre, une description détaillée de l’analyse des données d’imagerie à long terme et des cellules vivantes est incluse.

Les résultats représentatifs obtenus avec le flux de travail de la méthode décrite sont affichés. Les souris E15.5 ont été utilisées dans la présente démonstration, bien que ce protocole soit facilement adaptable à pratiquement tous les âges embryonnaires allant de E11 à la fin de E17. Dans ce protocole, soit l’électroporation ex utero (EUE; Figure 2A, 2C-I) ou électroporation in utero (IUE; Figure 2B, C et 2J-Q) ont été utilisés pour délivrer des plasmides dans les neurones progéniteurs tapissant les ventricules latéraux. Ces progéniteurs sont la source des futurs neurones projetés corticaux (CPN)15,16. Des mélanges de plasmides ont été préparés pour conduire une expression spécifique aux neurones clairsemés de Lyn)-mNeonGreen ciblés par la membrane (Figure 1A) ou de LifeAct-enhanced (E)GFP (Figure 1B) pour évaluer le comportement global et la dynamique de l’actine dans les cônes de croissance, respectivement. De plus, un mélange de plasmides visait à marquer des neurones individuels avec une protéine fluorescente verte turbo(t)-RFP ou zoanthus sp. (Zs) (ZsGreen) (Figure 1C) a été inclus. Cela facilite la surveillance du comportement du cône de croissance des neurones voisins indépendants.
La dissection cérébrale à partir d’embryons électroporés est une étape cruciale qui doit être soigneusement effectuée pour obtenir des tranches de haute qualité, préservant la structure cérébrale native. Les instruments de dissection et le vibratome ont été préparés à l’avance et soigneusement stérilisés à l’éthanol (Figure 3A,B). Ensuite, les têtes des embryons électroporés ont été soigneusement disséquées et les cerveaux ont été extraits. Ici, la dissection représentative des cerveaux des embryons soumis à l’EUE à E15 (Figure 3C-F) et E12.5 (Figure 3G-J) est montrée. Les cerveaux sont immédiatement enfermés dans une matrice d’agarose, tranchés et placés sur des inserts de membrane en PTFE dans une boîte en verre de fond pour l’incubation (Figure 3K-M).
L’état de santé des tranches de cerveau est un point important pour le contrôle afin d’assurer des résultats fiables. Une inspection visuelle de toute contamination a été effectuée quotidiennement. De plus, une fois la culture finalisée, les tranches de cerveau sont fixées et soumises à l’immunohistochimie. Ici, le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé pour contrôler l’organisation cellulaire globale et la coloration de la vimentine pour révéler l’organisation gliale; en particulier, l’échafaudage de la glie radiale (RG). En règle générale, les tranches de cerveau cultivées avec succès dérivées de l’IUE ou de l’EUE montrent une distribution cellulaire normale révélée par DAPI et un ensemble quelque peu organisé de RG avec des processus de contact pial orientés vers l’apique17 (Figure 4A, B respectivement). Parfois, des perturbations marquées de l’échafaudage RG dans les tranches de cerveau cultivées sont observées, en particulier dans celles dérivées de l’électroporation EUE (Figure 4C). Les tranches de cerveau avec un échafaudage RG extrêmement désorganisé montrent une migration neuronale altérée et une croissance axonale défectueuse (non montrée). Par conséquent, le contrôle de l’échafaudage RG est une méthode de post-culture facile pour trier les données obtenues à partir de tranches de cerveau fiables.
Les tranches de cerveau dérivées de l’IUE ou de l’EUE avec un mélange de plasmides exprimant Lyn-mNeonGreen entraînent un marquage similaire des neurones clairsemés. Un CPN pyramidal représentatif exprimant Lyn-mNeonGreen et le comportement dynamique de son cône de croissance est illustré à titre d’exemple (Figure 5A et Vidéo supplémentaire 1, en haut à gauche). De plus, les neurones ont été marqués à l’aide d’un plasmide exprimant une sonde d’actine pour analyser la dynamique de l’actine des cônes de croissance axonale in situ (Figure 5B et vidéo supplémentaire 1, en bas à gauche). Des expériences in situ ont également été réalisées avec un modèle de plasmide exprimant le fluorophore à double Cre/Dre (Figure 1C et Vidéo supplémentaire 1, à droite). Les fluorophores tRFP ou ZsGreen contenus dans ce plasmide pourraient être activés spécifiquement et individuellement par les recombinases Dre ou Cre, respectivement, dans les neurones voisins (Figure 5C). Cette gamme expérimentale permet une analyse côte à côte des cônes de croissance des neurones témoins avec des neurones modifiés voisins (toute perte ou gain de fonction donné). Cela permet de contourner la variabilité résultant de l’utilisation de différentes tranches pour tester le contrôle et les conditions expérimentales.
