Name: La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez la micro-électroporation à flux continu pour optimiser les conditions de transfection cellulaire avec surveillance en temps réel de la perméabilisation membranaire. Cette méthode améliore l'efficacité expérimentale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier la National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) et le programme Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) du département de l’Éducation des États-Unis pour le financement de la bourse J.J.S. de l’étudiant diplômé.

<ol><li>Gao, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+engineered+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy.</a> Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).</li>
<li>Aijaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomanufacturing+for+clinically+advanced+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).</li>
<li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).</li>
<li>Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer%3A+A+mechanistic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer: A mechanistic perspective.</a> Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).</li>
<li>Clauss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+T-cell+engineering+by+sleeping+beauty+minicircles+diminishing+DNA+toxicity+and+miRNAs+silencing+the+endogenous+T-cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors.</a> Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).</li>
<li>Sherba, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+electroporation+buffer+composition+on+cell+viability+and+electro-transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3053(2020).</li>
<li>Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+electroporation+device+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic electroporation device for cell lysis.</a> Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).</li>
<li>Kar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%3A+current+trends%2C+applications+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).</li>
<li>Shi, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), (2018).</li>
<li>Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semicontinuous+flow+electroporation+chip+for+high-throughput+transfection+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).</li>
<li>Wei, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+microelectrode+array+for+simultaneous+L-glutamate+and+electrophysiological+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo.</a> Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).</li>
<li>Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+mammalian+cells+through+SiO2+thin+film+capacitive+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes.</a> Scientific Reports. 11 (1), (2021).</li>
<li>Wu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects.</a> Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).</li>
<li>Pandey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+Based+Point-of-Care+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).</li>
<li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+biosensor+technology+for+potential+applications+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).</li>
<li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMEMS+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li>
<li>Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+electroporation+system+for+efficient+molecular+delivery+into+Chlamydomonas+reinhardtii+with+a+3-dimensional+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamically+controlled+cell+rotation+in+an+electroporation+microchip+to+circumferentially+deliver+molecules+into+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).</li>
<li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li>
<li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li>
<li>Hsi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustophoretic+rapid+media+exchange+and+continuous-flow+electrotransfection+of+primary+human+T+cells+for+applications+in+automated+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).</li>
<li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li>
<li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%222020+33rd+Ieee+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28Mems+2020%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li>
<li>Huang, Y., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+electroporation+chip+for+single+cell+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+a-Physical%22%5BJournal%5D)">Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).</li>
<li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li>
<li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li>
<li>Zheng, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+electrically-triggered%2C+single+cell-level+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation.</a> Technology. 5 (1), 31-41 (2017).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li>
<li>MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf</a> (2021).</li>
<li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001).</li>
<li>Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLisinenkova%2C+M+%224M+2006+-+Second+International+Conference+on+Multi-Material+Micro+Manufacture%22">4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture</a>. , Elsevier. 91-94 (2006).</li>
<li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li>
<li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthodologie présentée dans ce protocole se concentre principalement sur la microfabrication d’un dispositif microfluidique qui est ensuite intégré dans une installation expérimentale spécialisée en électroporation. Le terme « recette », qui est souvent utilisé pour décrire les spécificités du processus de microfabrication, fait allusion à l’importance de suivre / optimiser chaque étape pour fabriquer avec succès un dispositif fonctionnel. Cependant, certaines étapes critiques du procédé, lorsqu’elles ne sont pas opti...

