Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique

Le gliome diffus de la ligne médiane est une tumeur cérébrale très invasive. Cette méthode permet d’étudier en temps réel comment les cellules DMG migrent et envahissent dans un contexte 3D avec des informations spécifiques sur le rôle potentiel d’une molécule d’adhésion clé. En utilisant un réactif de marquage et un anticorps spécifique anti-CD44, nous pouvons étudier par imagerie cellulaire vivante l’expression de CD44 sur membrane plasmique sur les cellules DMG également dans la migration et l’invasion 3D.

L’application de cette technique a mis en évidence le rôle potentiel de CD44 dans la motilité de ces cellules, suggérant qu’il pourrait représenter une cible moléculaire précieuse et invasive. Pour commencer, réhydratez l’ALR en ajoutant 100 microlitres d’eau stérile et mélangez la solution par pipetage. Mélanger l’anticorps avec l’ALR dans le milieu TSM dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et le protéger de la lumière.

Préparer une quantité suffisante du milieu pour distribuer 25 microlitres par puits à trois fois la concentration finale du dosage, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Diluer la BSR dans le milieu VDMD à une concentration de 1,5 millimolaire pour obtenir une concentration finale de 0,5 millimolaire à la fin de l’essai. Ensuite, retirez doucement et lentement 75 microlitres du milieu de chaque puits, en évitant de toucher le fond du puits où se trouve le NS et en vérifiant visuellement la présence du NS.

Ajouter doucement 25 microlitres du complexe d’anticorps BSR et ALR à chaque puits et laisser le complexe d’anticorps ALR se mélanger au milieu pendant deux à trois minutes. À l’aide d’un microscope inversé, assurez-vous que chaque NS est situé au centre du fond. Évitez la formation de bulles en les enlevant à l’aide d’une aiguille.

Placez l’assiette sur de la glace pendant cinq minutes pour laisser le fond de l’assiette refroidir. Distribuez 75 microlitres de BMM par puits en plaçant une pointe P200 pré-refroidie sur la paroi interne du puits, en évitant la formation de bulles et en touchant le fond du puits. Laissez l’assiette sur la glace pendant cinq minutes pour laisser le BMM se mélanger au milieu.

À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez l’emplacement de NS. Et si elle n’est pas présente au centre, centrifuger la plaque à quatre degrés Celsius à 180 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, transférez la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes placé dans l’incubateur réglé à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité. Une fois les puits recouverts de BMM, coupez une pointe P200.

Prenez 50 microlitres du milieu cellulaire et NS de chaque puits sélectionné et transférez-le dans un puits à fond plat revêtu. Vérifiez visuellement la présence et la position du NS dans chaque puits. Ajouter doucement 50 microlitres des anticorps BSR et ALR dilués à chaque puits, en attendant deux à trois minutes pour laisser les réactifs se mélanger.

Et à l’aide d’un microscope inversé, assurez-vous que la plupart des NS répliquées sont situées au centre du puits. Après vous être assuré de l’absence de bulle, transférez doucement la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes comme démontré précédemment. Sur le logiciel de l’instrument d’analyse de cellules vivantes, sélectionnez le calendrier d’option à acquérir, puis cliquez sur l’onglet plus et sélectionnez scan on schedule pour scanner les plaques avec les intervalles mentionnés dans le manuscrit texte.

Dans la fenêtre du logiciel, créez ou restaurez le navire, puis cliquez sur l’option Nouveau. Sélectionnez le type de balayage sphéroïde, la phase plus le fond clair, les canaux d’image verts pour le test d’invasion et l’objectif 4X. Sélectionnez l’analyse de clonage de dilution, l’objectif de type 4X et la phase et le vert pour le test de migration.

Sélectionnez le type de plaque et définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques, puis configurez la fréquence de balayage. Cliquez sur Ajouter à la planification et lancez l’analyse. Sélectionnez l’onglet Créer une nouvelle définition d’analyse.

Sélectionnez ensuite l’invasion sphéroïde ou l’application d’analyseur de base pour l’invasion et la migration respectivement dans l’onglet. Sélectionnez les canaux d’invasion et de migration appropriés dans le canal d’image. Sélectionnez quelques images représentatives de trois à quatre puits pour prévisualiser et affiner le paramètre d’analyse.

Pour le test d’invasion, dans l’onglet de définition de l’analyse, ajustez les paramètres de l’application dans les canaux en fond clair et vert avec les paramètres mentionnés dans le manuscrit du texte pour générer une segmentation précise entre les cellules sphéroïdes et envahissantes. Pour le test de migration, ajustez les paramètres de l’application comme indiqué dans le manuscrit de texte dans la phase et les canaux verts pour générer une segmentation précise entre la confluence et les cellules vertes. Vérifiez que les paramètres d’analyse sont corrects pour le NS en cliquant au hasard sur plusieurs puits.

Sélectionnez les puits et les points temporels à analyser. Enregistrez la définition de l’analyse et cliquez sur Terminer. Les images confocales immunofluorescentes représentatives de l’expression de CD44 dans les cellules primaires dérivées de patients atteints de DMG ont démontré le rôle de CD44 dans la migration et l’invasion cellulaires.

L’immunochimie cellulaire 3D vivante permet de visualiser l’expression de CD44. Les images représentatives du laps de temps pour la migration et l’invasion montrent la présence et l’absence du signal fluorescent vert sur la même cellule observée au fil du temps, ce qui suggère que l’expression de CD44 est activée et désactivée pendant que les cellules migrent et envahissent. Les processus de migration et d’invasion sont suivis pendant 96 heures, montrant des cellules QCTB-R059 avec un niveau élevé de CD44.

La quantification de l’expression de CD44 et son augmentation au fil du temps ont été mesurées par le signal de fluorescence vert global associé à l’ALR pour la migration et l’invasion. Lorsque l’anticorps anti-CD44 est utilisé sur des cellules vivantes, il affecte la morphologie cellulaire, induisant une transition de l’invasion mésenchymateuse à l’invasion amiboïde et une réduction de la capacité invasive et migratoire de ces cellules. L’étape la plus critique de la méthode est le mélange du réactif de marquage avec un anticorps, l’ajout du mélange au Matrigel et au milieu, et l’accès à l’instrument d’imagerie de cellules vivantes.

Cette méthode peut être mise en œuvre par l’utilisation de deux ou plusieurs réactifs et anticorps de marquage distinctifs pour étudier l’interaction des cellules DMG médiée par les cellules directes et le contact. Notre méthode offre de nouveaux outils pour étudier en 3D les mécanismes cellulaires et moléculaires de la migration et de l’invasion des DMG, fournissant de nouvelles directions pour inhiber leur phénotype infiltrant.