Les kymographes générés à partir du film enregistré ont été analysés, à partir desquels des paramètres de croissance dynamique tels que l’activité saillante dans le temps et la durée de croissance peuvent être facilement obtenus (Figure 6A). Notez qu’un simple réglage de la résolution temporelle du time-lapse permet de mesurer la vitesse d’allongement de l’axone pendant 2 h (Figure 6A). En outre, la variation du volume du cône de croissance au fil du temps - une mesure de l’activité dynamique générale du cône de croissance - peut être facilement obtenue, dans ce cas avec un logiciel sous licence (Figure 6B et Figure 6E,F). Cela peut être utilisé pour évaluer la vitesse du tapis roulant à l’actine et l’équilibre des filopodia/lamellipodies pendant l’activité d’exploration du cône de croissance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figure 1 : Schémas des plasmides utilisés dans le protocole. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Des informations pertinentes concernant les composants plasmidiques et l’origine du fluorophore se trouvent dans les boîtes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail de l’électroporation ex utero et in utero de souris E15.5. (A) Mise en place d’un poste de chirurgie pour l’électroporation ex utero. (B) Mise en place d’un poste de chirurgie pour l’électroporation in utero. (C) Cornes utérines tirées à l’extérieur de la cavité abdominale de la souris anesthésiée. D) Extraction d’un embryon du sac utérin. E) Sacrifice d’embryons par transsection complète de la moelle épinière par incision diagonale; notez que la décapitation a été évitée. (F) Placement de l’embryon dans le support et injection avec un mélange ADN/Fast Green dans le ventricule latéral gauche. (G,H) Positionnez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine avec la cathode (flèche rouge) sur le cortex à un angle de 60°. (I) Placement des bras de l’embryon (flèches noires) à l’extérieur du support pour éviter le glissement de l’embryon pendant la procédure. (J) Rotation de l’embryon à l’intérieur du sac utérin pour exposer la tête. (K,L) Injection du mélange ADN/Fast Green dans les ventricules latéraux de l’embryon à travers la paroi utérine. (M) Positionner la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à épiler en platine avec une cathode (flèche rouge) sur le cortex à un angle de 60°. (N) Incision musculaire suturée via une suture de verrouillage de course. (O) Incision cutanée suturée par une suture interrompue. (P) Fixation de la plaie à l’aide de clips chirurgicaux et désinfection à l’aide de bétadine. (Q) Placement de la souris dans la cage de récupération avec une lumière chauffante infrarouge lointaine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figure 3 : Extraction des cerveaux E15.5 et E12.5 et procédure de culture de tranches organotypiques. (A) Outils utilisés pour la procédure d’extraction cérébrale. (B) Mise en place d’une station de culture organotypique. (C-F) Extraction du cerveau E15.5. (G-J) Extraction du cerveau E12.5. Les lignes pointillées mettent en évidence l’emplacement des incisions. Des flèches rouges indiquent la direction de la traction par pince. (K) Intégrer le cerveau dans un plat de 3 cm contenant 3% d’agarose à faible teneur en fusion, laissant un espacement d’espacement des agaroses de 1 à 2 mm sous le cerveau. (L) Collecte d’une tranche de cerveau de 150 μm. (M) Placement de tranches de cerveau sur des inserts membranaires en PTFE immobilisés dans un plat de 35 mm à l’aide d’un film de paraffine (flèche bleue). Le marquage en étoile rouge indique une collection donnée de tranches de cerveau