Name: Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez une méthode optogénétique ex vivo pour caractériser l'électrophysiologie synaptique et la plasticité dans des tranches aiguës de cerveau de rongeur. Cette approche permet d'étudier les voies neuronales à longue distance avec une stimulation sélective des axones.

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Ce travail est soutenu par la subvention Wellcome 206401/Z/17/Z. Nous tenons à remercier Zafar Bashir pour son mentorat expert et le Dr Clair Booth pour son assistance technique et ses commentaires sur le manuscrit.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour explorer des projections synaptiques à longue distance très spécifiques en utilisant une combinaison de chirurgie stéréotaxique pour délivrer des AAV codant pour des constructions optogénétiques et d’électrophysiologie dans des coupes cérébrales aiguës (Figure 1). Ensemble, ces techniques offrent des outils pour caractériser la physiologie et la plasticité des circuits cérébraux avec une grande précision dans des voies à longue portée et anat...

Comprendre la physiologie des synapses et comment elles subissent des changements plastiques est fondamental pour comprendre comment les réseaux cérébraux fonctionnent dans le cerveau sain1, et comment ils fonctionnent mal dans les troubles cérébraux. L’utilisation de tranches cérébrales ex vivo aiguës permet d’enregistrer l’activité électrique des synapses à partir de neurones individuels avec un rapport signal sur bruit élevé à l’aide d’enregistrements patch-clamp à cellules entières. Le contrôle du potentiel membranaire et la manipulation pharmacologique directe permettent d’isoler les sous-types de récepteurs. Ces enregistrements peuvent être réalisés avec une spécificité exquise pour identifier le neurone post-synaptique, y compris la position laminaire et sous-régionale2, la morphologie cellulaire3, la présence de marqueurs moléculaires4, ses projections afférentes5, ou même s’il était récemment actif6.
Atteindre la spécificité des entrées pré-synaptiques est, cependant, un peu plus difficile. La méthode conventionnelle a utilisé des électrodes de stimulation pour exciter les axones qui courent dans une lame particulière. Un exemple de ceci est dans l’hippocampe où la stimulation locale dans la strate radiane active les synapses qui se projettent du CA3 au sous-champ CA17. Dans ce cas, la spécificité présynaptique est atteinte car l’entrée CA3 représente la seule entrée excitatrice située dans la strate radiale qui se projette vers les cellules pyramidales CA18. Ce haut degré de spécificité d’entrée réalisable avec l’activation électrique présynaptique conventionnelle des axones CA3-CA1 est cependant une exception qui se reflète dans l’étude intense à laquelle cette synapse a été soumise. Dans d’autres régions du cerveau, les axones de plusieurs voies afférentes coexistent dans la même lame, par exemple dans la couche 1 du néocortex9, rendant ainsi impossible la stimulation présynaptique spécifique à l’entrée avec des électrodes de stimulation conventionnelles. Ceci est problématique car différentes entrées synaptiques peuvent avoir des propriétés physiologiques divergentes; Par conséquent, leur co-stimulation peut conduire à une mauvaise caractérisation de la physiologie synaptique.
L’avènement de l’optogénétique, le codage génétique de protéines membranaires photosensibles (opsines) telles que la channelrhodopsine-2 (ChR2), a permis une vaste expansion des possibilités d’étude des projections synaptiques isolées entre les régions du cerveau10,11. Nous décrivons ici une solution généralisable et peu coûteuse pour étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme. Les constructions optogénétiques sont délivrées de manière très spécifique à l’aide de vecteurs viraux permettant un contrôle extrêmement précis de la région pré-synaptique d’intérêt. Les projections efférentes exprimeront le canal activé par la lumière permettant l’activation de ces fibres dans une région cible. Ainsi, les voies anatomiquement diffuses à longue portée qui ne peuvent pas être activées indépendamment par une stimulation électrique traditionnelle et non spécifique peuvent être étudiées.
Nous décrivons, à titre d’exemple, la transduction du cortex préfrontal médian (mPFC) avec des virus adéno-associés (AAV) codant pour les opsines des canaux cationiques excitateurs. Nous décrivons ensuite la préparation de tranches aiguës à partir du cortex entorhinal latéral (LEC), les enregistrements patch-clamp des neurones pyramidaux LEC de couche 5 et l’activation évoquée par la lumière des projections glutamatergiques mPFC-LEC (Figure 1). Nous décrivons également l’évaluation histologique du site d’injection pour confirmer l’emplacement de la région d’intérêt pré-synaptique et l’identification de la morphologie cellulaire post-synaptique.

