Name: Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Découvrez la technique d'injection intratibiale de cellules d'ostéosarcome pour générer des modèles murins orthotopiques avec métastases pulmonaires. Cette méthode reproduit fidèlement la progression tumorale clinique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été soutenue par des subventions de (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 et 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 et 82174408).

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité de bien-être animal de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Des souris atymiques BALB/c mâles de quatre semaines ont été acclimatées pendant une semaine avant la chirurgie pour l’injection orthotopique de cellules d’ostéosarcome. Les souris ont été logées dans des cages à souris ventilées individuellement avec cinq souris par cage dans un cycle clair/sombre de 12 heures avec un accès ad libitum à l’alimentation SPF et à l’eau stérile.
1. Préparation des cellules
<ol><li>Le jour de l’injection de cellules d’ostéosarcome (143B-Luciférase), lavez 80% à 90% des cellules confluentes cultivées dans un plat de culture cellulaire de 10 cm deux fois avec du PBS (pH 7,4) et essayez avec 1,5 mL de trypsine à 0,25% pendant 3 min. Ensuite, ajoutez 6 mL de milieu MEM contenant 10 % de sérum pour éteindre la trypsine et recueillir les cellules dans un tube centrifuge de 15 mL. REMARQUE: La lignée cellulaire 143B-Luciférase est obtenue à partir du transfect de la lignée cellulaire 143B avec le vecteur pLV-luciférase23.</li>
	<li>Aspirer 20 μL de suspension cellulaire dans la chambre de la plaque de comptage cellulaire et calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatique (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Centrifugez les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension la pastille de la cellule dans une matrice de membrane basale de 8,5 mg/mL (voir Tableau des matériaux) jusqu’à une concentration finale de 2 x 107 cellules/mL.</li>
	<li>En gardant les cellules sur la glace, amenez-les à la salle de chirurgie. Les cellules doivent être utilisées dans les 2 h. REMARQUE: Pour éviter des doses d’injection inexactes (par exemple, en raison de l’espace mort dans les seringues), une suspension cellulaire supplémentaire est préparée (généralement deux fois le volume requis de suspension cellulaire). La matrice de la membrane basale est maintenue sur la glace tout le temps car elle a une propriété de coagulation supérieure à la température ambiante24.</li>
</ol>2. Chirurgie pour injection orthotopique des cellules d’ostéosarcome
REMARQUE : Les outils chirurgicaux sont illustrés à la figure 1.
<ol><li>Les souris ont été élevées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Toutes les procédures ont été effectuées dans une armoire aseptique avec des outils stériles.</li>
	<li>Anesthésier les souris en les exposant à 2% d’isoflurane et 98% d’oxygène (débit d’oxygène, 2 L/min).</li>
	<li>Appliquez une petite quantité de pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. REMARQUE: Effectuez toute la procédure dans un endroit bien ventilé. Avant l’injection de cellules d’ostéosarcome, assurez-vous que chaque souris est sous anesthésie profonde par un pincement d’orteil; si la souris a encore des réponses, telles que twitch ou jerk, attendez longtemps jusqu’à ce que les réponses ci-dessus disparaissent.</li>
	<li>Gardez chaque souris en position couchée. Tenez la cheville de la souris à l’aide du pouce et de l’index et désinfectez le site d’injection du tibia avec un écouvillon à 70% d’éthanol. REMARQUE: Pour tenir fermement la cheville de la souris, le bout des doigts du pouce et de l’index est d’une grande importance pour les procédures ultérieures.</li>
	<li>Faites pivoter l’articulation de la cheville de chaque souris vers l’extérieur pour déplacer le tibia et le péroné, et pliez l’articulation du genou dans une position appropriée jusqu’à ce que le plateau du tibia proximal (le haut du tibia) soit clairement visible à travers la peau (Figure 2A).</li>
	<li>Fixez l’aiguille à une seringue de 1 mL et pointez la pointe de l’aiguille vers le site d’injection. Assurez-vous que l’aiguille de la seringue est parallèle au long axe du tibia.<ol>
<li>Insérer par voie percutanée l’aiguille à travers ou à côté du ligament rotulien lorsqu’elle traverse la peau / capsule articulaire; th0en, faire pivoter la seringue (1/2 à 3/4 cercle) pour percer un trou à travers la plate-forme du tibia vers l’extrémité distale du tibia (cavité médullaire) pour l’injection de cellules d’ostéosarcome avec une seringue à micro-volume (Figure 2B, C). REMARQUE: La rotation simultanée du tibia peut être ressentie lors du perçage si la pointe de l’aiguille est précise. Assurez-vous que l’aiguillette avance avec la rotation de la seringue plutôt que d’être directement poussée vers l’avant jusqu’à ce qu’environ la moitié de l’aiguille soit dans le tibia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vérifiez si l’aiguille de la seringue a fait un mouvement proéminent dans le canal médullaire pour assurer le succès du forage. REMARQUE: Effectuez un examen aux rayons X (voir tableau des matériaux) pour confirmer la position correcte de l’aiguille et recueillir les images.</li>
	<li>Chargez la suspension de cellules d’ostéosarcome 143B (à partir de l’étape 1.5) dans une seringue à micro-volume et remplacez la seringue de 1 mL dans le tibia par la seringue à micro-volume de 143B chargée de cellules (Figure 2D). Injecter lentement ~10 μL (ignorer la solution préexistante dans l’aiguille) de suspension de cellules 143B dans le tibia de chaque souris athymique (environ 2 x 105 cellules) sans appliquer de pression élevée.</li>
	<li>Appuyez sur le site d’injection avec un coton-tige pendant 20 à 30 s lorsque la seringue en micro-volume est retirée.</li>
	<li>Remettez chaque souris dans une cage propre et surveillez de près jusqu’à ce que la souris soit complètement remise de l’anesthésie (environ 10 min).</li>
	<li>Surveiller la croissance tumorale in vivo à l’aide d’un système d’imagerie par rayons X. Mesurez le diamètre plus long (a) et le diamètre court (b) de la masse cancéreuse chaque semaine avec un étrier pour le calcul du volume tumoral (V): V = 1/2 x a x b2. REMARQUE: Anesthésiez les souris en les exposant à 2% d’isoflurane et à 98% d’oxygène. Les souris ont été anesthésiées pour l’imagerie par rayons X. L’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome marquées par des protéines luciférases ou fluorescentes permet de suivre les lésions primaires et métastatiques de l’ostéosarcome. REMARQUE: Les critères d’évaluation sans cruauté des souris atteintes d’ostéosarcome dû à la croissance tumorale du genou et des métastases pulmonaires étaient basés sur les critères suivants: (1) score d’état corporel, (2) seuil de perte de poids de 20%, (3) diamètre maximal moyen des tumeurs de 2 cm ou (4) comportement animal sévèrement limité.</li>
</ol>3. Examen pathologique (prélèvement d’un échantillon d’ostéosarcome métastatique primaire et pulmonaire pour analyse)
<ol><li>Six semaines après l’injection de cellules d’ostéosarcome, sacrifier les souris par luxation cervicale après les avoir exposées à l’inhalation de CO2 .</li>
	<li>Gardez la souris en position couchée et étirez les deux membres postérieurs.</li>
	<li>Séparez toutes les jambes porteuses d’ostéosarcome de la région inguinale. REMARQUE: Assurez-vous que toutes les jambes sont séparées du même site anatomique.</li>
	<li>Préparer l’échantillon histologique de jambes porteuses d’ostéosarcome en enlevant la peau, les muscles et les pieds, puis fixer l’échantillon de chaque souris dans un tube de 50 mL avec une solution de formol de 20 mL (10%) pendant 24 h, suivie d’une décalcification dans une solution d’EDTA à 10% pendant 14 jours avec un changement occasionnel de tampon.</li>
	<li>Incorporer l’échantillon dans de la paraffine et préparer des sections pour l’examen histologique à la suite de travaux publiés précédemment25.</li>
	<li>Séparez doucement les poumons et mettez-les dans un tube de 50 mL rempli de 20 mL de solution de formol (10%). Après 24 h, transférer les poumons de chaque souris dans un tube de 15 mL contenant de l’éthanol à 70 %. Incorporer les poumons dans la paraffine pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) et le test d’immunohistochimie25.</li>
</ol>