Les innovations thérapeutiques actuelles dans la recherche biomédicale, telles que la thérapie cellulaire CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) et l’édition génétique utilisant CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, reposent fortement sur la capacité de délivrer du matériel exogène à la fois avec succès et efficacité dans l’espace intracellulaire1. Dans la thérapie CAR-T, l’étalon-or pour effectuer l’étape de livraison de gènes dans la fabrication de thérapies cellulaires est l’utilisation de vecteurs viraux2. Bien que l’administration de gènes à médiation virale soit une modalité de livraison efficace, elle présente également plusieurs inconvénients. Il s’agit notamment des coûts de fabrication, de la cytotoxicité, de l’immunogénicité, du potentiel de mutagénèse/tumorigenèse et des limites de taille du ou des gènes à administrer3. Ces limites ont mené à la recherche et au développement de technologies d’administration alternatives et non virales.
L’électroporation, une alternative à la livraison de gènes à médiation virale, repose sur l’application d’une forme d’onde d’impulsion électrique optimale pour effectuer des transfections d’ADN, d’ARN et de protéines des cellules. Après l’application d’un champ électrique externe, la membrane cellulaire est brièvement compromise, ce qui rend la cellule sensible à la livraison intracellulaire de matériaux exogènes autrement imperméables4. Par rapport à l’accouchement à médiation virale, l’électroporation est avantageuse car elle est généralement sûre, facile à utiliser et a de faibles coûts d’exploitation. L’électroporation peut fournir à la fois une petite et une grande cargaison moléculaire et peut être efficace pour transfecter les cellules, quelle que soit la lignée5. Pour obtenir les résultats souhaités après l’électroporation, c’est-à-dire une bonne viabilité et une bonne efficacité d’électrotransfection, divers paramètres expérimentaux doivent être co-optimisés. Il s’agit notamment du type de cellule 6, de la densité cellulaire, de la concentration de molécules7, des propriétés tampons d’électroporation (p. ex. composition moléculaire, conductivité et osmolarité)8, de la taille/géométrie de l’électrode9 etde la forme d’onde des impulsions électriques (forme, polarité, nombre d’impulsions)10 (voir la figure 1 pour une illustration). Bien que chacun de ces paramètres puisse avoir un effet significatif sur les résultats des expériences d’électroporation, la forme d’onde des impulsions a été particulièrement étudiée en détail, car l’énergie électrique de la ou des impulsions appliquées est à l’origine du compromis intrinsèque entre la viabilité cellulaire résultante et l’efficacité de l’électrotransfection8.
En règle générale, les expériences d’électroporation sont effectuées à l’échelle macro, où les cellules sont suspendues dans 100 microlitres de tampon entre un ensemble de grandes électrodes à plaques parallèles dans une cuvette d’électroporation. Les électrodes sont généralement fabriquées en aluminium avec une distance d’électrode de 1 à 4 mm. Une fois les cellules chargées manuellement via une pipette, la cuvette est connectée électriquement à un générateur d’impulsions électrique encombrant où l’utilisateur peut régler et appliquer les paramètres de forme d’onde d’impulsion pour électroporer la suspension de cellule. Bien que l’électroporation à grande échelle ou en vrac puisse traiter des densités cellulaires &gt;106 cellules/mL, cette fonctionnalité peut être un gaspillage lors de l’optimisation des paramètres de forme d’onde d’impulsion électrique. Ceci est particulièrement préoccupant lors de l’électroporation de types de cellules primaires où le nombre de personnes cellulaires peut être limité. De plus, en raison de la grande distance entre les électrodes, le générateur d’impulsions doit être capable de fournir de grandes tensions pour atteindre des intensités de champ électrique &gt;1kV / cm11. Ces hautes tensions provoquent une dissipation de puissance résistive à travers le tampon électrolytique entraînant un échauffement Joule, ce qui peut nuire à la viabilité de la cellule résultante12. Enfin, l’électroporation sur une suspension dense de cellules sera constamment alourdie d’une variabilité innée de l’efficacité de l’électro-transfection et de la viabilité cellulaire qui en résultent. Chaque cellule en suspension pourrait subir une intensité de champ électrique différente en raison des cellules environnantes. Selon que l’intensité du champ électrique expérimenté est augmentée ou diminuée, la viabilité de la cellule ou l’efficacité de l’électrotransfection résultante peuvent être affectées négativement11. Ces inconvénients de l’électroporation à l’échelle macroscopique ont conduit à la poursuite et au développement de technologies alternatives qui fonctionnent à micro-échelle et permettent un meilleur contrôle au niveau de la cellule unique.
