Isolement des cellules musculaires lisses aortiques primaires spécifiques au patient et mesures semi-quantitatives de contraction en temps réel in vitro

Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier la contraction cellulaire de plusieurs lignées cellulaires de patients simultanément. Cela nous permet d’étudier les maladies plus rapidement et plus efficacement. Cette technique nous permet de quantifier la contraction cellulaire en temps réel.

En une heure, nous pouvons obtenir les valeurs de contraction de dizaines de cellules. Nous avons démontré pour la première fois que la contraction des cellules musculaires est diminuée chez un groupe de patients atteints d’anévrismes de l’aorte. Cela peut être un nouveau biomarqueur ou une nouvelle cible pour un traitement médical.

Commencez par stériliser deux paires de pinces chirurgicales et un scalpel en les immergeant dans de l’éthanol à 70% et en les essuyant ensuite. Ensuite, pipettez deux millilitres de milieu SMC dans une boîte de Pétri dans laquelle la dissection tissulaire sera effectuée. Pipette suivante 2,5 millilitres de milieu SMC dans deux flacons T-25.

Faites tourbillonner les flacons de sorte que le petit volume de milieu recouvre toute la surface. Inspecter visuellement la biopsie, en identifiant les trois couches aortiques par la présence de plaques d’athérosclérose du côté intima et de tissu conjonctif visqueux du côté adventice pour distinguer les couches. Pour isoler les SMC du milieu, retirez les deux autres couches en plaçant d’abord le tissu avec la plaque intima vers le haut, puis retirez la plaque solide en l’éloignant du tissu avec une pince tout en poussant le tissu vers le bas avec la deuxième paire de pinces jusqu’à ce que la couche médiale uniforme rose soit visible.

Maintenant, retournez le tissu et répétez la même procédure en retirant la couche adventice, en vous assurant d’enlever toutes les parties visibles en autant de tentatives que nécessaire, car cette couche ne se détachera pas facilement du support. Une fois la couche de média isolée, coupez le tissu en cubes en appuyant sur le support avec une pince et en coupant le tissu dans une direction à l’aide du scalpel en effectuant des coupes unidirectionnelles propres pour minimiser les dommages. Placez 10 à 20 de ces morceaux de tissu dans le quart supérieur de la flak T-25 à l’aide d’une pince.

Après avoir stérilisé deux paires de pinces chirurgicales et un scalpel comme décrit précédemment, pipettez deux millilitres de milieu fibroblastique dans une boîte de Pétri dans laquelle la dissection tissulaire sera effectuée. Ensuite, pipetez 2,5 millilitres de milieu fibroblastique dans deux flacons T-25 et faites tourbillonner les flacons de sorte que le petit volume de milieu recouvre toute la surface. Inspectez visuellement la biopsie pour identifier l’épiderme avec une surface cutanée reconnaissable, parfois avec des cheveux visibles, puis recherchez la graisse sous-cutanée jaune et visqueuse du côté opposé.

La couche entre l’épiderme et la graisse sous-cutanée est le derme, la source de fibroblastes viables. Pour isoler les fibroblastes du derme, retirez les deux autres couches en plaçant le tissu du côté du derme pour rendre les trois couches visibles. Ensuite, maintenez le tissu vers le bas avec une pince et coupez tout l’épiderme en une ligne propre sans endommager le tissu.

Maintenant, retournez le tissu et répétez la même procédure en coupant dans le derme parallèlement à la bordure avec la graisse sous-cutanée. Une fois le derme isolé, coupez le tissu en cubes en pressant le tissu avec une pince et en coupant le tissu dans une direction à l’aide du scalpel. Placez ensuite 10 à 20 de ces morceaux de tissu dans le quart supérieur de la fiole T-25 à l’aide de la pince.

Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et ensemencer les SMC en trois fois à une densité d’ensemencement de 30 000 cellules par puits dans 200 microlitres de milieu SMC dans la plaque ECIS recouverte de gélatine. Placez la plaque avec les SMC dans le support de 96 puits de l’ECIS dans l’incubateur de culture cellulaire. Double-cliquez sur le logiciel ECIS Applied BioPhysics pour ouvrir le programme et appuyez sur le bouton Configuration.

Vérifiez si toutes les électrodes sont en contact avec le support dans le panneau inférieur gauche étiqueté Configuration du puits. Si les électrodes ne sont pas correctement connectées, ajustez la plaque dans le support avant de commencer la mesure. Sélectionnez maintenant le type de plaque dans le même panneau en cliquant sur Type de tableau.

Ensuite, préparez deux pipettes réglées à deux microlitres et 150 microlitres de volume. Avant de commencer la stimulation, appuyez sur Marquer dans le logiciel et placez un commentaire. Pour stimuler les cellules, retirez le couvercle et placez-le sur une surface stérile à l’intérieur de l’incubateur.

Ensuite, induisez la contraction de SMC en pipetant deux microlitres de la solution de travail d’ionomycine dans chaque puits le plus rapidement possible. Une fois que toutes les cellules ont été stimulées, mélanger le milieu dans les puits à l’aide de la deuxième pipette. Pour déterminer la reproductibilité de la mesure interexpérimentale, deux mesures indépendantes de toutes les lignées cellulaires de contrôle et de patients incluses ont été tracées sous la forme d’un diagramme de Bland-Altman, démontrant que cette méthode ne montrait pas de variabilité en dehors de l’intervalle de confiance, à l’exception d’une lignée cellulaire aberrante.

Deux puits ensemencés avec la même expérience et stimulés simultanément ont montré pratiquement la même courbe de réponse contractuelle. Pour valider si la réponse montrée était une contraction et non un stress osmotique en raison de la stimulation à l’ionomycine, le milieu a été remplacé après la stimulation et le comportement des cellules a été enregistré, ce qui a montré que les cellules stimulées ont recommencé à se propager sur l’électrode. La réponse contractile dans les SMC dérivées d’aortes saines et non dilatées a montré une réponse médiane de 61% par rapport à la réponse médiane de 52% des patients atteints d’anévrisme de l’aorte abdominale.

La réponse contractile moyenne du groupe témoin a été utilisée pour identifier quatre patients qui avaient des valeurs de contraction inférieures aux valeurs normales. L’analyse par transfert western et la quantification subséquente ont confirmé que les cellules expriment des marqueurs SMC. Pour déterminer la capacité proliférative du SMC, la qPCR a été réalisée pour Ki67.

L’expression de Ki67 était détectable dans toutes les cellules, mais n’était pas corrélée avec la sortie contractile. Lorsque vous stimulez les cellules pour la contraction, n’oubliez pas de ne pas pipeter trop de puits en même temps et d’essayer de pipeter le plus rapidement possible. Cette procédure peut nécessiter un peu de pratique.

En utilisant cette méthode, nous avons divisé les patients en fonction de leur contraction et pour abaisser la contraction normale, ce qui nous a permis d’étudier ces patients et les liens avec leurs caractéristiques cliniques telles que le tabagisme.