à partir du vibratome (L) et son transfert à la membrane PTFE (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figure 4 : Structure cellulaire gliale radiale conservée dans des tranches organotypiques saines. Images confocales de tranches cérébrales E17.5 révélant un réseau RG (vimentine; vert) et une organisation cellulaire globale (DAPI; magenta) après IUE (A) et EUE (B, C). Notez les fortes perturbations dans le réseau RG qui peuvent parfois résulter de l’EUE (C). Les grossissements correspondent aux cadres pointillés rouges de la figure principale : barres d’échelle, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figure 5 : Visualisation in situ de la dynamique du cône de croissance dans les tranches organotypiques aiguës. (A,B) Neurones et leurs cônes de croissance correspondants marqués respectivement avec Lyn-mNeonGreen et LifeAct-GFP. Étoile rouge marquant le cône de croissance du neurone exprimant Lyn-mNeonGreen. Astérisque bleu marquant le cône de croissance du neurone exprimant LifeAct-GFP. (C) Neurones voisins marqués avec le système plasmidique double contenant tRFP (magenta) et ZsGreen (vert) et leurs cônes de croissance correspondants. Les cônes de croissance imagés (à droite) étaient en dehors du cadre capturé (à gauche), obtenus peu de temps après l’acquisition du time-lapse du cône de croissance; barres d’échelle, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figure 6 : Analyse de la vitesse de croissance des axones et du volume du cône de croissance. (A) Traçage des axones sur un neurone exprimant Lyn-mNeonGreen (en haut) et son kymographe correspondant (ci-dessous) généré à l’aide d’ImageJ. (B) Reconstruction de la vidéo z-stack du cône de croissance à l’aide du logiciel d’analyse d’images (en haut) et du même cône de croissance mis en évidence à l’aide de l’outil de mesure des surfaces (ci-dessous). (C) Graphiques montrant les changements de vitesse de croissance au fil du temps pour plusieurs axones. (D) La vitesse de croissance moyenne des axones est quantifiée en (C). (E) Graphique montrant les variations du volume du cône de croissance au fil du temps. F) Le volume moyen des cônes de croissance est quantifié en (E); barre d’échelle, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figure 7 : Migration radiale et polarisation neuronale des neurones corticaux pyramidaux. Diagramme illustrant le développement de neurones corticaux pyramidaux (rose) migrant radialement de la zone ventriculaire germinale (VZ) vers la surface pia. Guidés par des processus de glie radiale (gris), les neurones polarisés en migration établissent un processus principal, la dendrite future, et le processus de suivi, l’axone futur, qui continuent de s’étendre vers le bas vers la zone intermédiaire (IZ). Les boîtes rouges en pointillés représentent les zones corticales où les cônes de croissance ont été imagés. Plus précisément dans l’IZ, zone sous-ventriculaire (SVZ), ou jonction de faisceaux d’axones (vert). L’illustration a été créée à l’aide d’un outil Web, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmide</td>
			<td>Concentration (μg/μL)</td>
			<td>Utilisation prévue</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Marquage de la protéine membranaire ciblée (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Marquage de l’actine filamenteuse (F-actine) dans les cônes de croissance</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Marquage indépendant de deux populations de neurones voisins</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Liste des plasmides utilisés dans le Protocole. Nom, concentration et utilisation prévue de chaque plasmide utilisé.
Vidéo supplémentaire 1 : Visualisation in situ de la dynamique du cône de croissance dans les tranches organotypiques aiguës. Dynamique des cônes de croissance étiquetés avec Lyn-mNeonGreen (en haut à gauche) et LifeAct-GFP (en bas à gauche). Les cônes de croissance voisins sont marqués différentiellement avec le système plasmidique double contenant tRFP (magenta; en haut à droite) et ZsGreen (vert; en bas à droite). Intervalle d’imagerie, 2,5 s. Barres d’échelle, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