Le domaine des BioMEMS, ou systèmes biomédicaux micro-électromécaniques, découle des progrès technologiques réalisés dans l’industrie de la microélectronique. Plus précisément, l’utilisation de procédés de microfabrication pour développer des micro-dispositifs pour l’avancement de la recherche biomédicale. Ces progrès comprennent le développement de réseaux de microélectrodes pour la surveillance électrique in vivo 13, de microélectrodes capacitives pour l’électroporation in situ 14, de dispositifs miniaturisés d’organes sur puce15, de diagnostics microfluidiques au point de service 16, de biocapteurs 17 et de systèmes d’administration de médicaments 18, y compris des dispositifs de nano- et micro-électroporation 19,20,21 . En raison de la capacité de concevoir et de fabriquer des dispositifs à la même échelle de taille que les cellules biologiques, les technologies de nano- et micro-électroporation sont avantageuses par rapport à leur homologue à l’échelle macro22,23. Ces dispositifs d’électroporation éliminent le besoin d’applications d’impulsions haute tension, car des ensembles d’électrodes avec des espacements de 10 à 100 micromètres sont généralement intégrés. Cette caractéristique réduit considérablement le courant à travers l’électrolyte, ce qui réduit l’accumulation de produits d’électrolyse toxiques et les effets du chauffage Joule dans ces systèmes. Les canaux à micro-échelle garantissent également qu’un champ électrique beaucoup plus uniforme est appliqué de manière fiable aux cellules pendant l’application d’impulsions, ce qui se traduit par des résultats plus cohérents24. En outre, il est également courant que des dispositifs de micro-électroporation soient intégrés dans une plate-forme microfluidique qui se prête à une intégration future dans une technologie entièrement automatisée, une capacité hautement souhaitable dans la fabrication de thérapies cellulaires25. Enfin, l’électroporation à l’échelle microscopique permet l’interrogation électrique des événements d’électroporation. Par exemple, le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire peut être surveillé en temps réel au niveau d’une seule cellule26,27. Le but de cette méthode est de décrire la microfabrication, le fonctionnement du système et l’analyse d’un dispositif microfluidique de micro-électroporation monocellulaire capable de mesurer le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire pour optimiser les protocoles d’électroporation, tout en augmentant le débit par rapport à l’état de la technique précédent.
La réalisation d’une électroporation au niveau d’une cellule unique n’est plus une technique nouvelle, comme l’ont démontré pour la première fois Rubinsky et al. en 2001 avec le développement d’une technologie d’électroporation de cellules statiques28. Leur micro-dispositif était innovant car ils ont été les premiers à démontrer la capacité de surveiller électriquement l’événement d’électroporation. Cela a également conduit au développement de technologies d’électroporation statique à cellule unique capables de détecter électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire de manière parallélisée afin d’augmenter les débits des dispositifs. Cependant, même avec la parallélisation et le traitement par lots, ces dispositifs manquent cruellement du nombre total de cellules qu’ils peuvent traiter par unité de temps29,30. Cette limitation a conduit au développement de dispositifs à flux continu capables d’effectuer une micro-électroporation au niveau d’une cellule à des débits beaucoup plus élevés31. Cette transition du dispositif, de l’environnement statique à l’environnement à écoulement continu, limite la capacité de surveillance électrique du degré de perméabilisation de la membrane cellulaire après l’application de l’impulsion d’électroporation. La méthode décrite dans ce travail comble le fossé entre ces deux technologies, une technologie de micro-électroporation capable de détecter, pulser et surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire de cellules individuelles, de manière sérielle à flux continu.
Cette technologie a été récemment décrite dans Zheng et al. Dans ce travail, les capacités de cette technologie ont été introduites avec la réalisation d’une étude paramétrique, où l’amplitude et la durée de l’impulsion d’électroporation ont été modifiées, et le signal électrique qui en a résulté, indiquant la perméabilisation de la membrane cellulaire, a été exploré32. Les résultats ont montré qu’une augmentation de l’intensité de l’impulsion d’électroporation (c.-à-d. augmentation du champ électrique appliqué ou augmentation de la durée de l’impulsion) entraînait une augmentation de la perméabilisation de la membrane cellulaire mesurée. Pour valider davantage le système, un indicateur fluorescent commun de l’électroporation réussie, l’iodure de propidium33, a été ajouté à la suspension cellulaire, et une image de fluorescence a été capturée immédiatement après l’application de l’impulsion électrique. Le signal optique, c’est-à-dire l’intensité de fluorescence de l’iodure de propidium à l’intérieur de la cellule, était fortement corrélé avec la mesure électrique du degré de perméabilisation de la membrane cellulaire, vérifiant la fiabilité de cette mesure électrique. Cependant, ce travail n’a considéré que la livraison de la petite molécule d’iodure de propidium, qui a peu ou pas de signification traduisible.
Dans ce travail, une nouvelle application de cette technologie est introduite pour améliorer le débit du système tout en fournissant un vecteur d’ADN plasmidique biologiquement actif (ADNp) et en évaluant l’efficacité de l’électro-transfection des cellules replaquées et cultivées après électroporation. Bien que les travaux précédents surpassent les technologies de micro-électroporation existantes capables de mesurer électriquement l’événement d’électroporation, l’état actuel du dispositif nécessite encore de longs temps de transit cellulaire entre le jeu d’électrodes (~ 250 ms) pour effectuer la détection cellulaire, l’application d’impulsions et la mesure de la perméabilisation de la membrane cellulaire. Avec un seul canal, cela limite le débit à 4 cellules/s. Pour lutter contre cette limitation, un nouveau concept d’électroporation contrôlée par rétroaction basée sur la population cellulaire est introduit pour effectuer l’électro-transfection de l’ADNp. En utilisant un tampon d’électroporation par conductivité hypophysiologique, ce système permet l’interrogation électrique de cellules individuelles à travers une multitude d’applications d’impulsions d’électroporation. Sur la base de la réponse électrique, une impulsion