La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Cette méthode permet aux chercheurs de déterminer les conditions optimales de pulsation d’électroporation pour le type de cellule souhaité, tout en minimisant la nécessité de l’approche expérimentale empirique traditionnelle. Cette méthode utilise des techniques de micro-électroporation pour fabriquer un dispositif d’actionnement microfluidique évolutif capable de surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire tout au long du processus d’électroporation. La démonstration de la procédure sera Kishankumar Busha, un étudiant à la maîtrise de mon laboratoire.

Pour commencer, fixez la plaquette de silicium au mandrin de l’enrobage de la plaquette à l’aide du système de vide du spin coater. Programmez ensuite le spinner. Ensuite, distribuez quatre millilitres de résine photo SU-8 2010 au centre de la plaquette de silicium et exécutez le programme.

Une fois que le système s’arrête, éteignez l’aspirateur. Ensuite, fixez le masque photo avec les conceptions de canaux microfluidiques 2D sur le support de masque et insérez la plaquette de silicium avec le revêtement SU-8 orienté vers le haut sur le mandrin de la plaquette. Réglez les paramètres d’exposition à 150 millijoules par centimètre carré et faites fonctionner la machine.

Après l’exposition aux UV, immergez la plaquette de silicium dans la solution de révélateur SU-8 avec une agitation douce pendant trois à quatre minutes. Ensuite, retirez la plaquette de la solution et rincez la surface avec de l’isopropanol. Ensuite, placez la plaquette de silicium dans un four à 150 degrés Celsius pendant 30 minutes pour une cuisson dure.

Ensuite, laissez-le refroidir à température ambiante avant d’utiliser la profilométrie du stylet pour mesurer la hauteur et la pente exactes des parois latérales du canal. Ensuite, distribuez un millilitre de résine photo sur la surface de la lame de verre et exécutez à nouveau le programme. Une fois le système arrêté, éteignez l’aspirateur et retirez la lame de verre.

Après avoir fixé le masque photo avec les conceptions d’électrodes 2D sur le support de masque, insérez et alignez la plaquette de verre avec le revêtement S-1818 vers le haut sur le mandrin de la plaquette. Réglez les paramètres d’exposition à 215 millijoules par centimètre carré et faites fonctionner la machine. Après l’exposition, immergez la lame de verre dans la solution de révélateur MF-319 pendant deux minutes, en appliquant une agitation douce.

Ensuite, retirez la plaquette de verre et rincez sa surface à l’eau désionisée. Enfin, placez la lame de verre dans le four à 150 degrés Celsius pour une cuisson dure, en vous assurant que la surface d’intérêt du substrat est orientée vers le haut. Après 30 minutes, retirez la lame du four et protégez-la de la lumière.

Pour graver la lame de verre, immergez-la dans une solution d’acide fluorhydrique tamponnée de 10 à 1 pendant une minute dans un récipient en polytétrafluoroéthylène. Ensuite, transférez et lavez les lames de verre dans de l’eau désionisée trois fois. Ensuite, en utilisant un système physique de dépôt en phase vapeur, pulvérisez du titane pendant huit minutes à un taux de 100 angströms par minute et du platine pendant 10 minutes à 200 angströms par minute.

Ensuite, pour soulever la résistance photo, immergez les glissières de verre revêtues de métal dans un bain d’acétone pendant 10 minutes et soniquez le bain pour introduire de l’agitation. Si nécessaire, utilisez une lingette imbibée d’acétone pour éliminer les résidus. Ensuite, le moulage de répliques de polydiméthylsiloxane consiste à fabriquer la base en élastomère PDMS avec un durcisseur à un rapport de poids de 10 à 1 dans un récipient jetable placé sur une balance électronique.

Ensuite, versez la solution PDMS sur la tranche de silicium et placez le mélange sous vide pour éliminer les bulles d’air. Après avoir durci le mélange à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures, utilisez la pointe d’une lame de rasoir pour découper le PDMS moulé et le décoller de la plaquette de silicium. Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie aiguisé, retirez le PDMS de l’entrée et des sorties de l’appareil.

Ensuite, programmez le générateur de plasma pour la liaison PDMS. Placez ensuite le PDMS et la glissière de verre d’électrode dans le système avec les fonctions orientées vers le haut et exécutez le programme. Une fois le programme terminé, retirez les appareils et utilisez un stéréoscope pour aligner rapidement les caractéristiques du canal sur les électrodes.