<table><tbody><tr><td>Tube de 0,2 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro ; Pipette L</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>plaque SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Valve Luer 3 voies</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>Substrat 3,3&prime ;-Diaminobenzidine (DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine</td><td>Hello Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 4x</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>Titre viral : 3.3x1013</td></tr><tr><td>Lentille achromatique</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>Focalise le spectre visuel et le proche infrarouge</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de paillasse</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilliqué</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Caméra - Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>Gommage chirurgical à la chlorhexidine</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Clippers</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td></tr><tr><td>Collimation lentille de condenseur</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’acquisition de données</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque 500 nm passe-long</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque 600 nm passe-long</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque cube</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Porte-électrode avec port latéral</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’excitation</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>Gel pour les yeux</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau fin</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>Guillotine</td><td>World Precision Instruments</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30 % (p/p)</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre de fluorescence cinématique</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>Pilote de LED</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Pommade à la lidocaïne</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Micro-perceuse</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes</td><td>Sutter instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de micro-injection</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de seringue de micro-injection</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Spécification personnalisée : jauge 33, longueur 15mm, style de pointe 4 - 12&deg ;</td></tr><tr><td>Pousse-seringue de micro-injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Monté bleu LED</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>Monté vert LED</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550Utilisé pour l’imagerie IR réfractée de tranches, l’optique à contraste interférentiel différentiel (DIC) est une autre méthode couramment utilisée</td></tr><tr><td>OCT moyen</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>Température de coupe optimale milieu</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de pince de patch</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ministar</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope recouvertes de poly-L-lysine</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>Ancre à tranche</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Kopf</td><td>Modèle 902</td><td></td></tr><tr><td>Support stéréotaxique pour micro-foret</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Microscope chirurgical</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue pour enregistrement intracellulaire solution</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de tétrodotoxine</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence droit</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Milieu de montage anti-effraction avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Kit ABC-HRP Vector</td><td>Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>Version 2.32</td><td>Logiciel d’acquisition de données</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>solution <td></td><td></td><td></td><td>de coupe de saccharose</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>intracellulaire ?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

L’étude des propriétés physiologiques de synapses spécifiques dans le cerveau et de la façon dont elles subissent des changements plastiques est un défi clé dans les neurosciences modernes. Les techniques électrophysiologiques in vitro traditionnelles utilisent la stimulation électrique pour évoquer la transmission synaptique. Un inconvénient majeur de cette méthode est sa nature non spécifique; Tous les axones de la région de l’électrode stimulante seront activés, ce qui rendra difficile l’attribution d’un effet à une connexion afférente particulière. Ce problème peut être surmonté en remplaçant la stimulation électrique par une stimulation optogénétique. Nous décrivons une méthode pour combiner l’optogénétique avec des enregistrements in vitro patch-clamp. Il s’agit d’un outil puissant pour l’étude de la transmission synaptique basale et de la plasticité synaptique des connexions synaptiques anatomiquement définies avec précision et est applicable à presque toutes les voies du cerveau. Ici, nous décrivons la préparation et la manipulation d’un vecteur viral codant pour la protéine channelrhodopsine pour injection chirurgicale dans une région d’intérêt pré-synaptique (cortex préfrontal médial) dans le cerveau des rongeurs et la fabrication de tranches aiguës de régions cibles en aval (cortex entorhinal latéral). Une procédure détaillée pour combiner des enregistrements patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique à court et à long terme est également présentée. Nous discutons d’exemples d’expériences qui atteignent la spécificité de la voie et de la cellule en combinant l’optogénétique et le marquage cellulaire Cre-dépendant. Enfin, la confirmation histologique de la région d’intérêt pré-synaptique est décrite avec le marquage biocytine de la cellule post-synaptique, afin de permettre une identification plus approfondie de l’emplacement précis et du type de cellule.

Dans ce protocole, nous décrivons comment étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme en utilisant l’administration virale de constructions optogénétiques. Le protocole peut être très facilement adapté à l’étude de presque toutes les connexions à longue distance dans le cerveau. À titre d’exemple, nous décrivons l’injection d’AAV codant pour une opsine dans le mPFC du rat, la préparation de tranches aiguës à partir de LEC, les enregistrements patch-clamp à partir de neurones pyramidaux LEC de couche 5...