d’électroporation « optimale » est ensuite déterminée. Un mode « haut débit » est ensuite mis en œuvre où la détermination de la perméabilisation de la membrane cellulaire est annulée, le débit est augmenté et le rapport cyclique de l’impulsion d’électroporation est adapté au temps de transit de la cellule pour assurer une impulsion par cellule en transit entre les électrodes. Ce travail fournira des détails détaillés sur les étapes de microfabrication pour la fabrication du microdispositif, le matériel / équipement et leur configuration nécessaires pour effectuer l’expérimentation, ainsi que le fonctionnement / l’analyse du dispositif et son efficacité d’électrotransfection (eTE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg"> Figure 1 : Facteurs expérimentaux affectant les résultats de l’électroporation. (À gauche) Suspension cellulaire - Les facteurs importants à considérer avant le début de l’électroporation comprennent: la charge utile (dans ce cas, l’ADNp), la concentration, la densité cellulaire et les propriétés tampons d’électroporation. Les propriétés tampons d’électroporation à considérer sont la conductivité, l’osmolarité et la composition moléculaire exacte contribuant à ces valeurs. (Milieu) Application d’impulsions-Le type d’impulsion exact (onde carrée vs décroissance exponentielle) et la forme d’onde d’impulsion (impulsion unique vs train d’impulsions) doivent être optimisés pour maximiser à la fois la viabilité cellulaire résultante et l’efficacité de l’électro-transfection. Les trains d’impulsions communs mis en œuvre dans les processus d’électroporation sont généralement composés d’une série d’impulsions haute tension (HT) ou d’une série d’impulsions tournant entre les grandeurs d’impulsion HT et basse tension (BT). (À droite) Récupération cellulaire - Les étapes de traitement en aval, en particulier les milieux de culture cellulaire de récupération vers lesquels les cellules sont transférées, doivent être optimisées. Non présenté (à l’extrême gauche), des étapes supplémentaires de traitement des cellules en amont peuvent être mises en œuvre pour l’optimisation globale du processus d’électroporation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Boîtes de Pétri de 150 mm de diamètre</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>étape 6.1.1 pour sécuriser la plaquette</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 24 puits</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>Étape 10.3.6 pour plaques Cellules électroporatives</td></tr><tr><td>33220A Générateur de forme d’onde/fonction</td><td>Agilent</td><td></td><td>étape 9.2.3 Générateur d’impulsions d’électroporation</td></tr><tr><td>Plaquettes de Si-wafers 4''</td> University <td>Wafer</td><td></td><td>sous-section 2.1 pour la fabrication de canaux microfluidiques</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 6 puits</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>étape 8.1.8 pour les cellules sur plaque</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td>étape 2.1.2 pour le nettoyage et&nbsp ; étape 5.1 photorésine décollage Centrifugeuse</td></tr><tr><td>Allegra X-22R Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td>étapes 8.1.4 , 8.3.2 et 8.3.3. pour faire tourner les cellules</td></tr><tr><td>AutoCAD 2018</td><td>Autodesk</td><td></td><td>sous-section 1.1. pour la conception</td></tr><tr><td>de masques transparents Tampon d’oxyde de mordançage 10:1</td><td>VWR</td><td>901621-1L</td><td>sous-section 3.1 pour la gravure HF</td></tr><tr><td>CCD Caméra de microscope monochrome</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca 285 C4742-96-12G04</td><td>étape 11.2.3. pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Caméra CMOS - Sensicam QE 1.4MP</td><td>PCO</td><td></td><td>sous-section 9.3 partie du dispositif expérimental</td></tr><tr><td>Époxy conducteur</td><td>CircuitWorks</td><td>CW2400</td><td>sous-section 7.6. pour la fixation de fils</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>étape 8.1.4. pour la centrifugation de cellules</td></tr><tr><td>Profilomètre de surface Dektak 3ST</td><td>Veeco (Sloan/Dektak)</td><td></td><td>étapes 2.1.15 et 5.4 pour la profilométrie de surface</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie jetable, 0,75 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP075</td><td>étape 6.2.3 pour l’accès à l’entrée</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie jetable, 3 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP30P</td><td>étape 6.2.3 pour l’accès à la sortie</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>abcam</td><td>ab108410</td><td>étape 11.2.2. pour la coloration de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>étape 8.1.2. partie de la composition du support</td></tr><tr><td>E3631A Bipolaire Triple alimentation DC</td><td>Agilent</td><td></td><td>étape 9.2.1.-9.2.2.partie du montage expérimental</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Inversé&nbsp ; Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>·nbsp ; sous-section 9.3. fait partie du dispositif expérimental</td></tr><tr><td>EVG620 Système de lithographie UV</td><td>EVG</td><td></td><td>&nbsp ; Étape 2.1.9. et 2.2.7. pour l’exposition aux UV</td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Neuromics</td><td>FBS001</td><td>étape 8.1.2. partie de la composition du support</td></tr><tr><td>FS20 Nettoyeur à ultrasons</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>sous-section 5.1. pour photoresist lift-off</td></tr><tr><td>Flacon de support en verre avec bouchon, 100 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800100</td><td>étape 8.2.1. pour le stockage tampon</td></tr><tr><td>Flacon en verre avec bouchon, 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800500</td><td>étape 