Name: Isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Apprenez l'isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain à l'aide de collagénase et trypsine-EDTA. Cette méthode optimise la formation de colonies en milieu sans sérum pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses.

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Cette étude a été soutenue par des subventions de la National Research Foundation of Korea (NRF) financées par le gouvernement coréen (NRF-2017R1C1B2008406 et NRF-2021R1F1A1064350). Le Dr Hee-Yeon Bae a gentiment fourni le DF pour la culture primaire.

Cette étude a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de l’hôpital universitaire Kyung Hee de Gangdong (approbation de la CISR no. KHNMC 2017-06-009).
1. Collecter DF
REMARQUE: Les patients ont donné leur consentement éclairé avant la chirurgie pour l’ablation d’une troisième molaire touchée mature ou immature. Les patients atteints de la maladie suivante ont été exclus: diabète, hypertension, tuberculose, hépatite, syndrome d’immunodéficience acquise. Les femmes enceintes ont également été exclues.
<ol><li>Récolter le DF lors de l’extraction chirurgicale des troisièmes molaires touchées (Figure 1A). REMARQUE: La chirurgie a été effectuée par un chirurgien maxillo-facial buccal. Une coopération est nécessaire avec un dentiste pour la collecte de tissus.</li>
	<li>Conserver le DF dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco avec 3 % de pénicilline-streptomycine à 4 °C avant utilisation. Effectuer des procédures d’isolement le jour de la récolte du DF (Figure 1B).</li>
</ol>2. Isoler les populations unicellulaires de DF
<ol><li>Préparer des solutions mères de collagénase de type I et de protéase dans du DPBS de sorte que les concentrations finales de collagénase de type I et de protéase soient respectivement de 1 mg/mL et de 2,4 mg/mL.</li>
	<li>Préparez trois tubes de lavage de 50 mL avec 20 mL de DPBS par tube. Étiquetez les tubes comme 1, 2 et 3.</li>
	<li>Lavez le DF dans les tubes de lavage séquentiellement. Tenez le DF avec une pince à épiler et placez le DF dans le tube 1. Sortez le DF du tube 1 et placez-le dans le tube 2. Sortez le DF du tube 2 et placez-le dans le tube 3. Agiter doucement DF 10-15 fois dans chaque tube. Après trois lavages, placez le DF dans une boîte de culture de 60 mm (Figure 2A).</li>
	<li>Hachez le DF avec des ciseaux à tissu (Figure 2B). Ne transférez qu’une petite partie dans le plat de culture pour minimiser la perte de tissu. Répétez la coupe jusqu’à ce que le DF ait un aspect pulpeux ou squishy (Figure 2C).</li>
	<li>Mélanger 1 mL de collagénase de type I et 1 mL de solution de protéase dans un tube conique de 15 mL pour obtenir des concentrations finales de 1 mg/mL et 2,4 mg/mL, respectivement.</li>
	<li>Transférer le DF haché dans le tube conique de 15 mL à partir de l’étape 2.5. Agiter doucement et incuber le tube pendant 1 h à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA dans le tube, agiter et incuber le tube pendant 15 min à 37 °C.</li>
	<li>Préparer un milieu kératinocyte contenant du Kératinocyte SFM 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Ajouter 3 mL de milieu kératinocyte dans un nouveau tube conique de 50 mL. Placez une passoire de 40 μm sur le dessus de ce tube et utilisez une pipette sérologique de 10 mL pour aspirer le surnageant de l’étape 2.6 et le faire passer à travers la passoire. REMARQUE: Minimiser l’incorporation des restes de tissu digérés pendant la prise du surnageant. Retirez les restes de tissu avec une passoire de 40 μm pour minimiser la défaillance. Les restes tissulaires peuvent passer à travers des passoires de 70 μm et entraver la formation de colonies. FBS dans le milieu kératinocytes va inactiver les enzymes.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.7 et 2.8.</li>
	<li>Transférer la suspension collectée dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger le tube conique de 15 mL à 288 × g pendant 3 min à 4 °C. Retirez le surnageant. REMARQUE: Veillez à éviter tout retrait accidentel des cellules granulées, qui sont pour la plupart invisibles.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de MFM kératinocytes et laver les cellules deux fois avec une pipette de 1 mL avec centrifugation comme à l’étape 2.11.</li>
	<li>Plaquer la population unicellulaire dans une boîte de culture de 60 mm à l’aide de SFM kératinocytes. Maintenir la boîte de culture avec un volume final de 5 mL dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 °C. Changer le milieu de culture quotidiennement jusqu’à ce qu’aucun débris tissulaire ou cellulaire ne soit observé. REMARQUE: Enlevez les débris flottants dans le milieu de culture en changeant le milieu. L’élimination tardive des débris tissulaires ou des cellules mortes a un effet défavorable sur la culture primaire.</li>
	<li>Examinez la plaque à partir de l’étape 2.13 pour vérifier la croissance des cellules épithéliales (Figure 3A). REMARQUE: Les cellules épithéliales se développent dans les 7 à 10 jours suivant le placage des populations unicellulaires.</li>
	<li>Développer les colonies épithéliales et sous-cultiver les cellules.<ol>
<li>Aspirer le milieu et laver le fond de la plaque de culture une fois avec 3 mL de MDF kératinocytes.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de protéase de dissociation cellulaire et incuber dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 °C pendant 3 min. REMARQUE : Répétez l’étape 2.15.2 si le détachement de cellule n’est pas efficace.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de milieu kératinocyte à la plaque de culture et transférer le contenu dans un tube conique de 15 mL. REMARQUE: L’ajout de plus de milieu kératinocyte n’est pas nécessaire si l’étape 2.15.2 est répétée.</li>