<ol><li>Bielack, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+in+high-grade+osteosarcoma+of+the+extremities+or+trunk%3A+an+analysis+of+1%2C702+patients+treated+on+neoadjuvant+cooperative+osteosarcoma+study+group+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).</li>
<li>Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+incidence+and+survival+rates+from+1973+to+2004%3A+data+from+the+Surveillance%2C+Epidemiology%2C+and+End+Results+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.</a> Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+safety+comparison+of+first-line+chemotherapeutic+agents+%28high-dose+methotrexate%2C+doxorubicin%2C+cisplatin%2C+and+ifosfamide%29+for+osteosarcoma%3A+a+network+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).</li>
<li>Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+considerations+for+osteosarcoma+metastatic+at+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation.</a> Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).</li>
<li>Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+adolescents+and+adults%3A+survival+analysis+with+and+without+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases.</a> Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).</li>
<li>Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+mouse+models+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Commonly used mouse models of osteosarcoma.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+the+post+genome+era%3A+Preclinical+models+and+approaches+to+identify+tractable+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+immunology+and+immunotherapy+of+canine+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).</li>
<li>Cobb, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+osteosarcoma+in+the+rat+as+a+model+for+osteosarcoma+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man.</a> British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+osteosarcoma%2C+dependent+on+p53+loss+and+potentiated+by+loss+of+Rb%2C+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease.</a> Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).</li>
<li>Entz-Werlé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+apc%3Btwist+double-mutant+mice%3A+a+new+model+of+spontaneous+osteosarcoma+that+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease.</a> Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+for+osteosarcoma+in+the+mouse%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).</li>
<li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+causes+direct+pulmonary+seeding+of+osteosarcoma+cells+and+is+not+a+spontaneous+model+of+metastasis%3A+A+mouse+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+reproducible+osteosarcoma+rat+model+using+orthotopic+implantation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique.</a> Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected].</a> Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).</li>
<li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing%27s+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).</li>
<li>Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+of+the+proximal+tibia+in+a+dog+6+years+after+tibial+tuberosity+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement.</a> The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).</li>
<li>Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for human osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantharidin+inhibits+osteosarcoma+proliferation+and+metastasis+by+directly+targeting+miR-214-3p%2FDKK3+axis+to+inactivate+%CE%B2-catenin+nuclear+translocation+and+LEF1+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyllin+I+suppresses+human+osteosarcoma+growth+by+inactivation+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primary+bone+tumors+and+bone+metastasis+with+solid+tumor+graft+implantation+into+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L’injection orthotopique de cellules d’ostéosarcome est un modèle idéal pour étudier la fonction et le mécanisme de facteurs spécifiques dans la cancérogenèse et le développement de l’ostéosarcome afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Pour éviter les différences dans la croissance tumorale, la plupart des cellules actives d’ostéosarcome à 80% -90% confluent avec le même nombre sont soigneusement injectées dans le tibia de chaque souris, et le temps de trypsinisation cellulaire est strictement contrôlé sans affecter ...

