Quantification des paramètres vasculaires dans les rétines montagnards entières de souris atteintes de rétinopathies non prolifératives et prolifératives

Dans les rétinopathies, les altérations vasculaires sont le premier signe détecté par les cliniciens. Ils suivent la progression de la maladie et choisissent un traitement en fonction de ces changements. Plusieurs modèles animaux ont été développés afin d’étudier les différents stades de la pathologie.

Dans ce travail, nous allons montrer comment mesurer différentes altérations vasculaires. Pour cela, nous allons utiliser deux modèles animaux. L’un d’eux est le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène, qui reproduit la rétinopathie de la prématurité et certains aspects de la rétinopathie diabétique proliférative.

Ici, nous allons mesurer les zones avasculaires, les zones néovasculaires, ainsi que la dilatation et la tortuosité des artérioles. Dans notre laboratoire, un modèle murin de syndrome métabolique a été développé, qui induit une rétinopathie non proliférative. La densité vasculaire et la ramification ont été évaluées dans ce travail.

Lors du sacrifice de souris, énucléatiser avec des ciseaux. Fixez les yeux énucléés avec du paraformaldéhyde fraîchement préparé pendant une heure à température ambiante. Sous le microscope à dissection, retirez les cornées avec des ciseaux en coupant le long des limbes et disséquez toute la rétine.

Jetez le segment antérieur de l’œil, puis séparez la rétine de la choroïde RPE. Placez les rétines dans des tubes de 200 microlitres. Ensuite, bloquez et perméabilisez les rétines dans 100 microlitres de TBS contenant 5% d’albumine sérique bovine Triton pendant six heures à quatre degrés avec une légère agitation dans le shaker.

Ensuite, inverser le tube pour placer la rétine dans la tasse et retirer la solution bloquante avec une pipette. Ajouter 100 microlitres contenant de l’isolectine. Enveloppez les tubes avec du papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière.

Incuber les rétines avec une solution de lectine pendant la nuit à quatre degrés avec une agitation douce dans le shaker. Lavez les rétines avec 100 microlitres de TBS-Triton pendant 20 minutes avec une agitation douce dans le shaker. Répétez cette étape trois fois.

Placez la rétine dans une lame et ajoutez une goutte de PBS. Au microscope à dissection, effectuez quatre coupes également éloignées des bords de la rétine vers le nerf optique. Pour déplier les pétales de la rétine, utilisez des pinces ou de petits morceaux de papier filtre.

Assurez-vous que le côté photorécepteur est orienté vers le bas. Retirez le PBS restant de la diapositive avec du papier filtre. Ajoutez ensuite une médiane de montage et un couvercle.

Laissez sécher pendant une heure à température ambiante. Rangez les diapositives à quatre degrés à l’abri de la lumière. Au microscope confocal, placez la lame dans la plaque face vers le bas.

Focalisez le plexus supérieur du système vasculaire rétinien et sélectionnez une zone pour commencer l’acquisition de l’image. Définissez les paramètres généraux du laser dans le logiciel. Définissez les coordonnées dans les axes X, Y et Z.

Initialisez l’analyse. Une fois le processus de numérisation terminé, ouvrez l’image et enregistrez-la avec une extension préférée. Dans le logiciel ImageJ FIJI, allez dans la barre de menus et cliquez sur Fichier, Ouvrir.

Sélectionnez l’image à traiter. Dans la fenêtre Option d’importation des bioformats, sélectionnez Afficher les métadonnées OME-XML et cliquez sur OK.In la fenêtre Métadonnées OME, recherchez les informations sur la taille des pixels. Copiez ces données.

Pour l’étalonnage de l’image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Propriétés de l’image. Copiez les informations et cliquez sur OK. Attribuez un lut préféré à l’image. Pour visualiser toute la pile dans une seule image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Image, Piles, Projet Z.

Dans la fenêtre de projection affichée, sélectionnez toutes les piles où les navires sont visualisés. Dans Type de projection, choisissez Intensité moyenne et cliquez sur OK. Accédez à la barre de menus, Image, Réglage, Luminosité / Contraste. Cliquez sur Appliquer et enregistrez les modifications.

Copiez les paramètres sélectionnés pour la luminosité et le contraste. Celles-ci doivent être identiques pour toutes les images. Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette.

Sélectionnez la zone rétinienne qui manque de vaisseaux formés. Appuyez sur T sur le clavier pour enregistrer les zones sélectionnées dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les informations de la zone avasculaire.