		<li>Centrifuger le tube conique de 15 mL à 288 × g pendant 3 min à 4 °C.</li>
		<li>Retirez le surnageant et lavez la pastille cellulaire deux fois avec 3 mL de MDF kératinocyte.</li>
		<li>Plaquer les cellules dans une boîte de culture de 100 mm à l’aide de SFM kératinocytes (volume final de 10 mL par boîte de 100 mm).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez et stockez les stocks de cellules dans un réservoir d’azote liquide.<ol>
<li>Récolter les cellules comme décrit aux étapes 2.15.1 à 2.15.5.</li>
		<li>Distribuer les cellules en cryoviales dans 1 mL de milieu de congélation (80% de SFM de kératinocytes, 10% de diméthylsulfoxyde, 10% de FBS).</li>
		<li>Placer les flacons dans un récipient congelé et les conserver à -80 °C pendant 24 h.</li>
		<li>Transférer les flacons du congélateur dans un réservoir d’azote liquide.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting-edge+of+mammalian+development%3B+How+the+embryo+makes+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).</li>
<li>Choung, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+CPNE7+on+periodontal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of CPNE7 on periodontal regeneration.</a> Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+immortalized+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cell+lines+for+cementum+and+dentin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3(2019).</li>
<li>Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+HERS+during+tooth+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate of HERS during tooth root development.</a> Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).</li>
<li>Farea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enhancement+of+a+homogenous+in+vitro+human+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+the+differentiation+of+human+dental+follicle+cells+into+cementoblasts+and%2For+osteoblasts+by+a+combination+of+HERS+and+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells.</a> Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).</li>
<li>Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+the+unique+odontogenic+properties+of+rat+apical+bud+cells+under+the+developing+apical+complex+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment.</a> International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).</li>
<li>Oh, J. E., Yi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dental+follicle-derived+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Oral+Investigations%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells.</a> Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).</li>
<li>Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta+Np63+alpha+protein+triggers+epithelial-mesenchymal+transition+and+confers+stem+cell+properties+in+normal+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).</li>
<li>Morsczeck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+precursor+cells+%28PCs%29+from+human+dental+follicle+of+wisdom+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth.</a> Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2FEpithelial+rests+of+Malassez+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+follicle+cells+and+cementoblasts+induce+apoptosis+of+ameloblast-lineage+and+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2Fepithelial+rests+of+Malassez+cells+through+the+Fas-Fas+ligand+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Oral+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway.</a> European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+cell-cell+Interactions+for+organoid+construction+-+are+biomaterials+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+cells+necessary+for+periodontal+formation+by+dental+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells.</a> Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).</li>
<li>Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+enamel+matrix+derivative+on+healing+of+root+surfaces+after+bonding+treatment+and+intentional+replantation+of+vertically+fractured+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Traumatology%22%5BJournal%5D)">Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots.</a> Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).</li>
<li>Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crowning+achievement%3A+getting+to+the+root+of+the+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Education%22%5BJournal%5D)">The crowning achievement: getting to the root of the problem.</a> Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).</li>
<li>Bonczek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+agenesis%3A+What+do+we+know+and+is+there+a+connection+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer.</a> Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole comprend des étapes critiques. La récolte de populations unicellulaires est essentielle à l’isolement réussi des cellules épithéliales de la DF. Nous avons cherché à isoler les cellules épithéliales du DF en nous basant sur notre hypothèse qu’il y a plus de cellules épithéliales dans le DF. La procédure de hachage améliore le détachement et la libération des cellules du DF. La procédure de hachage a été améliorée et le hachage a été répété jusqu’à ce que le DF apparaisse pulpeux pour faciliter la libération ...

