Fluorescence interphasique hybridation in situ des frottis de moelle osseuse du myélome multiple
15 avril 2022
Nous présentons ici un protocole pour améliorer le succès de la détection de l’hybridation in situ par fluorescence interphasique sur les frottis de moelle osseuse de patients atteints de myélome multiple.
L’application de l’hybridation in situ par fluorescence appelée FISH à la stratification du risque génétique dans le myélome multiple est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les plasmocytes clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une immunoglobuline à chaîne légère cytoplasmique kappa ou Lambda avec un test FISH appelé cIg FISH. Interphase FISH après tri plasmocytaire ou cIg FISH s’avère significatif dans le diagnostic du myélome multiple, en raison de la proportion relativement plus faible de plasmocytes dans la moelle osseuse.
Cependant, ces méthodes présentent certaines lacunes, notamment des processus complexes, des exigences élevées en matière d’échantillons et des coûts expérimentaux élevés. Les plasmocytes peuvent être rapidement localisés dans un frottis de moelle osseuse. Sur cette base, nous utilisons le frottis de moelle osseuse FISH pour la détection des cellules du myélome multiple.
Cette étude a été menée selon les principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan. Les échantillons ont été prélevés sur un patient atteint de myélome multiple au département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan en Chine. Placez le premier 0,2 millilitre de solution de moelle osseuse sur une lame de verre jetable propre, étalez les frottis de moelle osseuse à une épaisseur uniforme et à des queues pointues en retirant rapidement la moelle osseuse puis séchez-la naturellement.
Couvrir les pellicules de moelle osseuse d’un millilitre de solution de Wright-Giemsa pendant environ 10 secondes à température ambiante. Ajouter un millilitre de tampon phosphate aux lames, des précautions ont été nécessaires pour empêcher la solution de colorant de sécher ou de s’écouler des lames. Mélangez doucement la solution de colorant et maintenez-la pendant 15 minutes à température ambiante.
Rincez les lames à l’eau claire et séchez-les à l’air à température ambiante. Utilisez la microscopie optique avancée pour détecter les plasmocytes malins, les plasmocytes doivent être bien dispersés. Maintenant, ce que nous voyons sur le terrain, ce sont les plasmocytes qui sont assez dispersés.
Il s’agit d’une cellule de plasma nucléaire Binucléaire typique. Couvrir la zone hybridée avec une solution fixative pendant 10 minutes pour décolorer et fixer les plasmocytes. Rincez la lame à l’eau désionisée et séchez-la à l’air à température ambiante.
Préchauffer un pot contenant deux fois le tampon SSC à 56 degrés Celsius au bain-marie. Laver le frottis de moelle osseuse préparé dans le tampon SSC préchauffé deux fois pendant 10 minutes, puis tremper dans de l’eau désionisée à température ambiante. Déshydratez le frottis dans un gradient d’éthanol de 70% 85% et 100% d’éthanol chacun pendant une minute.
Sécher le frottis à l’air pendant 10 minutes. Ajoutez d’abord TP53 sur centromère du mélange de sonde du chromosome 17 à la zone d’hybridation et recouvrez-la d’un couvercle, appuyez doucement sur la pince à épiler fine et pointue pour éliminer les bulles d’air par le dessous. Scellez tous les côtés du couvercle avec du ciment en caoutchouc pour assurer une bonne étanchéité.
Après la solidification du ciment en caoutchouc, la lame a été placée sur une machine automatique FISH, la dénaturation a été effectuée à 78 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivie d’une hybridation à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Récupérez la glissière de la machine FISH. Utilisez une pince à épiler fine et pointue pour enlever doucement le ciment en caoutchouc.
Immergez la glissière dans deux fois SSC à température ambiante pendant environ une ou deux minutes pour laver le couvercle. Lavez la glissière dans un tampon de préchauffage de 68 degrés Celsius au bain-marie pendant deux minutes. Lavez les diapositives avec deux fois SSC dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant une minute.