La façon dont les axones naviguent dans la matrice complexe du système nerveux central est une question fondamentale en neurobiologie. Ce protocole permet d’étudier la croissance des axones et la dynamique des cônes de croissance dans l’environnement physiologique avec une imagerie à haute résolution. Ce protocole décrit un pipeline convivial de bout en bout pour la livraison d’ADN dans le cerveau embryonnaire de la souris, des préparations pour des tranches organotypiques de haute qualité et un guide étape par étape pour l’acquisition et l’analyse d’images.Bien qu’à l’origine conçu pour étudier la dynamique des axones dans le système nerveux central embryonnaire, ce protocole pourrait être ajusté pour permettre la culture organotypique et la visualisation de la plasticité axonale après des conditions traumatiques ou pathologiques. Le protocole lui-même est relativement simple. Cependant, la réalisation de son premier étiquetage et la préservation des structures cérébrales sont des points critiques.Par conséquent, les étapes d’électroporation, de dissection cérébrale et de tranchage nécessitent des soins supplémentaires. La démonstration de la procédure sera utile, et le doctorant est du laboratoire de Bracket. Après avoir anesthésié une souris femelle enceinte, faites une incision pour extraire les deux cornes utérines à l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution saline chaude ou d’une pince, en saisissant soigneusement les espaces entre les embryons.Ensuite, placez les embryons sur de la gaze humide. Après avoir ouvert le sac utérin, retirez chaque embryon. Placez les embryons dans un plat de 10 centimètres contenant du HBSS complété par du glucose sur de la glace.Pour l’électroporation ex utero, ramassez un embryon et placez-le dans le support. Ensuite, insérez soigneusement le capillaire en verre contenant le mélange vert rapide d’ADN à travers le crâne embryonnaire dans le ventricule latéral et injectez deux à trois microlitres du mélange de plasmides d’ADN dans chaque ventricule. Ensuite, maintenez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine à l’angle approprié pour cibler la zone cérébrale souhaitée, la cathode faisant face à la zone où le transfert d’ADN est prévu.Pour l’électroporation in utero, après avoir retiré les cornes utérines et placé les embryons sur une gaze humide comme démontré précédemment, utilisez le bout des doigts pour faire pivoter doucement l’embryon à l’intérieur de l’utérus jusqu’à ce que les sutures lambdoïdales et saggitales soient localisées. Ensuite, insérez soigneusement le capillaire en verre contenant le mélange vert rapide de l’ADN à travers la paroi utérine et le crâne embryonnaire dans le ventricule latéral, et injectez deux à trois microlitres du mélange de plasmides d’ADN dans un ou les deux ventricules comme souhaité avec un maximum de deux microlitres par ventricule. Après l’injection, maintenez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine à l’angle approprié pour cibler la zone cérébrale souhaitée avec la cathode face à la zone où le transfert d’ADN est prévu.Une fois que tous les embryons requis ont été électroporés, utilisez un coton-tige trempé dans une solution saline pour replacer doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale. Suturez les incisions musculaires et cutanées à l’aide d’un matériau de suture 5-0, puis fixez la plaie à l’aide de clips de suture et désinfectez la plaie en la pulvérisant avec de la bétadine. Replacez la souris dans la cage de récupération et maintenez la chaleur à l’aide d’une lumière chauffante infrarouge lointaine pendant au moins 20 minutes après la procédure.Fixez la tête de l’embryon sous un microscope à dissection. Ensuite, retirez la peau du crâne en coupant le long de la ligne médiane en partant de la base de la tête vers le nez. Pelez la peau du crâne latéralement en faisant un espace assez grand pour que le cerveau soit excisé.Ensuite, pour retirer le cerveau, insérez la pointe fermée de ciseaux de dissection stériles commençant sous le bulbe olfactif et se déplaçant vers le tronc cérébral. Ensuite, coupez le tronc cérébral et coupez de nombreux morceaux de méninges autour du cerveau. À l’aide d’une cuillère perforée, ramassez le cerveau et retirez l’excès de liquide en tamponnant le fond de la cuillère contre du papier de soie sec.Ensuite, placez le cerveau dans un plat d’agarose sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une cuillère plus petite, mélangez l’agarose pendant 10 secondes pour un refroidissement uniforme, puis manœuvrez le cerveau au milieu du plat en le plaçant horizontalement avec la face dorsale vers le haut et en vous assurant qu’il est complètement recouvert d’agarose de toutes les directions. Ramassez doucement le bloc d’agarose du poste de travail Vibratome et séchez le fond en tamponnant contre du papier de soie.Placez ensuite le bloc sur la zone collée du porte-spécimen avec le côté rostral du cerveau vers le haut et mettez le porte-spécimen sur la glace. Laissez sécher la colle pendant une minute. Coupez le cerveau en tranches coronales à un angle de 15 degrés.Ensuite, à l’aide de spatules propres, collectez les tranches de cerveau et placez-les sur une membrane en PTFE immobilisée dans un plat à fond en verre de 35 millimètres à l’aide de Parrafin. Collectez jusqu’à cinq tranches de cerveau par membrane. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez l’excès de solution de glucose HBSS autour des tranches de la membrane, laissant les tranches semi-sèches, puis ajoutez 500 microlitres de milieux de tranches préavertis directement dans l’espace sous la membrane et incubez les tranches à 35 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Pour l’imagerie de la croissance des axones, localisez une région du cortex avec une densité cellulaire faible à moyenne. Alors que pour l’imagerie de la dynamique du cône de croissance, localisez un cône de croissance dans la zone immédiate ou la zone sous-ventriculaire du cortex. Définissez ensuite une taille de pile Z.Pour la croissance axonale dans une grande pile Z, définissez une taille de pas de deux micromètres et pour les cônes de croissance dans une pile Z plus petite, définissez une taille de pas d’un micromètre. Pour l’analyse des données, ouvrez le fichier image aux Fidji en cliquant sur fichier, puis en l’ouvrant et en sélectionnant l’image. Obtenez la projection d’intensité maximale du laps de temps en cliquant sur l’image, suivie des piles, de la projection Z et de la projection d’intensité maximale.Parcourez le laps de temps et localisez un axone en croissance. Une fois localisé, tracez une ligne à travers l’axone en croissance, en commençant par la pointe de l’axone dans la première image et en suivant l’axone tout au long du laps de temps. Ensuite, chantez le plugin kymo re-slice large.Définissez l’échelle du kymographe en accédant à l’image, puis aux propriétés. Après avoir défini la distance en micromètres, la largeur des pixels et le temps en secondes ou en minutes, ainsi que la hauteur des pixels, allez analyser et cliquez sur Mesurer. Pour mesurer le volume du cône de croissance, ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’image en cliquant sur fichier, ouvrir et en sélectionnant le fichier d’intérêt.Ensuite, sélectionnez l’assistant d’ajout de nouvelles surfaces à la première étape, sous Paramètres de l’algorithme, sélectionnez segmenter uniquement une région d’intérêt et, à la deuxième étape, recadrez l’image pour l’adapter à l’ensemble du cône de croissance dans toutes les images. Ensuite, à la troisième étape, maintenez le seuil à l’intensité absolue et, à la quatrième étape, assurez-vous que toute la région du cône de croissance est seuillée. Ensuite, à l’étape cinq, sous le type de filtre, sélectionnez le nombre de voxels LMG à un.Sélectionnez le bouton Exécuter pour effectuer toutes les étapes de création et mettre fin à l’assistant d’ajout de nouvelles surfaces. Enfin, dans l’onglet Statistiques en haut de la fenêtre de l’assistant, sélectionnez des valeurs et un volume spécifiques sous l’onglet détaillé. En règle générale, les tranches de cerveau cultivées avec succès dérivées de l’électroporation in utero ou ex utero montrent une distribution cellulaire normale et un ensemble organisé de glie radiale avec des processus de contact pilo orientés vers l’ap.Parfois, une électroporation ex utero a marqué des perturbations dans l’échafaudage glial radial et les tranches de cerveau cultivées sont observées, ce qui rend cette coloration de contrôle recommandable. Un neurone cortical pyramidal représentatif projetant exprimant Lyn-mNeonGreen et le comportement dynamique de son cône de croissance est montré ici. De plus, les neurones ont été marqués à l’aide d’une sonde d’actine exprimant le plasmide pour analyser la dynamique de l’actine des cônes de croissance axonale in situ.Des expériences in situ ont également été réalisées avec un double fluorophore cre dre exprimant la conception plasmidique, où les fluorophores tRFP ou ZsGreen pourraient être activés spécifiquement et individuellement par dre ou cre recombinases, respectivement dans les neurones voisins. À partir des kymographes, les paramètres de croissance dynamique tels que la vitesse de croissance de plusieurs axones et le volume du cône de croissance au fil du temps sont facilement obtenus. Cela peut être utilisé pour évaluer la vitesse du tapis roulant d’actine et l’équilibre entre les filopodes et les lamellapodies pendant l’activité d’exploration du cône de croissance.Il est important de maintenir la structure du cerveau et d’affiner les concentrations de plasmides pour obtenir un marquage clairsemé. Ceci est crucial pour une visualisation précise des axones et des cônes de croissance dans le cortex. En fonction des plasmas sélectionnés et du fond génétique, ce protocole permet aux utilisateurs de modifier les neurones ou l’environnement dans lequel ils se développent, ce qui permet un large éventail d’études.En permettant un accès haute résolution aux neurones in situ, cette technique permet aux neuroscientifiques d’interroger l’interaction dynamique entre les cônes de croissance et les mesures du système nerveux central aux niveaux morphologique et moléculaire.

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Nous présentons une méthode pour préparer les tranches organotypiques d'embryons de souris mi-gestation pour la culture et de l'imagerie time-lapse d'excroissance des nerfs périphériques.

Culture organotypique d&#39;exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d&#39;excroissance des nerfs périphériques

Ce protocole décrit une analyse organotypique optimisé pour le cerveau postnatal et à haute résolution imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le flux rostrale migrateurs.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

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Culture ex vivo et imagerie de tranches oculomotrices d’embryons de souris transgéniques

Source : Wiegreffe, C., et al.,  Imagerie confocale en accéléré de neurones migrateurs dans une culture en coupe organotypique de cerveau embryonnaire de souris à l’aide deIn Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Cette vidéo montre la microscopie confocale time-lapse pour observer la migration radiale des neurones corticaux à partir de la zone sous-ventriculaire à la plaque corticale via des échafaudages gliaux radiaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites.

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la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

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Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

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Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

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L&#39;imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em&gt; Dans Utero</em&gt; Electroporation

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

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Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

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In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës (Vidéo) | JoVE Journal

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

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