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Les constructions optogénétiques livrées par voie virale permettent une caractérisation électrophysiologique détaillée de la physiologie et de la plasticité de synapses spécifiques dans les tranches cérébrales aiguës. Les principaux avantages de l’activation optogénétique des synapses sont la possibilité d’étudier les voies à longue distance et la stimulation sélective des axones qui ne sont pas anatomiquement séparés. La démonstration de la procédure sera effectuée par la Dre Lisa Kinnavane, associée de recherche de notre laboratoire.Pour commencer, chargez une seringue Hamilton dans une pompe à seringue à microinjection fixée à un bras mobile monté sur un cadre stéréotaxique. Ensuite, placez une partie aliquote de cinq microlitres du virus dans une microcentrifugeuse. Faites tourner le tube pendant quelques secondes et pipeter deux microlitres de la préparation virale dans le couvercle du tube.Pour remplir la seringue avec la préparation virale, visualisez la pointe de l’aiguille avec un microscope chirurgical. Ensuite, placez manuellement le bolus du virus à l’extrémité de l’aiguille et retirez le piston de la seringue à l’aide des commandes de la pompe. Réglez le volume d’injection de la pompe à 300 nanolitres et le débit à 100 nanolitres par minute.Faites fonctionner la pompe et confirmez le bon débit en observant la gouttelette du virus à l’extrémité de l’aiguille. Absorbez le virus sur un coton-tige et nettoyez l’aiguille avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, à l’aide des vis de réglage sur le cadre stéréotaxique, naviguez la pointe de l’aiguille jusqu’au bregma et notez les mesures stéréotaxiques observées sur les trois échelles de vernier sur le cadre.Additionnez ou soustrayez ces distances des coordonnées bregma. Faites un trou de bavure à la surface du crâne à l’aide d’une micro-perceuse montée sur le bras stéréotaxique. Insérez l’aiguille dans le cerveau à la coordonnée dorso-ventrale prédéterminée et perfuser un volume prédéterminé de la préparation virale.Après la perfusion, laisser l’aiguille in situ pendant 10 minutes pour permettre la diffusion du bol. Ensuite, retirez l’aiguille et faites fonctionner la pompe pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bloquée. Deux semaines après l’injection virale, euthanasier le rat, disséquer rapidement tout le cerveau et le transférer dans la solution de coupe de saccharose.À l’aide d’une cuillère à café en métal, ramassez le cerveau, jetez l’excès de solution et placez-le sur un papier filtre. À l’aide d’un scalpel, retirez le cervelet et coupez le cerveau dans le plan coronal environ à mi-chemin sur sa longueur. La moitié postérieure est le bloc tissulaire LEC.Retournez le bloc tissulaire et le cerveau restant dans la solution de coupe de saccharose. Ensuite, placez une goutte de colle cyanoacrylate sur une scène de vibratome et étalez-la en une fine couche. Ensuite, à l’aide d’une cuillère à café, choisissez le bloc de tissu LEC et transférez-le sur le patch de colle, de sorte que la coupe coronale antérieure ait adhéré.Installez la scène dans la chambre du tissu vibratome et versez rapidement suffisamment de solution de coupe de saccharose pour submerger le tissu. Après avoir orienté la surface ventrale du bloc tissulaire vers le limbe, coupez des tranches de 350 micromètres d’épaisseur du ventral au dorsal en utilisant une vitesse d’avancement lente de la lame. En règle générale, sept tranches peuvent être obtenues par hémisphère.Transférer les tranches dans la chambre de collecte des tranches. Ensuite, placez la chambre de collecte dans un bain-marie de 34 degrés Celsius pendant une heure avant de revenir à température ambiante. Placez le reste du cerveau dans du paraformaldéhyde pendant 48 heures.Pour l’identification de la cellule cible, placez la tranche dans la chambre d’enregistrement et immobilisez-la à l’aide d’une ancre de tranche. Sous un faible grossissement, à l’aide d’un éclairage infrarouge, naviguez jusqu’à la couche cinq LEC. Ensuite, passez à l’objectif d’immersion dans l’eau à fort grossissement et identifiez les neurones pyramidaux.Marquez la position de la cellule sur le moniteur avec du ruban adhésif. Ensuite, pour former une pince patch à cellules entières, fabriquez une micro-pipette en verre borosilicaté et remplissez-la de solution d’enregistrement intracellulaire. Placez la micro-pipette remplie dans le porte-électrode et appliquez une pression positive en soufflant fort dans un embout buccal relié à l’orifice latéral du porte-électrode.Soulevez l’objectif du microscope de telle sorte qu’un ménisque se forme et insérez l’électrode dans le ménisque jusqu’à ce qu’elle puisse être vue au microscope. Ouvrez la fenêtre Test d’étanchéité et déterminez si la résistance de la pipette est de trois à cinq mégaohms. Ensuite, touchez la cellule identifiée avec une pointe de pipette, ce qui entraîne une indentation dans la membrane cellulaire.Ensuite, appliquez une pression négative par aspiration à l’embout buccal, ce qui augmente la résistance