Installez-vous dans l’obscurité pour bien sécher pendant 10 minutes à 10 microlitres de DAPI dans la zone hybridée, couvrez avec un couvercle. Visualisez une lame hybridée à l’aide d’un filtre approprié sur un microscope à fluorescence, utilisez un filtre optique fluorophore bleu monochromatique pour observer l’intensité de fluorescence du noyau cellulaire. Prenez des images de noyau cellulaire sous un ensemble de filtres DAPI.
Le CEP17 a été marqué avec une fluorescence verte. Utilisez un filtre optique fluorophore vert à spectre pour observer l’emplacement du CEP17. Prenez l’image des signaux CEP17 sous le jeu de filtres verts.
Le gène TP53 a été marqué avec une fluorescence orange. Utilisez un filtre optique fluorophore orange à spectre pour observer TP53, prendre l’image des signaux TP53 sous l’ensemble, fusionner ces trois images dans un ensemble et examiner les anomalies numériques. Dans une cellule interphasique normale, deux signaux orange et deux signaux verts sont observés à l’intérieur d’un noyau avec une fluorescence bleue indiquant une paire de chromosomes normaux 17.
Les résultats ont montré la morphologie et la génétique de la moelle osseuse chez un patient atteint de myélome multiple. La figure A a montré que 15% des plasmocytes dans un frottis de moelle osseuse se sont révélés plus gros et plus sombres et nucléaires ainsi que de grandes quantités de cytoplasme que la normale. La figure B montrait une image en échelle de gris représentative par un plasmocyte nucléé dans un frottis de moelle osseuse.
La figure C montrait quatre signaux orange et quatre signaux verts dans un noyau interphasique de plasmocytes suggérant que quatre copies du chromosome 17 étaient localisées dans un noyau. La figure D a montré que le caryogramme chromosomique anormal de ce patient a confirmé deux paires de chromosomes 17 dans un noyau. Les frottis de moelle osseuse sont beaucoup plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulants, car l’obtention de moelle osseuse anticoagulée nécessite des procédures complexes pour obtenir le noyau.
En conséquence, nous avons établi une méthode convaincante pour le frottis de moelle osseuse FISH pour la détection des cellules myélomateuses multiples.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole permettant d'améliorer l'efficacité de la détection par hybridation in situ en fluorescence (FISH) en interphase sur des frottis de moelle osseuse provenant de patients atteints de myélome multiple. L'étude souligne l'importance d'identifier avec précision les plasmocytes clonaux pour un diagnostic efficace.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Génétique
Contexte
- L'hybridation in situ en fluorescence (FISH) est essentielle pour la stratification du risque génétique dans le myélome multiple.
- Les cellules plasmatiques clonales doivent être spécifiquement identifiées pour un rapport FISH précis.
- Les méthodes actuelles présentent des limites, notamment une complexité élevée et des coûts importants.
- Les frottis de moelle osseuse peuvent faciliter une identification plus rapide des cellules plasmatiques.
Objectif de l'étude
- Améliorer la détection des cellules de myélome multiple à l’aide de la FISH sur frottis de moelle osseuse.
- Remédier aux limites des méthodes de FISH existantes.
- Faciliter le processus d’identification des plasmocytes clonaux.
Méthodes utilisées
- Utilisation de billes magnétiques anti-CD138 pour le tri des cellules plasmatiques.
- Mise en œuvre du marquage immunoglobulique des chaînes légères cytoplasmiques kappa ou lambda.
- Application de la FISH en interphase après le tri des cellules plasmatiques.
- Utilisation de la FISH sur frottis de moelle osseuse pour une détection efficace.
Résultats principaux
- La technique FISH sur frottis de moelle osseuse permet d'identifier efficacement les cellules du myélome multiple.
- Amélioration de la précision du diagnostic du myélome multiple grâce à la détection ciblée des cellules plasmatiques.
- Réduction de la quantité d'échantillons nécessaires et des coûts expérimentaux par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Un protocole amélioré facilite un diagnostic plus rapide et une planification du traitement accélérée.
