Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Le principal avantage de cette technique est que l’animal peut grandir librement à l’intérieur de l’appareil et peut être piégé pour une imagerie haute résolution. L’appareil peut être réutilisé plusieurs fois. Lors de la fabrication de l’appareil, la propreté est le facteur le plus important pour pouvoir fabriquer des appareils sans poussière afin d’éviter les fuites pendant le fonctionnement de l’appareil.

Pour commencer, concevez le modèle un pour la couche d’écoulement et le motif deux pour la couche de contrôle en utilisant des formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte et imprimez les masques photo à l’aide d’un traceur laser avec une taille de caractéristique minimale de huit micromètres sur un film à base de polyester. Découpez les plaquettes de silicium en morceaux carrés de 2,5 centimètres de hauteur et de largeur. Nettoyez-les avec de l’hydroxyde de potassium à 20% pendant une minute et rincez les gaufrettes à l’eau désionisée.

Utilisez une plaquette pour le flux et l’autre pour la couche de contrôle. Sécher les morceaux avec 14 gaz azotés comprimés P-S-I suivi d’une déshydratation sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius pendant quatre heures. Après refroidissement, prenez un morceau de silicium, placez-le sur le mandrin d’un codeur de spin et allumez le vide pour maintenir la plaquette en place.

Mettez environ 20 microlitres d’hexaméthyldisilane sur le morceau de silicium et enduisez-le à l’aide du codeur de spin à 500 R-P-M pendant cinq secondes, suivi de 3000 R-P-M pendant 30 secondes. Pour obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme d’environ 40 micromètres spécifiques à la couche d’écoulement, enduisez la plaquette de silicium d’environ 1,5 millilitre de résine photosensible négative à l’aide d’un codeur de spin à 500 R-P-M pendant cinq secondes, suivi de 2000 R-P-M pendant 30 secondes. Répéter le revêtement de la pièce de silicium avec de l’hexaméthyldisilane et une photorésine négative pour la deuxième plaquette afin d’obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme d’environ 40 micromètres spécifique à la couche de contrôle.

Alternativement, pour augmenter l’épaisseur de la couche d’écoulement à environ 80 micromètres pour les animaux plus âgés, enduisez les plaquettes de silicium avec environ 1,5 millilitre de résine photosensible négative deux, en utilisant le codeur de spin à 500 R-P-M pendant cinq secondes suivi de 2000 R-P-M pendant 30 secondes. Faites cuire les deux morceaux de silicone préalablement recouverts de résine photosensible sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant une minute, puis 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après refroidissement, placez des morceaux de silicone cuits doux sur la platine d’exposition de l’illuminateur U-V avec la surface revêtue de résine photosensible face à la lampe U-V.

Exposez les deux pièces séparément à U-V pendant 15 secondes à l’aide d’une lampe de 200 watts à travers un masque photo avec les motifs un et deux pour obtenir respectivement les couches de flux et de contrôle. Faites cuire les deux morceaux de silicone exposés comme décrit précédemment avec les couches enduites tournées vers le haut. Après avoir refroidi les pièces, développez les motifs en trempant les pièces de silicone dans la solution de révélateur de résine photosensible pendant 20 minutes.

Une fois le motif visible, rincez les morceaux avec de l’alcool isopropylique pur et séchez-les doucement à l’azote gazeux. Gardez les morceaux de silicone dans un dessiccateur avec la surface revêtue vers le haut. Exposez les morceaux aux vapeurs de silane en versant 50 microlitres de T-C-P-F-O-S pur sur une lame de verre.

Placez la lame à l’intérieur d’un dessiccateur et incuber pendant deux heures. Faire P-D-M-S dans un gobelet en plastique en mélangeant la base en élastomère avec l’agent durcissant et remuer constamment pendant trois minutes. Dégazez le mélange P-D-M-S dans un dessiccateur pendant 30 minutes pour éliminer toutes les bulles d’air.

Placez les plaquettes de silicium de la couche de contrôle dans une boîte de Petri et versez une couche de mélange P-D-M-S de cinq millimètres d’épaisseur sur les morceaux de silicium. Après le processus de coulée P-D-M-S, répétez le dégazage du mélange P-D-M-S. Placez la plaquette de silicium avec couche d’écoulement face au camion de filature en appliquant une pression de vide de 200 à 500 millitorr.

Versez environ un millilitre de P-D-M-S sur la tranche de silicium. Encodez-le à l’aide d’un enrobage pour obtenir une couche d’environ 80 micromètres d’épaisseur. Faites cuire les deux plaquettes de silicium avec le P-D-M-S enduit de spin et versez des couches P-D-M-S à 50 degrés Celsius dans un four à convection à air chaud pendant six heures.

Après refroidissement, les morceaux coupent la couche P-D-M-S de cinq millimètres d’épaisseur de la pièce de silicium autour de la couche de contrôle à l’aide d’une lame tranchante et décollez-la du substrat de silicium. Poinçonner deux trous d’environ un millimètre de diamètre à l’aide d’une perforeuse Harris au réservoir du bloc P-D-M-S pour connecter le canal d’immobilisation et les entrées du canal d’isolement aux conduites de gaz pour les déviations de membrane P-D-M-S. Placez la pièce de silicium avec la couche P-D-M-S enduite de spin sur le motif un avec la surface revêtue P-D-M-S tournée vers le haut sur un plateau en plastique.