La formation des dents commence par l’invagination de l’épithélium buccal1. Selon le stade de développement de la dent, l’épithélium buccal a différents noms, y compris l’épithélium de l’émail interne et externe, l’anse cervicale et la gaine de la racine épithéliale de Hertwig (HERS). Les compartiments épithéliaux communiquent avec les cellules mésenchymateuses environnantes. Les interactions épithéliales-mésenchymateuses régulent la formation des dents et la régénération des tissus. L’obtention de cellules épithéliales dentaires, telles que les kératinocytes oraux et les cellules de la gaine de la racine épithéliale de Hertwig (HERSC), est cruciale pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires2.
Les cellules épithéliales dentaires dérivées de rongeurs sont isolées de la structure épithéliale, comme le HERS. Li et ses collègues ont isolé et immortalisé des HERSC dérivés de molaires de rat après avoir récolté la partie apicale des germes dentaires en développement de rats âgés de 8 jours3. Le HERS a été séparé du tissu apical sous grossissement. Compte tenu du stade de développement et de l’âge des dents, il est presque impossible de prélever le HERS sur les humains en raison de problèmes éthiques: un germe dentaire en développement doit être retiré d’un jeune enfant pour récolter le HERS humain. Les germes dentaires immatures sont rarement extraits. Les cellules épithéliales dentaires humaines peuvent être isolées de la gencive et du ligament parodontal (PDL). Les cellules dérivées de la structure épithéliale participent à la formation des dents avec des composants mésenchymateux et pourraient être plus appropriées pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires que les kératinocytes oraux. Les restes épithéliaux de Malassez (ERM) sont des restes épithéliaux dérivés de HERS et résident en petit nombre dans le PDL4. Des études font état de l’isolement des HERSC humains de PDL5. Cependant, la récolte de HERSC humains à partir de tissu PDL n’est pas toujours couronnée de succès en raison de la rareté de la population épithéliale à cet endroit5,6.
Bien que les HERSC dérivés de rongeurs soient maintenus dans des milieux contenant du sérum3,7, les cellules épithéliales humaines dérivées du DF sont cultivées avec des milieux sans sérum similaires à d’autres cellules épithéliales humaines, telles que les kératinocytes épidermiques humains normaux et les kératinocytes oraux humains normaux8,9. Cela implique des différences physiologiques ou fonctionnelles entre les cellules épithéliales dentaires des rongeurs et les cellules épithéliales dentaires humaines. La compréhension du mécanisme concernant les interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires pourrait contribuer au développement d’applications cliniques, y compris la réattachement parodontal pendant la replantation, la régénération parodontale dans les maladies parodontales, la régénération du complexe pulpe-dentine et la génération de bio-dent. Compte tenu des caractéristiques de la recherche translationnelle, les cellules épithéliales dentaires humaines peuvent être plus appropriées que les cellules épithéliales dentaires de rongeurs pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses.
Le DF humain est un tissu conjonctif lâche et réside souvent dans une dent touchée. Le DF contient des précurseurs mésenchymateux10. Cependant, à notre connaissance, aucune étude n’a rapporté l’isolement des cellules épithéliales des follicules dentaires avant 2021. Oh et Yi ont rapporté l’isolement des cellules épithéliales de la DF humaine en 20218. Le phénotype épithélial a été confirmé par transfert occidental et analyse morphologique. L’analyse de l’origine des cellules épithéliales dérivées du DF a montré des résultats similaires avec d’autres études. Les cellules épithéliales dérivées du DF n’étaient ni endothéliales ni hématopoïétiques5,11, et Oh et Yi ont suggéré de nommer ces cellules comme DF-HERSC. Le DF a un volume plus important que le PDL, et plus de cellules épithéliales peuvent être isolées du DF. Cela favorise l’émergence de colonies épithéliales et se traduit par un taux de réussite élevé dans la récolte des cellules épithéliales à partir de DF. Cette étude suggère d’utiliser le DF comme source tissulaire pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires.
Dans la présente étude, des cellules individuelles ont été isolées du DF selon les procédures décrites précédemment10,12. Le DF contient des populations cellulaires hétérogènes, et plusieurs types de cellules pourraient être présents au début de la procédure. Morsczek et ses collègues ont isolé des cellules souches mésenchymateuses dérivées du DF10. Nous avons émis l’hypothèse que le DF contient des cellules épithéliales et que seules les cellules épithéliales peuvent survivre dans des conditions sans sérum. Cette étude diffère de celle de Morsczek et al. en termes de sélection de la population épithéliale et d’inhibition des cellules mésenchymateuses. La sélection a été réalisée à l’aide de milieux sans sérum kératinocytes (SFM), qui permettent la prolifération des cellules épithéliales et inhibent la prolifération des cellules mésenchymateuses. Cette étude provient d’un rapport de Oh et Yi8. L’objectif de cette étude était de décrire les détails de la méthode utilisée dans ce rapport pour isoler les cellules épithéliales de la DF humaine.