8.1.2.pour le stockage dans les milieux</td></tr><tr><td>HEK-293 lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573 sous-section</td><td>8.1 pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Solution tampon HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>étape 8.2.1 partie de la composition du tampon d’électroporation</td></tr><tr><td>Hexaméthyldisilazane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>379212-25ML</td><td>étape 2.2.3 promoteur d’adhésion</td></tr><tr><td>HF2LI Lock-in Amplifier</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>sous-section 9.2 partie du dispositif expérimental</td></tr><tr><td>HF2TA Amplificateur de courant</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>sous-section 9.2 partie du dispositif expérimental</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A459-1</td><td>étape 2.1.2 pour le nettoyage, étape 2.1.14 pour le rinçage de la plaquette après le développement du SU-8 et étape 6.3.1 pour le nettoyage</td></tr> du <tr><td>microscope à fluorescence PDMS IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>étape 11.2.3 pour l’imagerie</td></tr><tr>de<td>la solution de L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-20ML</td><td>étape 8.1.2. partie de la composition du support</td></tr><tr><td>M16878/1BFA Fil de calibre 22</td><td>AWC</td><td>B22-1</td><td>sous-section 7.5 pour la fabrication du dispositif</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337-100G</td><td>étape 8.1.2 partie de la composition du tampon d’électroporation</td></tr><tr><td>MF 319 Développeur</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>10018042</td><td>étape 2.2.9.</td></tr><tr><td>photorésine développeur Microposit S1818 photorésine</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>1136925</td><td>étape 2.2.4 photorésine positive pour la structuration des électrodes</td></tr><tr><td>Lames de microscope, 75 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>étape 2.2.1 électrode substrat en verre sodocalcique</td></tr><tr><td>Modèle 2350 Amplificateur haute tension</td><td>TEGAM</td><td>2350</td><td>étape 9.2.5. partie du dispositif expérimental</td></tr><tr><td>National Instruments LabVIEW</td> Aiguille <td>d’acquisition de données</td>National <td>Instruments</td><td></td></tr><tr><td>, 30G x 1 po</td><td>BD Scientific</td><td>305128</td><td>étape 10.1.1. Partie de l’amorçage du système</td></tr><tr><td>PA90 IC OPAMP Circuit d’alimentation</td><td>Digi-key</td><td>598-1330-ND</td><td>Fait partie du circuit personnalisé</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458-20ML</td><td>étape 8.1.2. Élément de composition du support</td></tr><tr><td>Plasmide pMAX-GFP</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>étape 8.3.4. pour l’administration intracellulaire</td></tr><tr><td>Tube en plastique, 0,010'' x 0,030"</td><td>VWR</td><td>89404-300</td><td>étape 10.1.2. pour l’amorçage du système Cibles en</td></tr><tr><td>platine</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>sous-section 4.2. pour le dépôt physique en phase vapeur</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>Étape 8.2.1. partie de la composition du tampon d’électroporation</td></tr><tr><td>Pompe 11 Pompe à seringue microfluidique PicoPlus</td><td>Appareil Harvard</td><td>MA1 70-2213</td><td>étape 10.1.4. pour l’amorçage du système</td></tr><tr><td>PVD75 Système physique de dépôt en phase vapeur</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>sous-section 4.1. pour le dépôt physique en phase vapeur</td></tr><tr><td>PWM32 Système de cône</td><td>Longueur d’avancement</td> Étapes de recherche <td></td><td>2.1.6 et 2.2.2. pour le revêtement de substrat avec résine photosensible</td></tr><tr><td>PX-250 Système de traitement au plasma</td><td>March Instruments</td><td></td><td>sous-section 7.2 pour le collage de PDMS et de substrats en verre</td></tr><tr><td>SDG1025 Générateur de fonctions/de formes d’onde</td><td>Siglent</td><td></td><td>étape 9.2.2. partie du dispositif expérimental</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>étape 8.2.1. partie de la composition du tampon d’électroporation</td></tr><tr><td>SU-8 2010 photorésine négative</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111053</td><td>étape 2.1.7. pour la structuration des canaux microfluidiques</td></tr><tr><td>Développeur SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td>étape 2.1.12. pour le développement de la résine</td></tr><tr><td>photosensible Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td>étape 8.2.1. partie de la composition du tampon d’électroporation</td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit d’élastomère</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>étape 6.2.1 10 : 1 mélange de polymère PDMS et d’agent durcissant</td></tr><tr><td>Seringue, 1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>étape 8.3.4. partie de l’amorçage du système</td></tr><tr><td>SZ61 Système de stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>sous-section 7.3. pour l’alignement des canaux et des électrodes</td></tr><tr><td>Fioles T25 traitées pour la culture tissulaire</td><td>Falcon</td><td>353108</td><td>étape 8.1.2 pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Cibles en titane</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>sous-section 4.2 pour le dépôt physique en phase vapeur</td></tr><tr><td>Services</td><td>de</td><td></td> CAO/TAR, <td>étapes 2.1.9 et 2.2.7. pour la photolithographie</td></tr>, <tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>étape 6.1.2. pour la silanisation des wafers</td></tr><tr><td>Solution trypsine-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td>étapes 8.1.3 et 8.3.1 pour la récolte de cellules</td></tr></tbody></table>

la fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Les innovations thérapeutiques actuelles, telles que la thérapie cellulaire CAR-T, dépendent fortement de l’administration de gènes à médiation virale. Bien qu’efficace, cette technique s’accompagne de coûts de fabrication élevés, ce qui a suscité un intérêt pour l’utilisation de méthodes alternatives pour l’administration de gènes. L’électroporation est une approche électrophysique non virale pour la livraison intracellulaire de gènes et d’autres matériaux exogènes. Lors de l’application d’un champ électrique, la membrane cellulaire permet temporairement la livraison moléculaire dans la cellule. En règle générale, l’électroporation est effectuée à l’échelle macroscopique pour traiter un grand nombre de cellules. Cependant, cette approche nécessite un développement de protocole empirique approfondi, ce qui est coûteux lorsque l’on travaille avec des types de cellules primaires et difficiles à transfecter. Le développement de longs protocoles, associé à l’exigence de grandes tensions pour atteindre des intensités de champ électrique suffisantes pour perméabiliser les cellules, a conduit au développement de dispositifs d’électroporation à micro-échelle. Ces dispositifs de micro-électroporation sont fabriqués à l’aide de techniques de microfabrication courantes et permettent un plus grand contrôle expérimental avec le potentiel de maintenir des capacités de débit élevé. Ce travail s’appuie sur une technologie d’électroporation microfluidique capable de détecter le niveau de perméabilisation de la membrane cellulaire au niveau d’une seule cellule en flux continu. Cependant, cette technologie a été limitée à 4 cellules traitées par seconde, et donc une nouvelle approche pour augmenter le débit du système est proposée et présentée ici. Cette nouvelle technique, appelée contrôle par rétroaction basé sur la population cellulaire, considère la réponse de perméabilisation cellulaire à une variété de conditions de pulsations d’électroporation et détermine les conditions d’impulsion d’électroporation les mieux adaptées au type de cellule testé. Un mode à débit plus élevé est ensuite utilisé, où cette impulsion « optimale » est appliquée à la suspension cellulaire en transit. Les étapes de fabrication de l’appareil, de mise en place et d’exécution des expériences microfluidiques et d’analyse des résultats sont présentées en détail. Enfin, cette technologie de micro-électroporation est démontrée en délivrant un plasmide d’ADN codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules HEK293.