L’ostéosarcome est le cancer primitif des os le plus fréquent chez les enfants et les adolescents 1,2, qui s’infiltre principalement dans les tissus environnants et même métastase dans les poumons lorsque les patients sont diagnostiqués. Les métastases pulmonaires sont le principal défi pour le traitement de l’ostéosarcome, et le taux de survie à cinq ans des patients atteints d’ostéosarcome atteints de métastases pulmonaires reste aussi bas que 20% -30%3,4,5. Cependant, le taux de survie à cinq ans de l’ostéosarcome primaire a été augmenté à environ 70% depuis les années 1970 en raison de l’introduction de la chimiothérapie6. Par conséquent, il est urgent de comprendre le mécanisme fondamental de la cancérogenèse de l’ostéosarcome et des métastases pulmonaires pour développer de nouvelles thérapies. L’application de modèles murins qui imitent le mieux la progression de l’ostéosarcome chez l’homme est d’une grande importance7.
Les modèles animaux d’ostéosarcome sont générés par le génie génétique spontané et induit, la transplantation et d’autres techniques. Le modèle d’ostéosarcome spontané est rarement utilisé en raison du long temps de formation de la tumeur, du taux d’occurrence tumorale incohérent, de la faible morbidité et de la faible stabilité 8,9. Bien que le modèle d’ostéosarcome induit soit plus accessible à obtenir que l’ostéosarcome spontané, l’application du modèle d’ostéosarcome induit est limitée car le facteur inducteur affectera le microenvironnement, la pathogenèse et les caractéristiques pathologiques de l’ostéosarcome10. Les modèles transgéniques aident à comprendre la pathogenèse des cancers puisqu’ils peuvent mieux simuler les environnements physiologiques et pathologiques humains; cependant, les modèles animaux transgéniques ont également leurs limites en raison de la difficulté, du long terme et du coût élevé de la modification transgénique. De plus, même dans les modèles animaux transgéniques les plus largement acceptés générés par la modification du gène p53 et Rb, seulement 13,6% du sarcome s’est produit dans les quatre os des membres11,12.
La transplantation est l’une des méthodes de production de modèles de cancer métastatique primaire et distant les plus couramment utilisées ces dernières années en raison de sa manœuvre simple, de son taux de formation de tumeurs stable et de sa meilleure homogénéité13. La transplantation comprend la transplantation hétérotopique et la transplantation orthotopique selon les sites de transplantation. Dans la transplantation hétérotopique d’ostéosarcome, les cellules d’ostéosarcome sont injectées à l’extérieur des sites primaires d’ostéosarcome (os) des animaux, généralement sous la peau, par voie sous-cutanée14. Bien que la transplantation hétérotopique soit simple sans qu’il soit nécessaire d’effectuer une intervention chirurgicale chez les animaux, les sites où les cellules d’ostéosarcome sont injectées ne représentent pas le microenvironnement réel de l’ostéosarcome humain. La transplantation orthotopique d’ostéosarcome se produit lorsque les cellules de l’ostéosarcome sont injectées dans les os des animaux, tels que le tibia15,16. Par rapport aux greffes hétérotopiques, les greffes d’ostéosarcome orthotopique se caractérisent par une courte période d’incubation, une croissance rapide et une forte nature érosive; par conséquent, ce sont des modèles animaux idéaux pour les études liées à l’ostéosarcome17.
Les animaux les plus couramment utilisés sont les souris, les chiens et les poissons-zèbres18,19. Le modèle spontané de l’ostéosarcome est généralement utilisé chez les chiens, car l’ostéosarcome est l’une des tumeurs les plus courantes chez les chiens. Cependant, l’application de ce modèle est limitée en raison du long temps de formation de la tumeur, du faible taux de tumorigenèse, de la faible homogénéité et de la stabilité. Les poissons-zèbres sont souvent utilisés pour construire des modèles tumoraux transgéniques ou knockout en raison de leur reproduction rapide20. Mais les gènes du poisson-zèbre sont différents des gènes humains, de sorte que leurs applications sont limitées.
Ce travail décrit les procédures détaillées, les précautions et les images représentatives pour produire l’ostéosarcome primaire dans le tibia avec métastases pulmonaires par injection intratibia de cellules d’ostéosarcome chez des souris atymiques. Cette méthode a été appliquée pour créer l’ostéosarcome primaire dans le tibia de la souris pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutique, qui a montré une reproductibilité élevée21,22.

