Détection d’épitopes sensibles à la neutralisation dans les antigènes affichés sur les vaccins à base de particules virales (VLP) à l’aide d’un test de capture

Nous présentons ici un protocole pour détecter les épitopes de neutralisation sur les particules virales (VLP) présentant des antigènes. L’immunoprécipitation des VLP dérivés du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est réalisée à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques aux glycoprotéines d’enveloppe couplés à des billes magnétiques conjuguées à la protéine G. Les VLP capturés sont ensuite soumis à une analyse SDS-PAGE et Western blot utilisant des anticorps spécifiques de la protéine de base virale Gag.

Dans mon laboratoire, nous développons des systèmes de production de vecteurs viraux et de particules virales, ou vaccins à base de VLP. Le test de capture VLP permet la détection très sensible des antigènes cibles affichés sur les VLP. Dans ce test, nous utilisons des anticorps largement neutralisants dirigés contre les épitopes de neutralisation pour prouver l’exposition de ces épitopes à la surface du VLP.

Il s’agit d’une évaluation importante de la qualité pour les candidats vaccins, car seuls les VLP présentant des épitopes sensibles à la neutralisation seront en mesure de provoquer une réponse anticorps neutralisante chez les vaccinés. Commencez par suspendre les billes magnétiques en pipetant de haut en bas ou en mélangeant sur un rotateur à 50 tr / min pendant au moins cinq minutes. Pendant ce temps, préparez la solution d’anticorps contenant les BNAB.

Utilisez 10 microgrammes de chaque bNAB dans 200 microlitres de tampon de liaison et de lavage des anticorps par réaction. Pour chaque réaction, transférer 50 microlitres de la solution de billes magnétiques dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, puis placer les tubes sur le rack de séparation magnétique. Attendez que les perles se rassemblent au niveau de la boule tubulaire pour vous assurer que toutes les perles sont collectées, puis retirez le surnageant.

Retirez l’aimant et suspendez les billes dans 200 microlitres de la solution de bNAB préalablement préparée. Incuber pendant 30 minutes à trois heures tout en mélangeant sur un rotateur à 50 tr/min à température ambiante. Après l’incubation, placez les tubes de réaction dans le rack de séparation magnétique, attendez et retirez le surnageant.

Retirez les tubes de l’aimant et lavez les billes en re-suspendant dans 200 microlitres de liant les anticorps et de tampon de lavage. Répétez le lavage avec un tampon de liaison et de lavage des anticorps, en retirant autant de tampon de lavage que possible une fois terminé. Ajoutez les échantillons aux bNAB liés aux billes.

Si le volume d’échantillon ajouté est inférieur à un millilitre, ajoutez PBS pour ajuster le volume de l’échantillon à un millilitre, puis remettez les billes en les remettant en suspension en pipetant doucement. Incuber les échantillons et les billes pendant 2,5 heures sur un rotateur à température ambiante, en veillant à ce que les billes restent en suspension et que la solution soit bien mélangée pendant l’incubation. Placez les tubes sur l’aimant et retirez le surnageant, puis lavez les billes magnétiques en les suspendant dans 200 microlitres de tampon de lavage.

Suspendez les billes dans 100 microlitres de tampon de lavage et transférez la suspension dans un tube de réaction propre et résistant à la chaleur. Placez le tube sur la grille de séparation magnétique et retirez complètement le surnageant. Pour préparer des échantillons STS-PAGE dénaturés, suspendez les billes dans 20 à 80 microlitres de tampon Laemmli et incubez à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Procédez directement avec SDS-PAGE, en plaçant les tubes sur un rack magnétique pour séparer les perles de la solution. Alternativement, stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Un résultat représentatif des VLP capturés pour la première fois à partir de surnageants de culture cellulaire sans cellules et de pastilles de VLP à l’aide de bNABs, puis soumis à une analyse par transfert Western pour détecter les protéines de base virales, est présenté ici.

Les billes utilisées pour le test de capture ont été recouvertes de trois bNABs différents dirigés contre les épitopes de neutralisation des glycoprotéines de l’enveloppe et des anticorps isotypes servant de témoins négatifs. En utilisant des billes recouvertes d’anticorps isotopiques, aucune protéine Gag n’était détectable dans les échantillons VLP contenant des VLP chauves, c’est-à-dire des VLP env-négatifs ou des VLP env-display, démontrant que la liaison non spécifique des VLP aux perles recouvertes d’anticorps humains n’a pas médié la capture VLP. Les VLP chauves n’étaient pas non plus liés par des perles recouvertes de bNABs et, par conséquent, aucune protéine Gag n’était détectable dans l’analyse par transfert western.

En revanche, les trois BNAB capturés des VLP présentant des protéines Env, par conséquent, les protéines Gag ont été facilement détectées, démontrant la présence d’épitopes de neutralisation dans les glycoprotéines Env affichées sur les VLP. Crucial pour le succès du test: un mélange approfondi de VLP avec des billes recouvertes d’anticorps. Ceci est mieux réalisé en utilisant des volumes supérieurs à 500 microlitres en rotation.

Alternativement, les VLP capturés peuvent être élués dans des conditions non réductrices. Cela permet l’analyse des VLP à l’aide de la microscopie immuno-électronique, ou l’étude des antigènes affichés à l’aide de PAGE natif.