La figure 4 met en évidence les principes de fonctionnement de la détection de perméabilisation membranaire au niveau d’une cellule unique pour une amplitude d’impulsion unique. Après le lancement de l’expérience d’électroporation, l’algorithme de détection de cellule détermine un seuil optimal pour la détection de cellules via une méthode de détection point par point, basée sur la pente. Le système surveille ensuite en permanence (1) un changement négatif significatif dans le courant électr...

Ce protocole décrit les techniques de microfabrication requises pour construire un dispositif d’électroporation microfluidique en laboratoire sur puce. La configuration expérimentale effectue des transfections contrôlées au niveau d’une seule cellule dans un flux continu et peut être étendue à des débits plus élevés avec un contrôle basé sur la population. Une analyse est fournie démontrant la capacité de surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire en temps réel.

La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Cette méthode permet aux chercheurs de déterminer les conditions optimales de pulsation d’électroporation pour le type de cellule souhaité, tout en minimisant la nécessité de l’approche expérimentale empirique traditionnelle. Cette méthode utilise des techniques de micro-électroporation pour fabriquer un dispositif d’actionnement microfluidique évolutif capable de surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire tout au long du processus d’électroporation. La démonstration de la procédure sera Kishankumar Busha, un étudiant à la maîtrise de mon laboratoire.Pour commencer, fixez la plaquette de silicium au mandrin de l’enrobage de la plaquette à l’aide du système de vide du spin coater. Programmez ensuite le spinner. Ensuite, distribuez quatre millilitres de résine photo SU-8 2010 au centre de la plaquette de silicium et exécutez le programme.Une fois que le système s’arrête, éteignez l’aspirateur. Ensuite, fixez le masque photo avec les conceptions de canaux microfluidiques 2D sur le support de masque et insérez la plaquette de silicium avec le revêtement SU-8 orienté vers le haut sur le mandrin de la plaquette. Réglez les paramètres d’exposition à 1