Gardez le bloc P-D-M-S perforé avec le motif deux sur le plateau avec le côté moulé vers le haut. Gardez le plateau en plastique à l’intérieur d’un nettoyant plasma et exposez les deux surfaces P-D-M-S à 18 watts de plasma d’air pendant deux minutes en appliquant un faible vide. Retirez les deux blocs traités au plasma et liez-les doucement en pressant les surfaces traitées au plasma des motifs un et deux ensemble.

Faites cuire les motifs collés à 50 degrés Celsius pendant deux heures dans un four à convection à air chaud. Après avoir sorti le dispositif collé du four, découpez-le dans une plaquette de silicium avec le motif un et le modèle deux et percez des trous dans les réservoirs d’entrée et de sortie de la couche d’écoulement à l’aide du perforateur Harris. Placez le bloc P-D-M-S collé avec la couche d’écoulement vers le haut sur un plateau en plastique et gardez un verre de couverture propre sur le même plateau.

Exposez les blocs dans le verre de couverture à un plasma d’air de 18 watts pendant deux minutes. Ajustez la pression du vide pour voir une chambre violette. Placez le bloc P-D-M-S exposé au plasma sur le verre de couverture et faites cuire la structure collée dans un four à 50 degrés Celsius pendant deux heures.

Rangez l’appareil dans une chambre propre pour toute expérience future. Prenez l’appareil, placez-le sur un stéréomicroscope et fixez les tubes. Connectez un tube microflex à une conduite d’azote gazeux comprimé et à un connecteur à trois voies à l’autre extrémité.

Connectez respectivement les tubes un et deux des connecteurs à trois voies au piège dans les membranes isolantes. Connectez deux tubes microflexes aux deux orifices de sortie du robinet d’arrêt à trois voies. Connectez l’autre extrémité des deux tubes à une aiguille de calibre 18 de huit millimètres de long.

Remplissez la couche d’écoulement avec un tampon M-9 à l’aide d’une micropipette à travers l’orifice d’entrée. Remplissez les deux tubes avec de l’eau désionisée par l’extrémité reliée à l’aiguille. Insérez les deux aiguilles dans les trous perforés reliant la membrane d’isolement et de piégeage.

Ouvrez le régulateur d’azote gazeux à 14 P-S-I et tournez la vanne à trois voies du tube un pour pousser l’eau dans l’appareil à travers les canaux microfluidiques dans les couches de contrôle, à savoir le piège et les membranes d’isolement. Relâchez la pression à l’aide du robinet d’arrêt à trois voies, une fois que les canaux sont remplis d’eau et amorcés. Retirez les bulles en faisant circuler des fluides supplémentaires dans le canal d’écoulement.

La figure montre des images de P-S-3-2-3-9, animal grandissant à l’intérieur de la puce microfluidique et immobilisé toutes les huit à 10 heures pour capturer des images de fluorescence. La variation du modèle d’expression représente un exemple de régulation génique temporelle où le même gène est exprimé dans différentes cellules à différents stades de développement. L’imagerie du génotype W-D-I-S-5-1 individuel de caenorhabditis elegans montre une architecture dendritique ramifiée de type menorah dans chaque neurone P-V-D comprenant des processus primaires, tertiaires secondaires et quaternaires aux stades de développement L-2, L-2, L-3 et L-4 respectivement.

La figure ci-dessous compare les animaux de développement P-V-D et les animaux cultivés par dispositif, et ceux cultivés sur des plaques N-G-M. Le nombre de S-P et de Q-P à différents stades de développement du ver augmentait avec l’âge. Caenorhabditis elegans a été traité avec une goutte de lévamisole à trois millimolaires pour provoquer une paralysie suffisante nécessaire à l’imagerie à haute résolution.

Les valeurs de S-P n’étaient pas significativement différentes lorsqu’elles étaient mesurées à partir d’animaux stades similaires cultivés sur des plaques N-G-M et imagées à l’aide de trois millimolaires de lévamisole sur une lame de gélose Agar. De plus, la distance entre les deux corps cellulaires P-V-C, l’un présent dans la queue et le second présent près de la vulve, augmente à mesure qu’ils s’éloignent chez les animaux élevés dans le dispositif et ceux cultivés sur des plaques N-G-M. La figure représente l’image haute résolution des neurones récepteurs tactiles d’animaux poussant à l’intérieur du dispositif microfluidique.

Le montage représente l’ensemble du processus neuronal P-L-M-R à des moments successifs mettant en évidence les mitochondries et le processus neuronal. Le graphique représente la longueur totale du processus neuronal qui a été observée pour augmenter avec une pente de 10,4 micromètres par heure. Le dispositif microfabriqué utilise une fine membrane P-D-M-S déviée en présence d’azote gazeux à haute pression pour immobiliser et maintenir les C-elegans en place pour l’imagerie à haute résolution.

Cette procédure peut permettre des études longitudinales des processus cellulaires et subcellulaires chez C-elegans qui nécessitent des observations intermittentes sur une longue période de temps.