Conclusions
- L'étude présente une alternative viable pour la détection des cellules de myélome multiple.
- La FISH sur frottis de moelle osseuse peut surmonter les limites des techniques de FISH existantes.
- Les recherches futures pourraient se concentrer sur l'optimisation supplémentaire de cette méthode pour une utilisation clinique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode remédie à un goulot d'étranglement majeur dans le diagnostic du myélome multiple en permettant l'analyse FISH sur des frottis de moelle osseuse facilement disponibles, réduisant ainsi la dépendance aux prélèvements aspirés frais héparinés. Elle permet une stratification génétique du risque plus rapide et plus accessible dans les flux de travail d'hématologie-oncologie, particulièrement lorsque l'obtention des échantillons est difficile. L'approche améliore la continuité translationnelle en augmentant la faisabilité des échantillons sans compromettre la spécificité des cellules plasmatiques clonales.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des anomalies chromosomiques dans les cellules plasmatiques clonales directement à partir de frottis, contribuant à l'évaluation mécanistique des cibles génomiques.
- Valeur opérationnelle : Réduit la complexité du traitement des échantillons en éliminant la nécessité d'un tri ou d'un enrichissement cellulaire préalable à la FISH.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit une plateforme normalisée basée sur des frottis pour la FISH en interphase, améliorant la disponibilité du test pour les échantillons à faible rendement ou difficiles à obtenir.
- Valeur opérationnelle : Accroît la reproductibilité en réduisant les variables préanalytiques liées à la manipulation et au traitement des prélèvements frais.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Soutient les études alignées sur les biomarqueurs en préservant le contexte spatial des plasmocytes dans les frottis, permettant ainsi de corréler la morphologie avec les anomalies génétiques.
- Valeur opérationnelle : Facilite la surveillance longitudinale dans les modèles précliniques où les aspirations médullaires répétées sont irréalisables.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum découverte-traduction en proposant un protocole FISH réalisable lorsque les échantillons primaires sont limités, permettant une analyse génétique en aval sans retarder l'identification des candidats ni la validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur des altérations génomiques clonales en autorisant la FISH sur des frottis médullaires archivés ou difficiles à traiter.
- Dépistage : Améliore la standardisation des tests en utilisant les frottis comme substrat uniforme pour l'hybridation et la détection des signaux.
- Analytique : Permet une évaluation quantitative des variations du nombre de copies chromosomiques (par exemple, TP53, CEP17) dans les noyaux en interphase, contribuant à la stratification du risque.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique en permettant des prélèvements répétés par frottis dans les études longitudinales.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un protocole reproductible de frottis prêts pour la FISH, applicable à divers modèles de myélome multiple et types d'échantillons.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive de l'évaluation du risque génomique en permettant la réalisation d'une FISH sur des échantillons autrement inadaptés à l'analyse.
- Valeur opérationnelle : Augmente le débit du laboratoire et réduit le délai d'analyse en simplifiant la préparation des échantillons.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques et techniques dans les prises de décision précoces en élargissant l'accès à des données cytogénétiques essentielles.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement adapté au risque en rendant la stratification basée sur la FISH réalisable dans des contextes à ressources limitées ou cliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans la conception de sondes FISH, l'hybridation et la microscopie en fluorescence pour une interprétation précise des signaux.
- Dépend de l'accès à un équipement FISH standard comprenant des chambres d'hybridation, des tampons de lavage et des jeux de filtres pour DAPI, le vert spectrum et l'orange spectrum.
- Nécessite une standardisation des protocoles de préparation des frottis et de coloration afin d'assurer une morphologie des cellules plasmatiques constante et une bonne rétention.
- Doit tenir compte de la variabilité de la densité des cellules plasmatiques entre les frottis lors de la détermination de la profondeur d'échantillonnage et des seuils de quantification des signaux.
- Limité à l'analyse en interphase ; ne permet pas le caryotypage en métaphase ni la détection de réarrangements structuraux sans méthodes supplémentaires.
