Name: Génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques PCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez la culture de biofilms bactériens à haut débit avec un dispositif de microplaques de puits profonds. Cette méthode permet d'obtenir une biomasse supérieure pour l'analyse de Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli.

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Le financement de ces travaux a été fourni par des subventions de fonctionnement à DCB de la Subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN- 2016-05891) et au MRM et au GRG du programme de subvention de l’Initiative de recherche et de développement en génomique (IRGM) du gouvernement du Canada (GRDI7 2254557).

1. Préparation de la culture aseptique pour la croissance du biofilm (jours 0-1)
<ol><li>Le jour 0, strier la ou les souches bactériennes souhaitées pour les tester à partir d’un stock cryoconservé (dans du glycérol ou du diméthylsulfoxyde (DMSO)) directement sur une plaque d’agar nutritif avec sélection antimicrobienne selon les besoins de la souche. Incuber des plaques de gélose à la température optimale (37 °C) et au temps (18-22 h) pour la croissance de la déformation.</li>
	<li>Le lendemain (Jour 1), inoculer une colonie de la plaque de gélose dans 5 mL de milieu de croissance dans des conditions de croissance optimales. Ces cultures seront utilisées comme inocules de départ du jour 2 pour les dispositifs de biofilm (voir l’étape 2.2; Figure 1). NOTE: Pour cette étude, E. coli K-12 BW21153 et P. aeruginosa PAO1 ont été cultivés en milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C pendant 18 h avec agitation à 160 tours par minute (tr/min).<ol>
<li>Préparer au moins 3 souches cultivées indépendamment pour générer des répliques biologiques pour la mesure du biofilm en raison de la variabilité statistique de la formation de biomasse de biofilm sur les dispositifs de couvercle indexés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation et inoculation des assiettes (Jour 2)
<ol><li>Remplir les puits extérieurs d’une plaque de polypropylène autoclavée de 96 puits, 1,1 mL/puits, avec de l’eau stérile de 750 μL/puits (figure 2A). Remplir les puits témoins négatifs (puits de milieu non inocculés; colonne B) avec des milieux de croissance de 750 μL et les puits restants avec des milieux de croissance de 675 μL. REMARQUE: L’étape 2.1 ci-dessus et les étapes ci-dessous répertorient les volumes appropriés pour le dispositif de biofilm de puits profond. Si vous utilisez le dispositif de biofilm standard, les volumes doivent être modifiés comme suit: 75 μL de culture d’inoculum à 20 μL; 675 μL de milieux de croissance à 180 μL; 750 μL d’eau stérile /milieu de croissance à 200 μL; 800 μL de solutions de coloration CV / acide acétique / rinçage à 210 μL. De plus, pour l’étape 3.6 ci-dessous, l’absorbance à 500 nm (A550 nm) peut être lue directement dans la microplaque de polystyrène après mélange lors de l’utilisation de la microplaque standard du dispositif de biofilm.</li>
	<li>En utilisant des cultures de nuit day 1, standardisez les cultures à une densité optique de 600 nm (OD600nm) = 1,0 ou à une norme McFarland de 0,5-1 unités.</li>
	<li>Créer une dilution en série de 10 fois de chaque culture standardisée dans des tubes à essai ou une plaque de microtitrage de puits de 96 puits de profondeur jusqu’à ce qu’une dilution de 10-3 soit atteinte.</li>
	<li>Inoculer les milieux contenant des puits comme le montre la figure 2B avec 75 μL de la culture diluée 1 x 10-3 , pour une dilution bactérienne finale dans le puits de 10-4.</li>
	<li>Insérez soigneusement une plaque PCR autoclavée (couvercle attaché) dans la plaque de puits profond inoculée. Incuber des plaques dans des conditions de déformation optimales (37 °C) avec agitation (maximum 160 tr/min) dans un incubateur avec 50-60% d’humidité pendant 24 h.</li>
</ol>3. Détermination de la biomasse du biofilm à partir d’appareils utilisant la coloration CV (Jour 3)
<ol><li>Retirer de manière aseptique le couvercle fixé au biofilm de chaque appareil et rincer en l’insérant dans une plaque de puits profond autoclavée préparée avec 800 μL de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) / puits pendant 30 s pour éliminer les cellules planctoniques.</li>
	<li>Pour la coloration CV de la biomasse, transférer le couvercle de la plaque PCR indexée dans une nouvelle plaque préparée avec 800 μL/puits 0,1% (p/v) CV en dH2O et tacher pendant 5 minutes.</li>
	<li>Enlevez l’excès de tache en rinçant le couvercle attaché dans une plaque de puits profonde préparée avec 800 μL / PBS bien stérile. Laissez les plaques sécher pendant 10 minutes dans une armoire de biosécurité avec des chevilles orientées vers le haut.</li>
	<li>Transférer le couvercle de la plaque PCR séchée sur une plaque contenant 800 μL/puits 30 % (v/v) d’acide acétique et laisser le couvercle se décolorer pendant 5 minutes.</li>
	<li>Retirez le couvercle de la cheville PCR déficiée et mélangez soigneusement la solution par pipetage. Transférer 200 μL des plaques de puits profondes vers une microplaque standard de 96 puits et mesurer l’absorbance de la solution de décoloration à une longueur d’onde de 550 nm (A550nm) dans un lecteur de microplaques ultraviolette (UV) / visible (Vis).</li>
	<li>À l’aide des valeurs A550nm mesurées, soustrayez la valeur moyenne A550nm à blanc (contrôle négatif) de la valeur de chaque échantillon de biofilm. Faire la moyenne de chaque valeur d’échantillon de biofilm A550nm soustrait à blanc représentant les répliques biologiques de l’échantillon.</li>