Appliquez fermement une pression du centre du PDMS vers les côtés pour éliminer les bulles d’air indésirables à l’interface de collage. Récoltez les cellules HEK293, centrifugez-les et remettez la pastille en suspension dans un tampon d’électroporation à environ cinq millions de cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez l’ADN plasmatique codant pour la GFP à une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre et mélangez doucement.

Ensuite, transférez la suspension de cellules plasma-ADN dans une seringue d’un centimètre cube pour l’expérimentation. Placez le microdispositif sur la scène du microscope via un support de lame. Allumez ensuite le dispositif couplé chargé, la caméra CCD et mettez au point le canal microfluidique.

Ensuite, pour l’électroporation à cellule unique, réglez le débit de la pompe de la seringue sur 0,1 à 0,3 microlitre par minute pour assurer le flux des cellules individuelles à travers le jeu d’électrodes. Réglez ensuite les paramètres d’impulsion pour l’impulsion d’électroporation d’énergie électrique initiale et la plus faible. Suivez un nombre prédéterminé de détections de cellules par application d’impulsions.

À la fin de chaque condition testée, aspirer les cellules de la sortie du microdispositif et reconstituer la sortie avec un média de récupération. Itérez jusqu’à la condition d’impulsion d’électroporation suivante et répétez jusqu’à ce que toutes les conditions d’impulsion d’électroporation soient testées. Ensuite, déterminez les paramètres d’impulsion d’électroporation pour une rétroaction à haut débit basée sur la population.

Pour une électroporation contrôlée par rétroaction basée sur la population, réglez le débit de la pompe de la seringue sur un à trois microlitres par minute et réglez l’amplitude de l’impulsion à l’état optimisé. Désactivez ensuite le mode de déclenchement et définissez la largeur d’impulsion pour qu’elle corresponde au temps de transit de la cellule. Une fois que le nombre souhaité de cellules a été électroporé, éteignez la pompe à seringue et le générateur de fonctions.

Ensuite, transférer les cellules du réservoir de sortie dans un flacon ou une plaque de culture cellulaire de taille appropriée remplie de milieux de récupération préchauffés et transférer le flacon ou la plaque de culture dans un incubateur. Pour l’analyse des données, chargez les données dans un logiciel d’analyse et générez un graphique du courant en fonction du temps pour chaque condition pulsée. Ensuite, déterminez le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire, générez la carte de perméabilisation de la membrane cellulaire sur toutes les conditions d’impulsion testées et vérifiez la condition de pulsation optimale.

Après l’incubation, capturez des images d’épifluorescence à l’aide de filtres FITC et de filtres rouges lointains, et analysez les jeux d’images manuellement ou via un algorithme. Les principes de fonctionnement de la détection de perméabilisation au niveau d’une cellule unique pour une amplitude d’impulsion unique sont mis en évidence ici. Après chaque paramètre d’impulsion d’électroporation, l’impulsion d’électroporation suivante la plus élevée est testée.

La carte de perméabilisation de la membrane cellulaire pour les cellules HEK293 a montré une corrélation distincte entre l’énergie électrique appliquée et le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire. Dans cette expérience, une intensité de champ électrique de 1,8 kilovolts par centimètre et une impulsion de 670 microsecondes ont été déterminées comme optimales. À ces valeurs, un rendement d’électro-transfection de 70% a été atteint.

Contrairement à une intensité de champ électrique de 0,4 kilovolts par centimètre et une durée d’impulsion de trois millisecondes, l’efficacité d’électro-transfection à 24 heures était inférieure à 5%Le terme recette, qui est souvent utilisé pour décrire la spécificité du processus de microfabrication insérer l’importance de suivre ou d’optimiser chaque étape pour fabriquer avec succès un dispositif fonctionnel. Cette technologie d’électroporation peut être utilisée dans d’autres projets de recherche biomédicale tels que la génération et l’essai de cellules CAR-T ou l’optimisation et le test des techniques d’édition de gènes CRISPR-Cas9. Cette technologie de micro-électroporation permet l’interrogation électrique des réponses de différents types de cellules pour appliquer les conditions de pulsations électriques et corréler ces informations à la livraison de cargaisons moléculaires cliniquement pertinentes.