Utilisation d’un analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel pour surveiller la bioénergétique des ostéoblastes

Le test de flux métabolique cellulaire en temps réel mesure le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire, qui correspond à la production mitochondriale et glycolytique d’adénosine triphosphate, à l’aide de capteurs de pH et d’oxygène. Le manuscrit explique une méthode pour comprendre l’état énergétique des ostéoblastes et la caractérisation et l’interprétation de l’état bioénergétique cellulaire.

Cette méthode est utile pour déterminer l’énergie cellulaire, comme le taux de production d’ATP, et aussi pour déterminer la préférence cellulaire envers un métabolite particulier en temps réel. Pour commencer, ajoutez 200 microlitres d’étrier XF et incubez la plaque utilitaire pendant au moins une heure avant le test. Préparer 80 millilitres de milieux de dosage XF à l’aide de XF DMEM supplémenté.

Décongeler l’oligomycine A, la roténone et l’antimycine A sur la glace. Pipettez les composés de haut en bas pour les solubiliser avant utilisation. Ajouter trois millilitres de milieu d’essai préparé à chaque tube, étiquetés A et B.Ajouter 26,4 microlitres d’oligomycine A de 2,5 millimolaires dans le tube A et 3,1 microlitres de roténone de 12,67 millimolaires, 4,1 microlitres d’antimycine A de 9,4 millimolaires et 30 microlitres de tache de Hook dans le tube B.Chargez une concentration de 10x de ces inhibiteurs dans l’orifice d’injection correspondant.

Et enfin, 20 microlitres de ces composés seront chargés dans les cellules dans 200 microlitres de milieux d’essai. Retirez la microplaque de culture cellulaire de l’incubateur à 37 degrés Celsius et observez les cellules au microscope. Retirez le milieu d’essai du bain-marie.

Lavez doucement les cellules avec 200 microlitres de milieu d’essai préchauffé deux fois et ajoutez 200 microlitres de milieu d’essai par puits. Vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer que les cellules restent adhérées aux puits. Assurez-vous que les cellules des puits D5 et E8 sont respectées avec une monocouche cohérente et n’ont pas été emportées pendant l’étape de lavage.

Le logiciel d’imagerie cellulaire utilise ces deux puits pour régler la mise au point automatique et l’exposition automatique. Ouvrez le logiciel de bureau dans l’ordinateur à côté de l’équipement. Vérifiez l’état de la connexion dans le coin inférieur gauche du logiciel du contrôleur.

Accédez à Modèles et sélectionnez le modèle de test de taux D’ATP XF ou le modèle de test approprié. Sélectionnez Définitions de groupe en haut de l’écran et définissez les groupes. sélectionnez la disposition de la carte des plaques et attribuez les puits en fonction des groupes définis.

Vérifiez le protocole de l’instrument. Assurez-vous que les composés ajoutés sont correctement répertoriés et incluez les informations du projet pour les références futures. Cliquez sur Exécuter le test.

Cela vous invitera à sélectionner l’emplacement de stockage du fichier de résultats. Sélectionnez l’emplacement d’enregistrement du fichier de résultats. Enregistrez le fichier avec la date de test et cliquez sur Démarrer l’exécution.

Placez la cartouche du capteur et la plaque utilitaire sur le plateau et cliquez sur Je suis prêt pour lancer l’étalonnage. Ouvrez le logiciel d’imagerie cellulaire sur l’ordinateur. Assurez-vous que l’imageur de microplaques est allumé et que les ports sont connectés à l’ordinateur.

Vérifiez la barre d’état en bas à gauche de l’écran pour vous assurer que la température est réglée sur 37 degrés Celsius et que l’état de la connexion doit être mis en surbrillance en vert comme prêt. Scannez le code-barres de la plaque pour lancer le processus d’imagerie. Donnez un nom à la plaque de cellule et appuyez sur Enregistrer.

Les images en champ clair et fluorescentes seront enregistrées ici. Cliquez sur Effectuer un balayage en fond clair et, dans l’écran suivant, le menu Plaque et Numérisation affiche les options d’imagerie. Avant le test, sélectionnez Démarrer l’analyse en fond clair.