</ol>4. Remettre en question les biofilms contenant des antimicrobiens pour calculer leur valeur MBEC antimicrobienne sur 24 heures (Jour 3)
<ol><li>Préparez une solution mère antimicrobienne dans de l’eau qui est deux fois (2x) la concentration de la concentration antimicrobienne la plus élevée souhaitée à tester.</li>
	<li>Créez une série de dilution en deux parties de la solution mère antimicrobienne dans 2x milieux de croissance concentrés afin qu’il y ait 8 concentrations antimicrobiennes.</li>
	<li>Comme le montre la figure 2B, remplir les puits extérieurs d’une plaque de puits profond autoclavée avec de l’eau stérile de 750 μL/puits. Remplir les colonnes B (témoin négatif; pas de bactéries) et C (témoin positif; pas d’exposition aux antimicrobiens) de la plaque avec un milieu de croissance de 750 μL/puits. Remplir les puits restants avec 750 μL/puits de la série de dilution antimicrobienne, comme le montre la figure 2B.</li>
	<li>Retirez et rincez le couvercle fixé comme décrit à l’étape 3.1 et transférez-le dans la plaque de provocation antimicrobienne.</li>
	<li>Incuber les plaques avec agitation (max 160 tr / min) dans des conditions de déformation appropriées et pour la période d’exposition souhaitée.</li>
</ol>5. Récupération de la biomasse du biofilm à partir de couvercles arrimés (Jour 4)
<ol><li>Retirez les couvercles attachés exposés aux antimicrobiens et rincez comme décrit à l’étape 3.1. Transférer le couvercle fixé sur une plaque de puits profonde avec un milieu de récupération de 750 μL/puits dans les puits intérieurs et 750 μL/puits stérile dH2O dans les puits extérieurs.<ol>
<li>Pour préparer un milieu de récupération de 70 mL, combiner 35 mL de 2x LB concentré, 0,7 mL de 100% tween-20, 3,5 mL de 20x solution neutralisante universelle et 30,8 mL de dH2O stérile dans un flacon stérile.</li>
		<li>Pour préparer 20x solution neutralisante universelle concentrée, ajouter 1,0 g de L-histidine, 1,0 g de L-cystéine et 2,0 g de glutathion réduit à un volume final de 20 mL de dH2O. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez l’appareil de l’étape 5.1 dans un bac secondaire installé à l’intérieur d’un bain-marie sonique. Soniquez les appareils pendant 30 minutes pour déloger le biofilm des chevilles dans le milieu de récupération.</li>
	<li>Après la sonication, retirez le couvercle attaché et placez un couvercle de plaque plate stérile sur la plaque de récupération profonde du puits. Le couvercle attaché peut être jeté.</li>
	<li>Incuber des plaques avec des milieux de récupération à partir de l’étape 5.3 dans les conditions optimales de croissance de la souche pendant la nuit (16-18 h).</li>
</ol>6. Détermination des valeurs MBEC de l’appareil (Jour 5)
<ol><li>Le lendemain, transférer 200 μL de chaque puits de la plaque de puits profond incubée de l’étape 5.4 vers une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits. Lisez l’OD600nm de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques de gamme UV/Vis.</li>
	<li>Soustraire les valeurs de contrôle négatif (blanc non ininoculé) OD600nm de chaque biofilm contenant un échantillon.</li>
	<li>Calculer la valeur MBEC pour chaque échantillon en utilisant les valeurs OD600nm , où la valeur MBEC est la concentration antimicrobienne la plus faible qui a abouti à la valeur OD600nm la plus faible (impossible à distinguer du contrôle non ininoculé) pour un échantillon spécifique d’espèces/souches traitées aux antimicrobiens.</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont aucune divulgation à faire.

Cette étude décrit des méthodes d’utilisation d’un dispositif de croissance de biofilm statique à haut débit de 96 puits de plus grand volume impliquant une microplaque de puits profond en polypropylène équipée d’un couvercle de plaque PCR semi-jupe pour la formation de biofilm (dispositif de biofilm de puits profond; Tableau des matériaux). Nous avons comparé les biofilms générés avec ce dispositif à un dispositif de biofilm standard en polystyrène disponible dans le commerce (Table des matériaux). La méthode du dispositif de puits profonds utilise les mêmes étapes et solutions méthodologiques que le dispositif standard17 à des volumes ajustés modifiés pour les dispositifs de puits profonds, ce qui rend ce dispositif idéal pour la formation de biofilm à grande échelle et l’analyse expérimentale. La croissance d’E. coli BW25113 et de P. aeruginosa PAO1, deux espèces à Gram négatif connues pour former des biofilms, a été examinée pour sa formation de biomasse et ses valeurs de MBEC désinfectant (BZK/eau de Javel) utilisées sur les deux dispositifs. La comparaison de la biomasse colorée CV formée sur les chevilles de chaque dispositif a montré que E. coli et P. aeruginosa formaient des biofilms avec une biomasse plus élevée sur le dispositif de biofilm de puits profond par rapport au dispositif standard (Figure 3A-B). L’augmentation de la biomasse du biofilm reflétait la plus grande surface des piquets de puits profonds par rapport à la surface de cheville standard de l’appareil. Lorsque nous avons tenu compte des différences dans les surfaces des chevilles (mm2) avec les deux dispositifs, des différences dans la formation de biomasse ont été notées, où E. coli a formé une biomasse CV significativement plus importante par mm2 sur les chevilles de dispositif standard en polystyrène qu’avec les chevilles de tube PCR du dispositif de puits profond (tableau 1). P. aeruginosa a formé une plus grande biomasse colorée CV/cheville mm2 par rapport aux dispositifs standard (tableau 1). Ces résultats peuvent mettre en évidence des différences spécifiques à l’espèce dans la formation de biomasse de biofilm sur les différents dispositifs.