the-fabrication-operation-continuous-flow-micro-electroporation

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Contact diélectrophorèse (CDEP) réalise le tri et l'enrichissement de particules par leurs propriétés diélectriques intrinsèques. Canaux d'électrodes fluidiques remplacent électrodes métalliques traditionnelles de DEP, convenant CDEP à la non-qualification endommager stérile et le tri des particules biologiques. Nous démontrons comment préparer un micro CDEP et effectuer la caractérisation des cellules et des expériences de tri.

L&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules sans étiquette Grâce contact Diélectrophorèse

Un tourbillon microfluidique plate-forme d'électroporation assistée a été développé pour la livraison séquentielle de plusieurs molécules dans des populations de cellules identiques avec contrôle de dosage précis et indépendant. Basé sur la taille de l'étape de purification de la cellule cible de l'électroporation précédentes du système aidé à améliorer l'efficacité d'administration moléculaire et la viabilité des cellules traitées.

Electroporateur pour livraison séquentielle moléculaire microscopique assistée Vortex-

Nous démontrons une plate-forme microfluidique avec un réseau d'électrodes de surface intégrée qui combine la détection d'impulsions résistif (SRP) avec la division accès multiple par code (CDMA), pour multiplexer la détection et le dimensionnement des particules en plusieurs canaux microfluidiques.

Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

Le protocole pour une nouvelle polarisation de concentration d'ions (ICP) plate-forme qui peut arrêter la propagation de la zone ICP, quelles que soient les conditions de fonctionnement est décrit. Cette capacité unique de la plate-forme repose sur l'utilisation de la fusion de l'appauvrissement d'ions et d'enrichissement, qui sont deux polarités du phénomène ICP.

Fusion Ion Concentration Polarisation entre juxtaposées échangeuses d&#39;ions Membranes pour bloquer la propagation de la Zone Polarisation

Une plateforme de biocapteurs microfluidiques a été conçue et fabriqué en utilisant la technologie de résine photosensible feuil sec peu coûteux pour la quantification rapide et sensible des analytes différents. Ce système à usage unique permet la lecture électrochimique du-puce-immobilisé les dosages-enzymatique au moyen de la technique d’arrêt de débit.

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

Ce protocole décrit comment construire un système de chaîne polymérase à flux continu basé sur une puce microfluidique et comment construire un système d’électrophorèse capillaire en laboratoire. Il présente une méthode simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire.

Amplification d’Escherichia coli dans une puce microfluidique PCR à flux continu et sa détection à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire

L’électroporation de substrat poreux (PSEP) associe une distribution constante et à haut débit à une viabilité élevée des cellules. L’introduction de mesures d’impédance électrique transépithéliale (TEEI) donne un aperçu des processus intermédiaires du PSEP et permet une administration sans étiquette. Cet article traite d’une méthode permettant d’effectuer simultanément des expériences d’administration PSEP et une analyse de mesure TEEI.

Électroporation à base de substrat poreux avec surveillance de l’impédance électrique transépithéliale

L’électroporation est l’utilisation de champs électriques pulsés (PEF) pour créer des pores transitoires dans les cultures cellulaires afin d’introduire une cargaison moléculaire. Cette technique est récemment devenue largement utilisée dans la recherche et les milieux cliniques. Nous décrivons ici les techniques d’électroporation utilisant le « système de cytométrie par électroporation » récemment développé pour effectuer la microscopie à fluorescence sur cellules vivantes.

Protocole de cytométrie par électroporation pour la microscopie à fluorescence de cellules vivantes à l’aide de la culture de cellules U2 OS

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

Nous décrivons une méthode pour objet des cellules adhérentes à la contrainte de cisaillement à flux laminaire dans un circuit à débit continu stérile. L'adhérence des cellules, la morphologie peut être étudiée à travers la chambre transparente, des échantillons obtenus à partir du circuit pour l'analyse de métabolites et cellules récoltées après une exposition de cisaillement pour les expériences futures ou la culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

Découvrez la micro-électroporation à flux continu pour optimiser les conditions de transfection cellulaire avec surveillance en temps réel de la perméabilisation membranaire. Cette méthode améliore l'efficacité expérimentale.

La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Explorer plus de vidéos