<table><tbody><tr><td>Compteur automatique de cellules</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Comptage de cellules</td></tr><tr><td>Machine d’anesthésie</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>L’équipement des souris anesthésiques</td></tr><tr><td>Souris athymiques BALB / c</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>/</td><td>animal</td></tr><tr><td>Matrice de membrane basale</td><td>Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>356234, BD, Matrigel</td><td>re-suspende cellules</td></tr> Système <tr><td>d’imagerie par bioluminescence</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>suit la croissance tumorale et les métastases pulmonaires, si la cellule d’injection est marquée par luciférase</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger (15 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp ; 430790, Corning</td><td>Centrifuge les cellules</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Anesthésie souris</td></tr><tr><td>MEM média</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Seringue de micro-volume</td><td>Shanghai haute industrie et commerce des pigeons Co., Ltd</td><td>0-50 &mu ; L</td><td>Injecter des cellules précises dans le tibia</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>laver les cellules humaines de l’ostéosarcome</td></tr><tr><td>Seringues de 1 ml</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>forage</td></tr><tr><td>143B lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td> lignée <td>cellulaire d’ostéosarcome</td></tr><tr><td>Trypsine (0,25 %)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>traitement des cellules à la trypsine</td></tr><tr><td>Bleu</td><td>trypan Beyotime Biotechnology</td><td>ST798</td><td>Coloration des cellules pour évaluer le vecteur d’activité</td></tr><tr><td>(pLV-luciférase)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plasmide</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027,Thermo fisher</td><td>Réactif de transfection plasmidique</td></tr><tr><td>Imagerie par rayons X système</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>Des images radiographiques ont été obtenues pour détecter la croissance tumorale</td></tr></tbody></table>

injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

L’ostéosarcome est le cancer primitif des os le plus fréquent chez les enfants et les adolescents, les poumons étant le site métastatique le plus courant. Le taux de survie à cinq ans des patients atteints d’ostéosarcome présentant des métastases pulmonaires est inférieur à 30%. Par conséquent, l’utilisation de modèles murins imitant le développement de l’ostéosarcome chez l’homme est d’une grande importance pour comprendre le mécanisme fondamental de la cancérogenèse de l’ostéosarcome et des métastases pulmonaires afin de développer de nouvelles thérapies. Ici, des procédures détaillées sont rapportées pour générer les modèles murins primaires d’ostéosarcome et de métastases pulmonaires par injection intratibia de cellules d’ostéosarcome. Combinés au système d’imagerie en direct par bioluminescence ou rayons X, ces modèles murins vivants sont utilisés pour surveiller et quantifier la croissance et les métastases de l’ostéosarcome. Pour établir ce modèle, une matrice de membrane basale contenant des cellules d’ostéosarcome a été chargée dans une seringue à micro-volume et injectée dans un tibia de chaque souris atymique après avoir été anesthésiée. Les souris ont été sacrifiées lorsque l’ostéosarcome primaire a atteint la limite de taille dans le protocole approuvé par l’IACUC. Les jambes porteuses d’ostéosarcome et les poumons présentant des lésions de métastases ont été séparés. Ces modèles se caractérisent par une courte période d’incubation, une croissance rapide, des lésions sévères et une sensibilité dans la surveillance du développement des lésions métastatiques primaires et pulmonaires. Par conséquent, ce sont des modèles idéaux pour explorer les fonctions et les mécanismes de facteurs spécifiques dans la cancérogenèse de l’ostéosarcome et les métastases pulmonaires, le microenvironnement tumoral et évaluer l’efficacité thérapeutique in vivo.

Le succès de l’ostéosarcome orthotopique (primaire) et des modèles pulmonaires métastatiques dépend de l’injection orthotopique précise de cellules d’ostéosarcome. Ici, un modèle d’ostéosarcome orthotopique (primaire) par injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome a été développé avec succès. La figure 3A montre une souris représentative porteuse d’ostéosarcome orthotopique (primaire), et la figure 3B montre un ostéosarcome orthotopique isolé (pr...

Le présent protocole décrit l’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins portant des lésions d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires.

Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Ce protocole décrit la technique permettant de générer des modèles murins portant l’ostéosarcome primaire et les lésions de métastases pulmonaires. Par injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome, ce modèle imite au mieux les caractéristiques de développement clinique de l’ostéosarcome tumoral. Un nombre précis de cellules d’ostéosarcome sont directement injectées dans le tibia à l’aide d’une seringue en microvolume, ce qui permet d’obtenir des taux de formation de tumeurs et des volumes tumoraux identiques.Le jour de l’injection de cellules d’ostéosarcome, lavez les cellules deux fois avec PBS. Trypsiniser les cellules avec 1,5 millilitres de 0,25% de trypsine pendant trois minutes. Ajoutez ensuite six millilitres de milieux MEM contenant 10 % de sérum.Recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Aspirer 20 microlitres de suspension cellulaire dans la chambre de la plaque de comptage cellulaire et calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatique. Centrifuger les cellules à 800 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.Aspirer le surnageant avec une pipette, remettre en suspension la pastille de cellule dans une matrice de membrane basale de 8,5 milligrammes par millilitre et les placer sur de la glace. Placez la souris en position couchée. Tenez la cheville de la souris à l’aide du pouce et de l’index et désinfectez le site d’injection du tibia avec un écouvillon à 70% d’éthanol.Faites pivoter l’articulation de la cheville de chaque souris vers l’extérieur pour déplacer le tibia et le péroné, et pliez l’articulation du genou dans une position appropriée jusqu’à ce que le plateau du tibia proximal soit visible à travers la peau. Fixez l’aiguille à une seringue d’un millilitre et pointez la pointe de l’aiguille vers le site d’injection, parallèlement à l’axe du tibia. Insérez l’aiguille par voie percutanée pour percer un trou à travers la plate-forme du tibia vers l’extrémité distale du tibia.Chargez la suspension de cellules d’ostéosarcome précédemment placée sur de la glace dans une seringue en microvolume et remplacez la seringue d’un millilitre dans le tibia par la seringue à microvolume chargée de cellules d’ostéosarcome. Injecter lentement environ 10 microlitres de suspension de cellules d’ostéosarcome dans le tibia de chaque souris atymique sans appliquer beaucoup de pression. Retirez ensuite la seringue à microvolume du site d’injection et appuyez sur le site avec le coton-tige pendant environ 30 secondes.Replacez la souris dans une cage propre et observez sa récupération pendant 10 minutes. Cette figure représente le modèle murin atteint d’ostéosarcome orthotopique développé à partir de l’injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome et sa forme isolée. Une augmentation progressive du volume tumoral est observée chaque semaine.Les images radiographiques obtenues de la première à la sixième semaine après l’injection de cellules d’ostéosarcome marquées par la luciférase ont montré une augmentation progressive du volume. De plus, l’image obtenue après l’injection dans le tibia de la souris a montré une croissance de l’ostéosarcome orthotopique in vivo. Les métastases pulmonaires causées par l’injection intratibiale des cellules de l’ostéosarcome ont été suivies avec succès in vivo à l’aide d’un système d’imagerie en direct par bioluminescence.L’observation sous stéréomicroscope a révélé des colonies métastatiques dans les tissus pulmonaires isolés. La coloration HE sur les tissus pulmonaires incrustés de paraffine a montré des lésions métastatiques. L’aiguille doit être insérée par voie percutanée dans la capsule articulaire à travers le ligament rotulien pour percer un trou à travers la plate-forme du tibia vers le tibia numérique en faisant pivoter la seringue.