de la pipette. Continuez à appliquer une pression négative progressivement jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe, ce qui entraîne des transitoires de capacité de la cellule entière. Pour entrer dans la configuration de pince actuelle, utilisez une LED montée dirigée dans le trajet de lumière du microscope avec des cubes de filtre et des optiques appropriées, et appliquez des impulsions lumineuses à la tranche via l’objectif 40X.Délivrez des trains d’impulsions lumineuses multiples à cinq hertz, 10 hertz et 20 hertz pour étudier les propriétés de libération présynaptique. Pour permettre à la biocytine de remplir le neurone, attendez au moins 15 minutes après être entré dans la configuration de la cellule entière. Dans la pince de tension, surveillez la capacité de la membrane et la résistance d’entrée.Ensuite, retirez lentement la pipette le long de l’angle d’approche loin du soma de la cellule, en observant la lente disparition des transitoires de capacité et du courant membranaire, indiquant le rebouchage de la membrane cellulaire et la formation d’une tache extérieure à l’extrémité de la pipette. Placez la tranche dans le paraformaldéhyde dans une assiette de 24 puits et incuber pendant la nuit. À l’aide d’un milieu OCT, fixer un bloc tissulaire au disque de l’échantillon du cryostat.Pour congeler le tissu, placez l’isopentane dans un contenant approprié et immergez le disque de l’échantillon, en vous assurant que le tissu est au-dessus du niveau de l’isopentane. Ensuite, abaissez le récipient d’isopentane dans de l’azote liquide et laissez le tissu geler. Une fois que le tissu est complètement congelé, laissez le bloc tissulaire dans la chambre du cryostat à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre à la température du bloc de s’équilibrer.Après l’équilibration, coupez des sections de 40 micromètres d’épaisseur dans le cryostat et utilisez un pinceau fin pour guider les sections hors de la lame. Collez ces sections congelées à une lame de microscope en verre revêtu de poly-L-lysine à température ambiante en touchant la lame aux sections. Après avoir ajouté 150 microlitres de support de montage à chaque glissière, appliquez le couvercle et retirez les bulles d’air en appuyant doucement sur le couvercle.Couvrez les lames pour les protéger contre le photoblanchiment et laissez-les sécher à l’air libre pendant 12 heures. Ensuite, à l’aide d’un microscope à fluorescence, examinez l’emplacement du site d’injection virale. Pour la coloration à la biocytine, incuber les tranches dans du peroxyde d’hydrogène à 3% dans du PBS pendant 30 minutes pour bloquer toute activité endogène de la peroxydase.Ensuite, lavez les tranches de cerveau avec du PBS jusqu’à ce qu’aucune autre bulle d’oxygène ne soit visible. Ensuite, incuber les tranches pendant trois heures dans une solution complexe HRP biotinylée à 1% d’avidine dans du PBS contenant 0,1% de Triton X-100. Après six lavages de PBS, incuber chaque tranche dans une solution de DAB jusqu’à ce que la coloration biocytine des structures neuronales devienne visible.Arrêtez la réaction en transférant les tranches dans du PBS froid. Montez ensuite les tranches sur les lames de microscope en verre à l’aide d’un pinceau. Après avoir enlevé l’excès de PBS, ajoutez le support de montage.Couvrez les tranches à l’aide de lamelles de couvercle et laissez-les sécher à l’air, comme démontré précédemment. Une cellule pyramidale saine a été localisée et rapiécée. Si l’identification post-synaptique de la cellule est requise, une cellule exprimant le marqueur fluorescent doit être localisée à l’aide d’une optique à grand champ.Des impulsions lumineuses uniques de deux millisecondes ont donné lieu à des potentiels excitateurs post-synaptiques optogénétiques de forme d’onde simple. La plasticité à court terme de la synapse est examinée en appliquant des trains de stimulation lumineuse de cinq, 10 et 20 hertz. Tout en étudiant la plasticité à long terme, l’ajout de carbachol agoniste cholinergique au LCa circulant pendant 10 minutes a provoqué une dépression à long terme qui était encore évidente 40 minutes après le retrait du ligand.La longueur du site d’injection a été examinée histologiquement. Le rapporteur fluorescent mCherry a été localisé dans les couches plus profondes du cortex prélimbique et infralimbique. De plus, la coloration d’une cellule remplie de biocytine a confirmé son emplacement et sa morphologie.Les étapes critiques de ce protocole sont la transduction précise de la région cérébrale afférente, qui peut être vérifiée post hoc, et la dissection rapide du cerveau lors de la préparation de tranches aiguës. Cette procédure est facilement combinée avec le marquage fluorescent d’un type de cellule individuel, tel qu’une sous-classe d’interneurones particulière. Pour ce faire, nous utiliserions un animal transgénique qui exprime une recombinase dans ce type de cellule particulier.Les constructions optogénétiques livrées par Virally ont permis des progrès rapides dans les domaines des systèmes et de la neuroscience des circuits.

