Imagerie vivante et quantification de l’infection virale chez des souris transgéniques K18 hACE2 à l’aide du SARS-CoV-2 recombinant exprimant le rapporteur

Notre protocole décrivait l’utilisation du SARS-CoV-2 recombinant fluorescent ou luminescent pour la détection virale par imagerie vivante in vivo et ex vivo et le suivi viral dans le modèle murin transgénique ACE2 humain K18 de l’infection par le SARS-CoV-2. Le principal avantage de cette technique est l’application et la faisabilité de la détection et du suivi viraux pour les études in vivo et ex vivo du SARS-CoV-2 dans le modèle murin transgénique ACS2 humain K18. L’utilisation de l’imagerie in vivo du SARS-CoV-2 dans le modèle murin transgénique ACE2 humain K18 représente une excellente option pour évaluer les traitements thérapeutiques pour le traitement de l’infection par le SARS-CoV-2 in vivo.

La mise en œuvre de rapporteurs SARS-CoV-2 représente une excellente option pour évaluer la pathogénicité, la réplication virale et le trophisme in vivo. Pour les études in vivo avec la luciférase exprimant le SARS-CoV-2, il est recommandé de raser les souris et d’obtenir une imagerie rapide après l’injection du substrat pour améliorer le signal de bioluminescence. Commencez la surveillance de la bioluminescence en lançant le système d’imagerie in vivo, ou IVIS, et en configurant les paramètres, cliquez sur le mode image sur Bioluminescence, puis ouvrez le filtre et réglez le temps d’exposition sur Auto.

Ensuite, retirez une souris déjà rasée et anesthésiée de la chambre d’isolement et utilisez une aiguille de calibre 25 pour administrer rétro-orbitalement 100 microlitres du substrat de luciférase dilué 1 à 10 dans PBS à la souris. Replacez ensuite la souris dans la chambre d’isolement, transférez la chambre d’isolement à la machine IVIS, qui est équipée d’un composant chauffant pour prévenir l’hypothermie, et fermez la porte de l’imageur IVIS pour initialiser l’imagerie en sélectionnant Acquérir dans le logiciel. Pour analyser les images de bioluminescence acquises, utilisez l’outil ROI ou région d’intérêt du logiciel pour désigner le signal précis et mesurer le flux.

Lancez le logiciel d’imagerie et configurez les paramètres. Cliquez sur le mode image sur Fluorescence, réglez l’excitation à 500 nanomètres et les filtres d’émission à 530 nanomètres, et réglez le temps d’exposition sur Auto. Effectuez une nécroscopie et excisez les poumons de souris.

Placer les poumons excisés dans une plaque de 6 puits contenant deux millilitres de 1X PBS et rincer pour éliminer l’excès de sang. Désinfectez et nettoyez les outils chirurgicaux entre les échantillons à l’aide d’éthanol à 70%. Après avoir initialisé la machine IVIS, placez les poumons sur une feuille noire et séparez les tissus les uns des autres.

Placez ensuite le plateau à l’intérieur de la chambre d’isolement à l’intérieur de l’armoire de biosécurité, puis transférez la chambre d’isolement à l’IVIS. Fermez la porte de l’imageur IVIS et cliquez sur Acquérir pour lancer le système d’imagerie. Pour analyser la fluorescence, utilisez l’outil ROI et dessinez des ROI autour de chacun des poumons individuels.

Mesurez chaque retour sur investissement manuellement, puis utilisez les valeurs moyennes d’efficacité radiante données et soustrayez des souris infectées par des simulacres. Une fois l’imagerie terminée, placez les tissus dans un cryotube pour que la congélation de la glace carbonique soit stockée à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur. En utilisant le supernate obtenu à partir des homogénats tissulaires, effectuer une dilution en série décuplée et infecter les monocouches confluentes des cellules Vero E6 avec un millilitre de chaque dilution surnageante dans des triplicates.

Laissez le virus s’adsorber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Une fois cela fait, lavez les cellules avec un millilitre de 1X PBS, puis incubez les cellules dans deux millilitres de milieux post-infection contenant 1% d’agar dans l’incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Après l’incubation, inactivez les plaques dans du formol tamponné à 10% neutre pendant 24 heures à quatre degrés Celsius, en veillant à ce que toute la plaque soit immergée.

Sortez les plaques du niveau de biosécurité trois et lavez les cellules trois fois avec un millilitre de Triton X-100 à 0,5 % pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, bloquez les cellules perméabilisées avec un millilitre d’albumine sérique bovine de 2,5 ou BSA et PBS pendant une heure à 37 degrés Celsius, suivie d’une incubation dans un millilitre d’un microgramme par millilitre de l’anticorps monoclonal réactif croisé 1C7C7 dilué dans 2,5 BSA pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules trois fois avec un millilitre de 1X PBS et développez les plaques à l’aide des kits de substrat de peroxydase ABC et diaminobenzène, ou DAB, conformément aux instructions du fabricant, puis calculez les titres viraux sous forme d’unités formant de la plaque par millilitre.

Dans l’étude, il a été observé que la nanoluciférase bioluminescente, ou Nluc, était facilement détectée et que les souris infectées par le rSARS-CoV-2 Nluc, mais pas celles infectées par le type sauvage rSARS-CoV-2 ou simulé infectées. Les analyses quantitatives ont montré l’intensité de Nluc à différents jours après l’infection. Les lésions grossières à la surface pulmonaire des souris infectées par rSARS-CoV-2 Nluc étaient comparables à celles du groupe infecté par le type sauvage rSARS-CoV-2.

De plus, les titres viraux détectés et les souris infectées par le rSARS-CoV-2 Nluc étaient comparables à celles infectées par le type sauvage rSARS-CoV-2 dans tous les organes à différents jours après l’infection. Dans le même temps, l’activité de Nluc n’a été détectée dans les organes que de souris infectées par rSARS-CoV-2 Nluc. Un groupe distinct de souris infectées par un faux virus et infectées par le virus a été surveillé pendant 12 jours pour détecter tout changement de poids corporel et de survie.

Les souris infectées par rSARS-CoV-2 Nluc et rSARS-CoV-2 de type sauvage ont perdu jusqu’à 25% de leur poids corporel et succombent toutes à une infection virale entre sept et huit jours après l’infection. Après l’infection de Vénus par rSARS-CoV-2, l’expression de Vénus a été facilement détectée dans tous les poumons de souris infectées par rSARS-CoV-2 Venus, mais pas celles infectées par rSARS-CoV-2 de type sauvage ou simulé infecté. Les analyses quantitatives ont montré que l’intensité de Vénus culmine deux jours après l’infection et diminue au cours de l’infection et des poumons des souris infectées.

Les images de la surface des poumons ont révélé que les lésions grossières de souris infectées par rSARS-CoV-2 Venus étaient comparables à celles de souris infectées par rSARS-CoV-2 de type sauvage. En outre, l’infection par rSARS-CoV-2 Venus a entraîné des titres viraux comparables à ceux observés chez les souris infectées par le type sauvage rSARS-CoV-2 dans tous les organes. Les souris infectées par rSARS-CoV-2 Venus et rSARS-CoV-2 de type sauvage ont perdu jusqu’à 25% de leur poids corporel et succombent à une infection virale au neuvième jour après l’infection sans survie.

Les résultats du déclarant exprimant le SRAS-CoV-2 se sont révélés être des substituts valides de l’infection virale. Ainsi, cela pourrait conduire à l’identification et à l’évaluation rapides des contre-mesures pour le traitement de l’infection par le SRAS-CoV-2.