Il convient de noter que l’éradication à l’eau de Javel des biofilms d’E. coli et de P. aeruginosa sur les dispositifs de puits profonds s’est produite à des concentrations 2 à 4 fois plus faibles que les dispositifs standard (figure 4A-B, tableau 1). Les différences dans les valeurs de MBEC d’eau de Javel identifiées à partir de chaque dispositif sont probablement influencées par les différences dans les formes de chevilles de l’appareil (les « chevilles » de puits profonds sont des tubes coniques et les chevilles standard sont cylindriques), les différences de composition plastique (polypropylène par rapport au polystyrène) et les différences de volume (750 μL contre 200 μL). Par exemple, P. aeruginosa avait une biomasse CV M/mm2 plus importante sur les chevilles des dispositifs de puits profonds par rapport aux dispositifs standard, mais E. coli avait moins de biomasse sur les piquets de puits profonds (figure 3). Cela suggère que les concentrations de désinfectant nécessaires à l’éradication du biofilm peuvent être affectées par la biomasse formée par chaque espèce ainsi que par la surface disponible. De plus, les différences dans la forme des chevilles de l’appareil peuvent influencer diverses conditions de croissance pour des espèces particulières. Dans notre étude, P. aeruginosa peut former une plus grande biomasse sur les piquets de puits profonds en raison de leur plus grande surface et de leur aération, car cette espèce est un aérobie obligatoire contrairement à E. coli, qui est un anaérobie facultatif. À ce jour, nous n’avons identifié aucune étude publiée qui a directement comparé la formation de biofilm e. coli et de P. aeruginosa sur des matériaux en polypropylène27,28,29 et en polystyrène30,31. Cependant, des rapports de formation robuste de biofilm d’E. coli et de P. aeruginosa ont été notés dans des études indépendantes examinant des matériaux en polypropylène ou en polystyrène. En ce qui concerne les pseudomonades, de nombreux Pseudomonas spp. peuvent utiliser des plastiques tels que le polypropylène comme sources potentielles de carbone32. Par conséquent, la disponibilité de ce dispositif de biofilm de puits profond en polypropylène est une avancée utile dans les études de biofilm statique. Le polypropylène est chimiquement plus durable que le polystyrène et est un matériau cliniquement pertinent, car il est fréquemment utilisé dans les implants médicaux, les sutures et les mailles pour les chirurgies herniques ou pelviennes33,34.
Bien que la biomasse du biofilm ait été formée par les deux dispositifs, le dispositif de puits profonds présentait une variabilité légèrement plus élevée de la biomasse en fonction de la méthode de coloration CV et des valeurs MBEC d’éradication du biofilm OD600nm pour l’eau de Javel et le BZK. Cela peut s’expliquer par 3 facteurs principaux: 1) Les dispositifs de puits profonds ont une plus grande surface de cheville que les dispositifs standard qui étaient inclinés par rapport aux chevilles de dispositif standard. 2) Les deux espèces testées peuvent avoir des capacités différentes à adhérer aux matériaux en polypropylène et en polystyrène de chaque dispositif. 3) Les volumes de milieux de croissance utilisés dans chaque appareil (puits profond de 750 μL, norme de 200 μL) et l’espacement entre la cheville insérée et les parois latérales du puits diffèrent. Ces problèmes ne sont pas un problème si un seul type de dispositif est utilisé pour toutes les expériences de biofilm, cependant, si les deux dispositifs sont sélectionnés, les comparaisons que nous avons effectuées ici devraient être effectuées pour identifier les différences36,37. En raison des différences dans les matières plastiques utilisées dans chaque dispositif, les valeurs de biomasse de biofilm teintée CV et de MBEC ne doivent pas être directement comparées entre différents dispositifs. Toutefois, si les méthodes et les expériences sont menées sur le même dispositif (puits profond ou standard), les résultats obtenus pour les espèces et les antimicrobiens testés sont comparables.
Ce protocole montre que les dispositifs de plaques pcR de puits profonds auto-assemblés sont des dispositifs de biofilm de plus grand volume pour mesurer la formation et l’éradication de biofilm qui sont également rentables. Du point de vue des coûts, les dispositifs de biofilm standard avec une gamme de 96 couvercles bien fixés se vendent entre 29 et 36 dollars américains (USD) par appareil (table des matériaux). Les dispositifs de biofilm standard en polystyrène ne sont pas autoclavables et sont moins tolérants aux solvants / acides en raison de ses propriétés chimiques plastiques. Les plaques de puits profonds en polypropylène auto-assemblées décrites dans le présent document, équipées d’une plaque PCR (Table des matériaux) semi-jupe séparée de 96 puits, coûtent un total de 14 USD par dispositif assemblé, soit la moitié du coût standard du dispositif de biofilm. Il convient de noter que les prix peuvent varier en fonction de la région, du distributeur et de la disponibilité, et de nos coûts après que les remises institutionnelles ont été fixées à 9 USD / appareil de puits profond. Ces dispositifs auto-assemblés à plaques pcR en polypropylène à puits profond ont l’avantage supplémentaire d’être autoclavables pour la stérilisation et offrent 2 à 4 fois plus de biomasse de biofilm que les dispositifs standard.