intratibial-osteosarcoma-cell-injection-to-generate-orthotopic

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Le nouveau protocole indiqué dans la présente étude permet une détection sélective des métastases pulmonaires à la résolution cellule unique chez la souris par...

Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em&gt; In situ</emPerfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tag cellules tumorales

Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier la métastase du cancer de l'os. Dans ce protocole, nous allons décrire deux méthodes courantes de inoculation de la tumeur pour les études de métastases osseuses et décrire brièvement quelques-unes des analyses utilisés pour surveiller et quantifier ces modèles.

Modèles de métastases osseuses

La vidéo montre la technique d’inoculation orthotopique du cancer du sein dans un modèle murin. Cette technique produit un taux élevé de tumorigenèse avec moins de variabilité dans la taille et la forme de la tumeur par rapport à l’injection sous-cutanée ou non chirurgicale.

Injection orthotopique : implantation de cellules cancéreuses spécifiques à un tissu dans une souris adulte

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Ce manuscrit présente en détail la procédure d’injection intra-iliaque dans l’artère iliaque (AII), une technique permettant d’administrer des cellules cancéreuses spécifiquement aux tissus des membres postérieurs, y compris les os, afin d’établir des métastases osseuses expérimentales. Bien qu’initialement établi avec des modèles de tumeurs mammaires, ce protocole peut être facilement étendu à d’autres types de cancer.

Intra-iliaque Artère injection pour la modélisation efficace et sélective des métastases osseuses Microscopique

Ici, nous présentons un protocole pour la génération de pluripotentes induites des cellules souches (CISP) de Syndrome de Li-Fraumeni (LFS) patient dérivée fibroblastes, différenciation de CISP par l’intermédiaire de cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’ostéoblastes et modélisation in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes patient dérivé de LFS.

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

Ici, nous présentons un protocole visant à implanter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, façon invasive et facile à manipuler, moins et ce modèle murin orthotopique breast cancer avec un environnement approprié coussinets adipeux mammaire peut être utilisé pour étudier divers aspects de la cancer.

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

Les modèles de métastases osseuses ne développent pas de métastases uniformément ou avec une incidence de 100%. L’injection directe de cellules tumorales intra-osseuses peut entraîner une embolisation du poumon. Nous présentons notre technique de modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses en utilisant l’implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os, conduisant à une greffe et une croissance reproductibles.

Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Ici, une implantation orthotopique syngénique suivie d’une procédure d’amputation de l’ostéosarcome avec métastases pulmonaires spontanées pouvant être utilisée pour l’investigation préclinique de la biologie des métastases et le développement de nouvelles thérapies est décrite.

Un modèle de rat Sprague Dawley d’ostéosarcome orthotopique syngénique avec amputation pour contrôler le taux de métastases

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Le présent protocole décrit la méthode d’établissement d’un modèle murin de xénogreffe dérivée d’un patient (PDX) à partir de tissu d’ostéosarcome humain.

Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe dérivé d’un patient avec des tissus d’ostéosarcome humain

Découvrez la technique d'injection intratibiale de cellules d'ostéosarcome pour générer des modèles murins orthotopiques avec métastases pulmonaires. Cette méthode reproduit fidèlement la progression tumorale clinique.

Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal

Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires

Explorer plus de vidéos