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Cette vidéo montre la procédure d’étude de l’efficacité synaptique dans le cortex entorhinal latéral (LEC) en stimulant optogénétiquement les axones du cortex préfrontal médian (mPFC) et en enregistrant les réponses des neurones pyramidaux dans le LEC. Cette méthode combine des enregistrements par patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique.

Stimulation optogénétique et enregistrement électrophysiologique d’événements synaptiques dans des coupes de cerveau de rat

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In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

Nous décrivons une méthode pour caractériser la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits du cerveau antérieur en utilisant une approche optogénétique pour photostimuler les populations neuronales in vitro.

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Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

approches optogénétiques sont largement utilisés pour manipuler l'activité neuronale et d'évaluer les conséquences pour le fonctionnement du cerveau. Ici, une technique est décrit que , lors de l' expression in vivo de l'activateur optique channelrhodopsin, permet une analyse ex vivo des propriétés synaptiques de longue portée spécifique et les connexions locales dans les circuits neuronaux liés à la peur.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

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Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

Cette méthode décrit une préparation chronique qui permet un accès optique à l'hippocampe de souris vivantes. Cette préparation peut être utilisée pour effectuer l'imagerie optique longitudinale de la plasticité structurale neuronale et de la plasticité cellulaire suscitée par l'activité sur une période de plusieurs semaines.

Imagerie longitudinale à deux photons de l'hippocampe dorsal CA1 chez les souris vivantes

Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.

Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe

Nous avons développé une approche simplifiée et rentable pour la fabrication d’électrodes et avons effectué des enregistrements de signaux dans plusieurs régions chez des souris se déplaçant librement. L’utilisation de l’optogénétique, associée à l’électrophysiologie multirégion et à l’enregistrement du signal calcique, a permis de révéler les activités neuronales dans toutes les régions du modèle d’allumage des crises.

Une méthode intégrée pour la fabrication d’optrodes électrophysiologiques flexibles et pratiques pour l’enregistrement in vivo multi-régions

Ici, nous présentons deux protocoles d’enregistrement par micro-électrocorticographie à haute densité (μEcoG) chez le rat et la souris, y compris les méthodes chirurgicales, d’implantation et d’enregistrement. Les enregistrements μECoG sont effectués en combinaison avec l’enregistrement de polytrodes laminaires dans le cortex auditif du rat ou avec la manipulation optogénétique de l’activité neuronale dans le cortex somatosensoriel de la souris.

Études multi-échelles du traitement cortical par intégration de polytrodes laminaires et d’optogénétique avec micro-électrocorticographie chez les rongeurs

Ce protocole décrit une méthode chirurgicale en deux phases pour créer une grande fenêtre crânienne re-scellable et conservatrice de la dure-mère chez la souris. Cette technique permet des enregistrements électrophysiologiques chroniques et multimodaux à partir de réseaux transmis et profonds du cerveau, tels que le Default Mode Network, sur plusieurs semaines.

Protocole chirurgical pour une grande fenêtre crânienne refermable permettant des enregistrements électrophysiologiques longitudinaux et multimodaux du réseau en mode par défaut de la souris

Découvrez une méthode optogénétique ex vivo pour caractériser l'électrophysiologie synaptique et la plasticité dans des tranches aiguës de cerveau de rongeur. Cette approche permet d'étudier les voies neuronales à longue distance avec une stimulation sélective des axones.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral (Vidéo) | JoVE Journal

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