En conclusion, ce protocole et les résultats représentatifs des comparaisons de croissance du biofilm des dispositifs de puits profonds et de biofilm standard montrent que les deux dispositifs sont capables de cultiver des biofilms bactériens, mais que les dispositifs de puits profonds forment 2 à 4 fois plus de biofilm. Le dispositif de biofilm de puits profonds offre une alternative viable et abordable pour les expériences de formation de biofilm à haut débit à plus grand volume, telles que les études de dépistage de la susceptibilité aux médicaments. Cette technique peut générer des biofilms utiles pour les extractions « -omiques » en aval (protéomiques, métabolomiques, transcriptomiques) ou les essais expérimentaux (enzymatiques, fluorescents) qui peuvent nécessiter de plus grandes quantités de matériaux de biofilm pour les analyses. Le dispositif de biofilm de puits profond est recommandé pour les laboratoires qui souhaitent étudier les biofilms dans un essai à haut débit de 96 puits en utilisant des matériaux plastiques à faible coût, à plus grand volume et chimiquement durables qui sont cliniquement pertinents.

Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli sont des protéobactéries à Gram négatif qui sont couramment étudiées pour leur capacité à former des communautés cellulaires sessiles attachées à la surface connues sous le nom de biofilms1. Les deux espèces, lorsqu’elles se développent sous forme de biofilms, peuvent sécréter une matrice de substances polymères extracellulaires (EPS) composée principalement de différents polysaccharides et protéines, qui peuvent également inclure de l’ADN extracellulaire et / ou des lipides, offrant une protection cellulaire supplémentaire et une survie améliorée dans des environnements difficiles et limités en nutriments2,3. La physiologie et la formation du biofilm par les deux espèces sont d’une importance clinique, car elles représentent les cinq principaux agents pathogènes résistants aux antimicrobiens les plus couramment isolés provenant d’infections sanguines, urinaires et pulmonaires de patients hospitalisés au Canada4,5. On estime également que les biofilms représentent près de 80 % de toutes les infections chroniques et récurrentes causées par ces espèces bactériennes6. En raison des substances EPS sécrétées et de l’activité métabolique plus lente7,8, les biofilms établis deviennent plus difficiles à éradiquer lorsqu’ils se forment sur des surfaces telles que les dispositifs médicaux implantés, les tissus cicatriciels et dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose9,10, ce qui ajoute à leur résistance aux antimicrobiens.
Les propriétés de croissance récalcitrantes des biofilms bactériens les rendent souvent plus résistants à l’inhibition et/ou à l’éradication des antimicrobiens2,9. Ainsi, l’établissement de méthodes in vitro pour étudier l’éradication antimicrobienne du biofilm bactérien est primordial pour sélectionner des composés efficaces pour éradiquer les infections lorsqu’elles se forment sur des plastiques médicaux (par exemple, des cathéters à demeure) et des implants médicaux. La plupart des méthodes rapides de culture d’éradication antimicrobienne in vitro de biofilm examinent la croissance du biofilm comme une culture de biofilm « statique » plutôt que comme des cultures « continues », où la croissance bactérienne statique est surveillée aux stades précoces et avancés de la formation du biofilm sur une courte période (24-96 h) dans le même milieu de croissance. Les méthodes de biofilm continu sont lourdes pour une analyse rapide car elles nécessitent une évaluation de la croissance du biofilm sur de plus longues périodes cultivées dans des chambres qui permettent le flux continu et le remplacement des milieux de croissance par moins de répétitions11. En raison du temps et des efforts nécessaires pour maintenir et établir des biofilms continus, les biofilms statiques in vitro sont les plus populaires, car ils sont facilement adaptés aux tests de sensibilité aux antimicrobiens à haut débit dans des plaques de microtitrage en plastique de 96 puits plutôt que dans des systèmes de chambre d’écoulement élaborés qui limitent le nombre de cultures testées simultanément 12,13 . Les essais de microplaques de biofilm statiques « dans le puits » les plus simples utilisent des plaques de microtitrage standard en polystyrène ou en vinyle (capacité de 300 μL) pour mesurer la formation de biofilm sur les côtés et le fond de chaque puits et souvent sous forme d’anneaux à l’interface air-surface liquide. La formation de biofilm bactérien dans le puits est mesurée en colorant la biomasse déposée adhérant aux puits après l’élimination du liquide du milieu de croissance et le lavage des biofilms12,13. Ces essais sont économiquement populaires, mais présentent souvent des problèmes de reproductibilité en raison de leur conception inhérente, car les biofilms déposés sont sujets à des dommages ou à des pertes lors du rinçage pour la récupération cellulaire et les procédures de coloration de la biomasse11,14.