Répétez ces étapes pour mesurer la surface totale de la rétine. Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette. Zoomez sur l’image pour mieux visualiser les néovassels.

Sélectionnez les neovessels un par un avec l’outil Baguette. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de zone.

Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite. Zoomez sur l’image pour mieux visualiser la paroi du navire. Effectuez trois lignes transversales jusqu’au navire principal avant la première branche.

Appuyez sur T sur le clavier pour enregistrer les zones sélectionnées dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distance. Dans la barre de menus, cliquez sur l’icône de l’outil Ligne droite avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ligne segmentée.

Tracez une ligne à l’intérieur du vaisseau à partir du nerf optique jusqu’à la ramification du premier vaisseau, en suivant la forme vasculaire. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite.

Tracez une ligne à partir du nerf optique jusqu’à la première ramification du vaisseau. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distances.

Avec l’outil Ovale de la barre de menus, définissez une zone appliquée de manière égale à toutes les conditions expérimentales. La zone sélectionnée doit être un cercle concentrique dessiné autour du nerf optique. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.

Comptez manuellement le nombre de branches primaires provenant des navires principaux à l’intérieur de la zone de sélection. Transformez l’image en mode 8 bits. Allez dans Plugins dans la barre de menus, sélectionnez Analyse des vaisseaux, Densité vasculaire.

Définissez une zone avec l’outil Carré de la barre de menus où vous souhaitez mesurer la densité du navire. Cliquez sur OK. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Dans le premier exemple expérimental, le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène a été utilisé.

Des injections intravitréennes ont été effectuées au jour postnatal 12 pour déterminer l’efficacité d’un médicament en tant qu’antiangiogénique. Des souris injectées avec un véhicule ont été utilisées comme témoins. Les zones avasculaires sont définies comme les zones dépourvues de vaisseaux sanguins rétiniens.

À partir des images acquises, les zones avasculaires peuvent être quantifiées comme la somme des régions sans vaisseaux divisées par la surface totale de la rétine. Les zones endommagées par des dommages mécaniques montrent également l’absence de navires. Pour identifier les zones endommagées, analysez l’intégrité des couches neuronales avec la tache de Hoechst.

Les néovaisseaux sont des vaisseaux de petit calibre qui proviennent de vaisseaux préexistants du plexus vasculaire supérieur. Nous avons calculé la surface occupée par les touffes de néovassels en quantifiant l’aire néovasculaire de la rétine occupée par l’aire totale de la rétine. Comme la forme et la taille des néovaisseaux sont variables, ils peuvent parfois ressembler à des débris et à des artefacts.

Pour distinguer les néovaisseaux, vérifiez que la touffe se développe à partir d’un récipient mature. Pour l’analyse de la dilatation, nous avons mesuré le diamètre du vaisseau principal à trois hauteurs avant la première branche. Les chercheurs doivent définir une distance prédéterminée pour mesurer le diamètre des vaisseaux afin de réduire la variabilité entre les résultats.

Idéalement, le point le plus éloigné du nerf optique devrait être d’environ 300 micromètres. Nous suggérons d’effectuer l’analyse, et plus tard, en moyenne d’au moins six animaux par condition. En ce qui concerne la tortuosité, nous mesurons la distance parcourue par le vaisseau principal suivant sa forme, par rapport à la distance en ligne droite entre le nerf optique et le premier point de ramification.

Comme nous pouvons le voir sur l’image, il y a une hétérogénéité dans la sinuosité des principaux vaisseaux. Pour obtenir un résultat représentatif, pas moins de six souris par condition doivent être quantifiées. Les derniers paramètres, la ramification vasculaire et la densité, ont été analysés dans un modèle de syndrome métabolique présentant une rétinopathie non proliférative.

Pour la mesure de la ramification vasculaire, nous avons défini la zone de quantification en dessinant un cercle concentrique, puis nous avons compté, une par une, les branches primaires provenant d’un vaisseau central principal. À partir des images acquises, la densité vasculaire a été quantifiée comme la zone occupée par les vaisseaux divisée par la zone du ROI, qui était positionnée à différents endroits dans chaque microphotographie. Évitez de quantifier les zones avec des dommages mécaniques.

S’il y a plus de deux zones avec des ponctions, la rétine doit être jetée. En résumé, dans cet article, nous avons montré des techniques classiques, bien établies et reproductibles pour quantifier certains des paramètres les plus pertinents en tenant compte dans la pratique clinique.