<table><tbody><tr><td>EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol</td><td>EMD millipore Co., MA, États-Unis</td><td>1096341011</td><td>1 L</td></tr><tr><td>0,05 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco, Grand island, NY, États-Unis</td><td>25300054</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>40 &mu ; Matrice de cellules m</td><td>Falcon, NC, USA</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire (100 x 20 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>172958</td><td>Discontinué</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire (60 x 15 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 1</td><td>Gibco, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>17100017</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Combi-514R / Réfrigérée grande capacité centrifugeuse</td><td>Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, Corée du Sud</td><td>CB-514R</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique</td><td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, Corée du Sud</td><td>50015 50050</td><td>15 mL 50 mL</td></tr><tr><td>Flacon cryogénique</td><td>Corning Inc., NY, États-Unis</td><td>430488</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, US</td><td>D2650-100ml</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco, Grand island, NY, États-Unis</td><td>17105041</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, Corée du Sud</td><td>&nbsp ;LB 001-02</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco, Grand island, NY, États-Unis</td><td>16000044</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heraeus BB 15 / CO2 incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, États-Unis</td><td>51023121</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sans sérum de kératinocytes</td><td>Gibco, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>10724-011</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>MVE CryoSystem 2000</td><td>MVE Biological Solutions Co., GA, États-Unis</td><td>CryoSystem 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Conteneur de congélation</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, États-Unis</td><td>5100-0001</td><td>pour cryoflacons de 1,2 à 2 ml</td></tr><tr><td>Olympus CKX41 / Microscope de</td> <td>culture cellulaire inverséeOlympus Life Science, Waltham, Massachusetts</td><td>22-00723-01</td><td>Fin de la production</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Strep</td><td>Gibco, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>15140122</td><td>100 mL (10 000 U/mL)</td></tr><tr><td>Aide à la pipette XP</td><td>Drummond scientific Co., PA, États-Unis</td><td>HDR-4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman Classic P1000</td><td>Gilson, Villiers le Bel, France</td><td>F123602</td><td>100-1000 &micro ; L</td></tr><tr><td>Réfrigérant</td><td>Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japon</td><td>CLN 540U</td><td>~-80 &deg ; C / Pipette</td></tr><tr><td>sérologique</td> discontinuée <td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, Corée du Sud</td><td>91010</td><td>10ml</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td><td>12605010</td><td>protéase de dissociation cellulaire</td></tr></tbody></table>

isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Le follicule dentaire (DF) a été prélevé lors de l’ablation d’une troisième molaire impactée par un chirurgien maxillo-facial buccal. L’isolement des cellules épithéliales a été effectué le jour de la récolte de DF. Le DF a été lavé trois fois avec du DPBS, puis disséqué avec des ciseaux à tissu jusqu’à ce que le tissu ait une consistance pulpeuse ou squishy. Les populations unicellulaires ont été granulées par centrifugation et lavées avec un milieu sans sérum de kératinocytes. Des populations cellulaires hétérogènes ont été distribuées dans une boîte de culture. Un milieu sans sérum de kératinocytes a été utilisé pour sélectionner les cellules épithéliales. Le milieu de culture a été modifié quotidiennement jusqu’à ce qu’aucun débris flottant ou cellules mortes n’ait été observé. Les cellules épithéliales sont apparues dans les 7 à 10 jours suivant la distribution de la population cellulaire. Les cellules épithéliales ont survécu dans un milieu sans sérum, tandis que le milieu essentiel minimal α-modification complété par 10% de sérum bovin fœtal a permis la prolifération de cellules de type mésenchymateux. Le DF est une source tissulaire pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires.
Le but de cette étude était d’établir une méthode pour l’isolement des cellules épithéliales de la DF humaine. Le ligament parodontal (PDL) a été utilisé pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires humaines. L’obtention de cellules épithéliales à partir de PDL humaine n’est pas toujours efficace en raison du petit volume de tissu, ce qui entraîne un faible nombre de cellules épithéliales. DF a un volume plus grand que PDL et contient plus de cellules. Le DF peut être une source tissulaire pour la culture primaire de cellules épithéliales dentaires humaines. Ce protocole est plus facile et plus efficace que la méthode d’isolement utilisant PDL. L’obtention de cellules épithéliales dentaires humaines peut faciliter d’autres études sur les interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires.

Récolte de DF La chirurgie a été réalisée par un chirurgien maxillo-facial buccal. Les matériaux d’origine humaine, y compris le fragment de dent, le tissu gingival et le DF, ont été recueillis par un chirurgien (Figure 1A). Le DF peut être attaché au fragment de dent. Un chirurgien maxillo-facial buccal sera en mesure d’identifier le DF. La coopération et la communication avec le chirurgien sont nécessaires pour la collecte de tissus. Le DF est un tissu membranaire de fo...

Le follicule dentaire contient une population épithéliale et des cellules mésenchymateuses. La population épithéliale a été sélectionnée parmi la population hétérogène de cellules folliculaires dentaires en fournissant un milieu de culture distinct. Les cellules épithéliales ont survécu et ont formé des colonies dans un milieu sans sérum.

Isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Ce protocole démontre une méthode améliorée pour l’obtention de cellules épithéliales dentaires humaines. Il est difficile d’identifier la pastille de cellule agrégée pendant les procédures. Soyez prudent lorsque vous manipulez un surnageant pour éviter la perte de populations de cellules.Pour commencer, récoltez les follicules dentaires lors de l’extraction chirurgicale des troisièmes molaires touchées. Commencez les procédures d’isolement cellulaire ou stockez les follicules dentaires à quatre degrés Celsius dans le DPBS avec 3% de pénicilline-streptomycine. Pour laver les follicules dentaires, tenez le follicule dentaire avec une pince à épiler et placez-le dans le tube de lavage 1.Secouez-le doucement 10 à 15 fois. Sortez-le et placez-le dans le tube 2. Encore une fois, secouez-le 10 à 15 fois.Enfin, sortez-le et placez-le dans le tube 3, puis secouez-le. Après avoir lavé trois fois, placez le follicule dentaire dans un plat de culture de 60 millimètres. Hachez le tissu avec des ciseaux à tissu jusqu’à ce que le follicule dentaire ait un aspect pulpeux ou squishy.Utilisez une petite section latérale du plat de culture pour minimiser la perte de tissu. Mélanger un millilitre de

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Biologie

Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant...

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

L'incisive de la souris en croissance continue fournit un modèle pour l'étude de renouvellement des tissus dentaires à partir de cellules souches épithéliales dentaires (DESCs). Un système solide de façon cohérente et fiable obtention de ces cellules de l'incisive et leur expansion in vitro est rapporté ici.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Le follicule pileux de souris est un modèle idéal pour étudier la biologie des cellules souches adultes. Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler différentes populations de follicules pileux, de cellules souches et de kératinocytes épidermiques, en utilisant la digestion enzymatique de la peau dorsale de souris suivie d’une analyse FACS.

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

Ce protocole décrit le génie génétique transitoire dentaire des cellules souches extraites du follicule dentaire humaine. La stratégie appliquée modification non viraux peut-être devenir une base pour l’amélioration des produits thérapeutiques des cellules souches.

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

Ce manuscrit décrit un protocole basé sur le FACS pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. Il contourne la culture in vitro qui était inévitable avec le protocole d’isolement couramment utilisé par les cultures explant. Les sous-ensembles de fibroblastes qui émanent sont fonctionnellement distincts et présentent une expression et une localisation différentielles dans le derme.

Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

Nous présentons une méthode pour isoler et cultiver les cellules épithéliales salivaires humaines primaires dérivées. Ces cellules présentent des modèles d'expression génique compatibles avec le fait qu'elles soient d'origine épithéliale salivaire et peuvent être cultivées sous forme de salisphères sur des matrices de membrane de sous-sol dérivées de cellules tumorales Engelbreth-Holm-Swarm ou comme monocouches sur des plats de culture traités.

Isolement des cellules épithéliales salivaires des glandes salivaires humaines pour la croissance in vitro comme Salispheres ou Monolayers

Nous présentons ici une méthode modifiée pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales humaines en ajoutant l’inhibiteur de Rock, Y-27632, à la méthode traditionnelle. Cette méthode est plus facile, prend moins de temps, améliore les propriétés des cellules souches et produit un plus grand nombre de cellules épithéliales à fort potentiel à la fois pour le laboratoire et pour les applications cliniques.

Isolement et culture de cellules épithéliales gingivales humaines primaires à l’aide de Y-27632

Le protocole actuel présente une méthode rapide, efficace et douce pour isoler des cellules individuelles adaptées à l’analyse de l’ARN unicellulaire à partir d’une incisive de souris, d’une molaire de souris et de dents humaines en croissance continue.

Isolement rapide des cellules individuelles des dents de souris et humaines

Ce protocole décrit une méthode d’une journée pour l’isolement des cellules épithéliales des trompes de Fallope humaines. Les cellules épithéliales isolées peuvent être plaquées en culture bidimensionnelle (2D) ou dissociées en suspensions unicellulaires et utilisées dans des expériences en aval, y compris la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire.

Une méthode efficace d’extraction de l’épithélium de la trompe de Fallope humaine pour des analyses de cellules uniques

Apprenez l'isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain à l'aide de collagénase et trypsine-EDTA. Cette méthode optimise la formation de colonies en milieu sans sérum pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses.

Isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain

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