Pour réduire les pertes de biofilm, les dispositifs de biofilm commerciaux standard ont amélioré la conception des microplaques de biofilm dans le puits en ajoutant un couvercle en polystyrène inséré à 96 puits à la conception standard de plaque de 96 dans le puits, appelée « dispositif de biofilm standard » dans le présent document. L’ajout d’un couvercle fixé élargit la surface disponible dans chaque puits de microplaque, ce qui permet une meilleure adhérence de surface et la formation de biomasse de biofilm15,16. Les dispositifs de couvercle à ancrage de biofilm standard permettent une plus grande récupération, un retrait et un rinçage du biofilm pour des tests ultérieurs de sensibilité au biofilm antimicrobien et d’éradication lorsque des couvercles attachés sont insérés dans de nouvelles plaques de microtitrage contenant des problèmes de médicament ou de condition de croissance. À l’instar des techniques de microplaques de biofilm dans le puits, les matériaux récupérés à partir des dispositifs de couvercle indexés retirés et lavés permettent des tests de survie cellulaire et la coloration de la biomasse du biofilm, impliquant généralement des formulations de colorant violet cristallin (CV) 17,18,19. Les dispositifs de biofilm standard sont également optimaux pour le dépistage des susceptibilités antimicrobiennes du biofilm. Ces tests surveillent l’inhibition de la croissance du biofilm de deux manières: 1) Lorsque des antimicrobiens sont ajoutés aux cellules au début de la croissance, ils peuvent déterminer la valeur minimale de concentration d’inhibition du biofilm (MBIC). 2) Lorsque des biofilms établis se forment sur les chevilles après 24 heures, puis sont exposés à des antimicrobiens, il peut déterminer la valeur minimale d’éradication du biofilm (MBEC) 17,20. Semblables aux dispositifs à microplaques de biofilm dans le puits, les dispositifs à biofilm standard présentent certaines limites notables, telles que leur coût élevé par dispositif, ils ne sont pas autoclavables et sont moins durables pour les solvants chimiques en raison du matériau de plaque de polystyrène utilisé. Les dispositifs de biofilm standard ont également un faible rapport surface/cheville, ce qui limite les volumes de travail maximaux dans chaque puits à 200 μL. Ces facteurs peuvent rendre les dispositifs de biofilm standard plus difficiles à utiliser pour les études qui exigent de plus grandes quantités de biofilm dans un format à haut débit.
Nous décrivons ici une méthode statique de 96 puits à couvercle rattaché au biofilm développée dans notre laboratoire à l’aide de plaques de PCR à semi-jupe en polypropylène de 0,5 mL 96 puits disponibles dans le commerce et montées sur des plaques de microtitrage de 96 puits ayant des puits plus profonds que la plaque standard (Table des matériaux). Ces dispositifs assemblés ont un volume de travail maximal de 750 μL lorsqu’ils sont utilisés pour la culture de biofilm (ci-après dénommé « dispositif de biofilm de puits profond »). Les avantages de l’utilisation de ces dispositifs de biofilm de puits profonds sont leur coût inférieur par rapport aux dispositifs de biofilm standard, ils peuvent être stérilisés par autoclavage et ils augmentent la surface de formation de biofilm sur les plus grands « tubes / chevilles » de plaques DE PCR externes. Avec cette méthode, nous montrons les applications de ces dispositifs pour la culture et la caractérisation de la biomasse de biofilm formée par Escherichia coli BW25113 et P. aeruginosa PAO1. Les méthodes de détermination des valeurs de MBEC à l’aide d’essais d’éradication du biofilm sont décrites à l’aide du composé d’ammonium quaternaire désinfectant chlorure de benzalkonium (BZK) et hypochlorite de sodium (eau de Javel) antimicrobiens. L’antiseptique/désinfectant BZK a été choisi car ce composé est fréquemment utilisé pour inhiber les biofilms des surfaces contaminées, mais il serait moins efficace pour éradiquer les biofilms bien établis21. L’eau de Javel est un produit chimique très efficace pour l’éradication des biofilms établis et constitue un pilier de la désinfection chimique 22. Les deux désinfectants fournissent une comparaison utile des valeurs MBEC pour chaque dispositif de biofilm21. Un protocole pour cette évaluation de dispositif de biofilm utilisant des tests de coloration CV et d’éradication du biofilm pour la détermination du MBEC est résumé dans cet article. Un organigramme de protocole a été inclus pour une vue d’ensemble simplifiée du flux de travail pour ces méthodes (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>Pipettes sérologiques de 10 mL, papier d’emballage individuel/plastique (200/CS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11F</td><td>Pipettes sérologiques jetables pour milieux aseptiques/transfert de culture</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques de 2 mL, papier d’emballage individuel/plastique, 500/CS</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11C</td><td>Pipettes sérologiques jetables pour milieu aseptique/transfert de culture</td></tr><tr><td>Pointes filtrantes en aérosol Axygen, stériles, 5 portoirs/PK, 1000 pointes/portoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-766</td><td>pointes de pipette stériles pour l’aliquotage des milieux Microplaques</td></tr> de <tr><td>stockage de puits profonds Axygen, puits ronds, capuchon de 1,1 mL, 5/PK, P-DW-11-C</td> Fisher <td>Scientific</td><td>P-DW-11-C</td><td>Microplaque pour dispositif de forage de biofilm à 96 puits</td></tr><tr><td>Axygen Embouts filtrants, 350 &micro ; Embouts en L en rack, 96/rack, 10 racks, embouts à faible barrière de rétention</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-350-L-R-S</td><td>pointes de pipette stériles pour l’aliquotage des milieux</td></tr><tr><td>Bassin/réservoir naturel PS 50 mL, Stérile, 5/sac, 40 sacs, CS200</td><td>Avantor/ VWR</td><td>89094-676</td><td>Bassins/ réservoirs stériles pour la préparation de microplaques</td></tr><tr><td>BD Difco Milieux de culture déshydratés : gélose granulée, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td>matériaux pour la préparation de gélose LB</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques multimode Biotek Synergy Neo2</td><td>Lecteur de plaques de microplaques UV/Vis de région</td><td>Biotek</td><td>NEO2MB</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons Branson M3800, 117 V</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CPX-952-316R</td> Bain <td>d’eau sonique</td></tr> cristal <tr><td>violet (CV), grade ACS, 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>colorant</td></tr> <tr><td>biofilm