Placez la microplaque de culture cellulaire et le couvercle de la plaque sur le support du plateau et alignez bien A1 avec la marque A1. Cliquez sur Fermer le bac. L’acquisition d’images en champ clair apparaît dans l’écran suivant avec une carte de plaques.

Cliquez sur Scan All Wells et scannez pendant 30 à 35 minutes. Une fois l’étalonnage terminé, le logiciel affiche la boîte de dialogue Plaque de cellule de charge. Ensuite, cliquez sur Ouvrir le plateau pour remplacer le plateau utilitaire par une microplaque de culture cellulaire.

Notez que la plaque de culture cellulaire se trouve dans l’imageur de microplaques. Après l’analyse, retirez la microplaque de culture cellulaire et placez-la dans l’analyseur pour effectuer le test. Ensuite, cliquez sur Load Cell Plate pour lancer le test.

Attendez que le test commence et affichez le temps d’achèvement estimé. Une fois le test terminé, le logiciel affiche la boîte de dialogue Décharger la cartouche de capteur et la plaque de cellule. Cliquez sur Éjecter et retirez la microplaque de culture cellulaire de l’analyseur.

Retirez soigneusement la cartouche du capteur et remplacez le couvercle de la plaque de cellule. La boîte de dialogue Test terminé s’affiche. Ensuite, cliquez sur Afficher les résultats pour ouvrir le fichier de résultats du test ou pour normaliser les données.

Une fois le test terminé, scannez le code-barres de la plaque avec le lecteur de code-barres portable. Si la plaque a déjà été imagée, elle ne nécessitera pas de nouveau nom. Sélectionnez Fluorescence et nombre de cellules.

Placez la plaque de cellule sur le support du plateau et cliquez sur Fermer le plateau. Dans la fenêtre d’acquisition d’image, sélectionnez Numériser tous les puits pour commencer l’imagerie. Examinez les images fluorescentes et le nombre de cellules dans l’application d’imagerie et d’imagerie cellulaire en cliquant au hasard sur quelques puits.

Une fois l’imagerie par fluorescence terminée, exportez les images pour obtenir des références supplémentaires. Une fois l’imagerie et le nombre de cellules terminés, ouvrez le fichier de résultats et cliquez sur Normaliser. Cliquez sur Importer et sélectionnez Appliquer pour le logiciel de bureau pour normaliser automatiquement le test avec le nombre de cellules.

L’injection d’un mélange de stresseur d’oligomycine A et de FCCP a augmenté l’activité initiale du groupe témoin. Les facteurs de stress ont montré un niveau d’énergie significativement élevé dans les groupes de contrôle et de traitement. D’autre part, le traitement deux avait une activité de base comparativement plus faible et les cellules devenaient plus aérobies.

La figure indique que les cellules témoins et expérimentales utilisent la glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale pour la génération d’ATP. Le groupe expérimental présente une réduction de la génération d’ATP via la glycolyse et une augmentation de la respiration mitochondriale. Le taux de respiration basale dans le groupe de traitement est comparativement inférieur à celui du groupe témoin.

Les taux de respiration et de production d’ATP dans les deux groupes sont diminués, ainsi que la fuite de protons suivie d’une injection d’oligomycine A. Les taux de respiration des cellules remontent à leur respiration maximale après l’injection de FCCP. L’injection finale de roténone et d’antimycine A diminue à nouveau l’OCR.

Après la troisième injection, la respiration mitochondriale est arrêtée par la combinaison de roténone et d’antimycine A.Par rapport au groupe témoin, la respiration basale et maximale des groupes de traitement n’a relativement aucun changement. La figure montre que le groupe témoin est fortement dépendant de la voie du glucose, tandis que l’oxydation de la glutamine était efficace dans le groupe témoin. La voie des acides gras montre que le traitement a augmenté la capacité globale des cellules.

La disponibilité de plusieurs ports d’injection sur la plaque acide nous aide à déterminer l’effet de plusieurs médicaments sur l’énergie cellulaire à un seul moment.