biomasseDiméthylsulfoxyde (DMSO), 1 L, grade ACS 99,9 %, flacon en polyéthylène, BDH</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CABDH1115-1LP</td><td>Composants de milieu pour cryoconservation</td></tr><tr><td>Easypet 3, contrôleur de pipette</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA11027-980</td><td>pipette sérologique pour milieu aseptique/ transfert de culture</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 8 pipette multicanaux, 10-100 &micro ; L</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA89125-338</td><td>pipettes multicanaux pour milieu aseptique/ transfert de culture</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 8 pipette multicanaux, 30-300 & micro ; L</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA89125-340</td><td>Pipettes multicanaux pour milieu aseptique/ transfert de culture</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial, CAS 64-19-7, 2,5L, grade ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>CV destain</td></tr><tr><td>Tubes à essai en verre, 150 mm x 18 mm, 72/paquet, PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>14957H/ 9820-18</td><td>matériaux pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Glycérol, bouteille en verre de 4 L ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>composants du milieu pour la cryoconservation</td></tr><tr><td>L-cystéine, 98 %, 250 g</td><td>Avantor/ VWR</td><td>97061-204</td><td>solution neutralisante universelle</td></tr><tr><td>L-glutathion réduite, 98 %, 25 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6216614</td><td>solution neutralisante universelle</td></tr><tr><td>L-Hisitidine, 98 %, 100 g</td><td>Avantor/ VWR</td><td>CA97062-598</td><td>solution neutralisante universelle</td></tr><tr><td>MBEC Inoculateur de dosage avec plateau à 96 puits, 100/CS</td><td>Matériau Innovotech</td><td>19112</td><td>pour dispositif MBEC à 96 puits culture de biofilm</td></tr><tr><td>McFarland Standard, 0.5 EA</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20410</td><td></td></tr><tr><td>Norme McFarland, 1.0 EA</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20411</td><td>Standardisation de la culture cellulaire</td></tr><tr><td>NUNC Plaques de microtitration à 96 puits, avec couvercle, 50/CS</td><td>Fisher Scientific</td><td>167008</td><td>microplaque pour dispositif MBEC 96 puits Culture du biofilm et mesures OD</td></tr><tr><td>Plaque PCR, semi-jupe 96 puits, PCR rapide, polypropylène, 25ea/PK</td><td>Sarstedt</td><td>72.1981.202</td><td>Couvercle chevillé pour dispositif 96 puits profonds Culture du biofilm Boîte</td></tr> de <tr><td>Pétri, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>matériaux pour la préparation de la gélose LB</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique, ACS 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>PBS composant/tampon</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, grade ACS, 3 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2713</td><td>Composants de média pour bouillon LB et</td></tr><tr><td>phosphate de sodium PBS monobasique, 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-1</td><td>Composant/tampon PBS</td></tr><tr><td>Filtres pour seringues, stériles, PES 0,45 um, 25 mm, PK50</td><td>Avantor/ VWR</td><td>28145-505</td><td>Stérilisation en solution non autoclavable</td></tr><tr><td>Feuille d’étain, lourde devoir, 50 pieds</td><td>Épicerie</td><td>---</td><td>matériaux pour la stérilisation du dispositif</td></tr><tr><td>Tryptone (pepton de la caséine), 2,2 kg/CH</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11922</td><td>Composants de milieu pour bouillon LB</td></tr><tr><td>Tween-20, 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>solution de milieu de récupération</td></tr><tr><td>Ultra-deepwell, 2,5 mL Plaques de puits profond (puits carré), avec couvercle, polypropylène, 10/CS</td><td>Avantor/ VWR</td><td>37001-520</td><td>Matériaux pour la préparation de la dilution du biofilm</td></tr><tr><td>Extrait de levure, Fisher Bioréactifs, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>Composants de milieu pour bouillon LB</td></tr></tbody></table>

génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques pcr

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Les biofilms bactériens sont difficiles à éradiquer des surfaces à l’aide d’interventions antimicrobiennes conventionnelles. Les méthodes de microplaques à haut débit de 96 puits sont fréquemment utilisées pour cultiver des biofilms bactériens afin de tester rapidement la sensibilité aux antimicrobiens afin de calculer les valeurs minimales de concentration d’éradication du biofilm (MBEC). Les dispositifs de biofilm standard sont constitués de couvercles en polystyrène fixés sur des microplaques de 96 puits et sont idéaux pour mesurer la biomasse du biofilm et les valeurs MBEC, mais ces dispositifs sont limités par la surface de cheville disponible pour l’accumulation de biomasse et le coût. Ici, nous décrivons un protocole pour utiliser un dispositif auto-assemblé en polypropylène 96 puits profond à couvercle fixe pour cultiver des biofilms Escherichia coli BW25113 et Pseudomonas aeruginosa PAO1. Une comparaison des biofilms de 24 heures formés sur des dispositifs de puits standard et profonds par chaque espèce à l’aide de la coloration de la biomasse cristalline violette et des tests de détermination MBEC est décrite. La plus grande surface des dispositifs de puits profonds devrait multiplier par 2 à 4 la formation globale de biofilm par les deux espèces. P. aeruginosa a formé une biomasse significativement plus importante/mm2 sur les piquets de puits profonds par rapport au dispositif standard. E. coli avait plus de biomasse/mm2 sur les dispositifs de polystyrène standard par rapport au dispositif de puits profonds. Les essais d’éradication du biofilm avec des désinfectants tels que l’hypochlorite de sodium (eau de Javel) ou le chlorure de benzalkonium (BZK) ont montré que les deux composés pouvaient éliminer les biofilms d’E. coli et de P. aeruginosa des deux dispositifs, mais à des valeurs de MBEC différentes. L’éradication du biofilm BZK a entraîné des valeurs variables de MBEC d’E. coli entre les dispositifs, mais l’eau de Javel a démontré des valeurs de MBEC reproductibles pour les espèces et les dispositifs. Cette étude fournit une méthode de puits profonds à haut débit pour la culture de plus grandes quantités de biofilms sur des dispositifs en polypropylène pour les études en aval nécessitant des quantités plus élevées de biofilm statique.

Ce protocole présente une méthodologie pour effectuer des mesures de la croissance du biofilm et de la biomasse à l’aide de dispositifs de plaque de PCR de puits profonds auto-assemblés pour le criblage statique de biofilm à couvercle fixe à 96 puits à haut débit.

Génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques PCR

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

L’objectif de cette procédure est de comparer le dispositif de biofilm à couvercle de cheville standard à un dispositif de biofilm de puits profond en polypropylène par coloration violette cristalline et tests de sensibilité aux antimicrobiens. Un dispositif de biofilm à couvercle de cheville standard a 96 chevilles et s’adapte sur une plaque de microtitrage standard de 96 puits permettant des expériences de biofilm à haut débit. Le couvercle de la cheville fournit une surface pour la croissance du biofilm et les biofilms cultivés sur les chevilles peuvent être analysés plus en détail dans des expériences en aval.Cependant, les plaques utilisent un volume maximal de 200 microlitres, ce qui rend plus difficile l’étude de la formation de biofilm et de la biomasse à l’aide d’expériences qui exigent de plus grandes quantités de biofilm. Ici, nous décrivons le dispositif de biofilm de puits profond pour la culture de biofilms statiques. Le dispositif de biofilm de puits profond utilise une plaque de microtitrage de puits de 96 puits de profondeur équipée d’une plaque de PCR semi-jupe de 96 puits comme couvercle de cheville.Cette méthode permet d’obtenir un volume de plaque maximal de 750 microlitres, fournit plus de surface de cheville pour la croissance du biofilm et est moins coûteuse que le dispositif de biofilm standard. Nous décrirons et comparerons les protocoles de coloration violette cristalline des biofilms pour déterminer la biomasse du biofilm, ainsi que la détermination de la concentration minimale d’éradication du biofilm, également connue sous le nom de MBEC. Vous trouverez un aperçu schématique de l’expérience qui sera décrite.Striez les souches bactériennes souhaitées d’un bouillon cryoconservé directement sur une plaque de gélose nutritive. Incuber des plaques de gélose pendant la nuit dans des conditions de contrainte optimales. Le lendemain, inoculez une seule colonie dans cinq millilitres de milieux de croissance et cultivez des cultures dans un incubateur pendant la nuit.Les plaques de biofilm seront remplies comme indiqué. Remplissez les puits extérieurs avec 750 microlitres d’eau stérile et les puits de contrôle négatif avec 750 microlitres de milieux de croissance stériles. Remplissez les puits restants avec 675 microlitres de milieux de croissance stériles.Normaliser les cultures pendant la nuit à une densité optique de 600 nanomètres de 1,0. Créez une série de dilution décuplée jusqu’à ce qu’une dilution de 10 à moins trois soit atteinte. Puits de milieu inoculés avec la culture diluée de 10 à moins trois pour une dilution bactérienne finale de 10 à moins quatre et le volume total final dans le puits de 750 microlitres.Insérez soigneusement le couvercle de la cheville dans la plaque de biofilm. Incuber des plaques dans des conditions de déformation optimales avec une secousse maximale de 160 tr / min pendant 24 heures. Retirez soigneusement le couvercle de la cheville de la plaque de croissance du biofilm et rincez les biofilms dans une nouvelle plaque de puits profond remplie de 800 microlitres de PBS stérile par puits.Transférer les couvercles de cheville dans une nouvelle plaque de puits profonde contenant 800 microlitres par puits de 0,1% de poids par volume cristal violet et laisser tacher pendant cinq minutes. Rincez à nouveau les couvercles dans une plaque de puits fraîche et profonde remplie de PBS pour éliminer l’excès de tache. Après avoir laissé sécher les couvercles pendant 10 minutes dans une armoire de biosécurité, détachez les chevilles dans une plaque de puits profonde remplie de 800 microlitres d’acide ascétique à 30% par puits pendant cinq minutes.Retirez le couvercle de la cheville et mélangez bien pour répartir uniformément la tache. Transférez 200 microlitres du dispositif de biofilm de puits profond dans une plaque de microtitrage standard de 96 puits et lisez la densité optique à 550 nanomètres. Les plaques de provocation antimicrobienne seront préparées comme indiqué.Remplissez les puits extérieurs avec 750 microlitres d’eau stérile et les puits de contrôle positif et négatif avec 750 microlitres de milieux de croissance. Remplissez les puits restants avec 750 microlitres de la série de dilution antimicrobienne souhaitée. Retirez soigneusement le couvercle de la cheville de l’appareil et rincez dans une plaque de puits profonde stérile avec 800 microlitres par puits de PBS.Transférer le couvercle de la cheville sur la plaque de provocation antimicrobienne et incuber pendant la période d’exposition souhaitée. Retirer de manière aseptique les couvercles de cheville de la plaque d’exposition aux antimicrobiens et rincer dans une plaque stérile remplie de PBS profondément. Retirez le couvercle de la cheville du PBS et transférez-le dans une nouvelle plaque de puits profond contenant 750 microlitres de milieu de récupération par puits.Sonicer la plaque dans un bain-marie sonique pendant 30 minutes. Retirez le couvercle de la cheville et remplacez-le par un couvercle de plaque de microtitrage plat standard non attaché pour éviter toute contamination. Incuber dans des conditions de déformation optimales pendant la nuit.Le lendemain, transférez 200 microlitres de la plaque de puits profond vers une plaque de microtitrage standard et lisez la densité optique à 600 nanomètres. La coloration violette cristalline est une méthode efficace et largement utilisée pour approximer la biomasse des biofilms bactériens. La coloration violette cristalline des dispositifs de puits standard et profonds a montré que les deux espèces bactériennes produisaient beaucoup plus de biomasse sur le dispositif de puits profond par rapport au dispositif standard, Escherichia coli formant 2,1 fois plus de biomasse par rapport au dispositif de biofilm standard et Pseudomonas aeruginosa formant 4,1 fois plus de biomasse.Ces résultats concordaient avec notre hypothèse selon laquelle l’augmentation de la surface du dispositif de biofilm de puits profond permettrait une accumulation accrue de biomasse. Malgré une plus grande variabilité dans les valeurs techniques de réplication des gènes pour les deux souches poussant sur le dispositif de puits profond, aucune différence statistiquement significative pour les répliques biologiques de l’une ou l’autre espèce n’a été notée en utilisant l’ANOVA bidirectionnelle par paires ou le test T de l’étudiant avec des valeurs P supérieures à 0,05. Cette découverte montre que la formation de biofilm par les dispositifs de puits profonds forme des biofilms reproductibles similaires à ceux des dispositifs standard.Nos résultats après avoir normalisé la biomasse du biofilm pour le volume et la surface du piquet entre les dispositifs de puits standard et profonds ont indiqué une préférence de matériau légère mais significative entre les deux espèces bactériennes testées. Sur le dispositif de puits profond en polypropylène, Pseudomonas aeruginosa a démontré une augmentation relative de 1,4 fois de la formation de biomasse et Escherichia coli a démontré une diminution relative de 1,52 fois de la formation de biomasse avec l’effet inverse observé sur le dispositif standard en polystyrène. Cette différence dans la préférence des espèces bactériennes pour le matériau de cheville de dispositif de biofilm indique que les résultats ne peuvent pas être comparés entre les dispositifs de biofilm.Le défi antimicrobien des biofilms de 24 heures a été testé en utilisant le composé d’ammonium quaternaire chlorure de benzalkonium qui est connu pour être un inhibiteur efficace de la formation de biofilm bactérien, mais un antimicrobien moins efficace pour l’éradication du biofilm. Nos résultats ont montré que les valeurs BZK BMEC obtenues à partir du dispositif de biofilm de puits profond ont été multipliées par six en moyenne pour Escherichia coli et par huit pour Pseudomonas aeruginosa par rapport à la croissance sur le dispositif de biofilm standard. Les résultats de BZK MBEC étaient plus variables que prévu, car il s’agit d’un antimicrobien moins efficace pour l’éradication du biofilm et ont entraîné une fourchette des valeurs de MBEC d’Escherichia coli sur les deux dispositifs en raison de quelques chevilles de biofilm aberrantes qui ont survécu à des concentrations plus élevées.Nous avons également comparé l’eau de Javel désinfectante, qui est connue pour être un antimicrobien très efficace pour l’éradication du biofilm bactérien. L’eau de Javel a démontré une valeur MBEC légèrement supérieure lorsqu’elle a été testée dans le dispositif standard par rapport au dispositif de puits profond pour les deux espèces, ce qui a entraîné une multiplication par quatre d’Escherichia coli et une multiplication par deux de Pseudomonas aeruginosa respectivement. Cependant, ces différences se situaient dans la gamme d’erreurs reproductibles entre les dispositifs et ont démontré beaucoup moins de variabilité que le BZK, confirmant que l’eau de Javel était un antimicrobien plus efficace pour l’éradication du biofilm.Une limitation majeure de chaque dispositif de biofilm serait la composition plastique différente des chevilles et la variabilité qui en résulte dans l’adhérence et la formation de biomasse de différentes espèces bactériennes à ces surfaces. De plus, les interactions chimiques et les compatibilités entre les différents antimicrobiens et le matériau de cheville en plastique doivent être prises en compte avant d’exécuter le protocole décrit. En conclusion, ce protocole et les résultats de nos comparaisons de biomasse sur les puits profonds et les dispositifs de biofilm standard montrent que les deux sont capables de cultiver des biofilms robustes d’Escherichia coli et de Pseudomonas aeruginosa avec le dispositif de puits profond fournissant beaucoup plus de biomasse par surface de piquet que le dispositif standard.Le dispositif de biofilm de puits profonds offre une alternative viable et abordable pour la culture statique et à haut débit de biofilm et les études de criblage qui nécessitent de plus grandes quantités de biofilm pour l’analyse en aval. En raison des différences de composition des matières plastiques entre chaque dispositif, les valeurs de biomasse de biofilm teintée CV et de MBEC ne peuvent pas être directement comparées entre les dispositifs. Cependant, si les expériences sont systématiquement menées sur le même dispositif, les résultats obtenus entre les isolats et les antimicrobiens sont comparables.Le dispositif de biofilm de puits profond est recommandé pour les laboratoires qui souhaitent étudier les biofilms dans des essais à haut débit utilisant des matériaux à faible coût.

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