Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire
8 décembre 2021
Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.
Ce protocole vise à obtenir des ARN spécifiques de types cellulaires de haute qualité à partir d’un petit nombre de cellules dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Il utilise un modèle murin récemment disponible qui permet aux chercheurs d’isoler un ARN lié à un ribosome en utilisant l’extraction des BPL. La méthode convient également pour isoler les ARN liés aux ribosomes de toutes les cellules exprimant l’EGFP.
Pour commencer, ajoutez deux millilitres de tampon de travail d’homogénéisation à froid glacé à un ensemble de broyeur de tissus en verre. Placez rapidement l’échantillon congelé dans le broyeur et homogénéisez le tissu en 30 coups sur glace à l’aide d’un pilon lâche. transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de deux millilitres et centrifuger à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres sans perturber la pastille, en réservant 100 microlitres comme entrée. Incuber le surnageant avec l’anticorps anti-GFP à quatre degrés Celsius sur un rotateur d’extrémité sur extrémité pendant la nuit. Transférer le mélange d’homogénate et d’anticorps dans un nouveau tube à fond rond de deux millilitres contenant des billes de protéines g lavées et incubé à quatre degrés Celsius sur rotateur à 24 tr / min pendant deux heures.
Séparez les billes magnétiques du surnageant à l’aide d’un rack magnétique. Enregistrer le surnageant comme fraction négative qui contient les ARN dans les cellules EGFP négatives et les ARN dans les cellules EGFP positives qui ne sont pas liées aux ribosomes. Ajouter un millilitre de tampon de lavage à haute teneur en sel aux perles et vortex brièvement le tube pour laver les perles.
Placez ensuite le tube dans un rack magnétique. Retirez le tampon de lavage et répétez les étapes de lavage deux fois de plus pour obtenir le complexe ARN ribosome des billes à partir de cellules EGFP positives. Incuber les billes avec 50 microlitres de tampon d’extraction du kit d’isolement d’ARN dans un ThermoMixer pendant 30 minutes pour libérer les ARN des billes.
Séparez les billes avec un support magnétique et transférez le surnageant dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube à 3000 g pendant deux minutes. Ensuite, pipeter le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.
Pour préconditionner la colonne de purification de l’ARN, pipeter 250 microlitres de tampon de conditionnement sur la colonne de purification et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Puis centrifuger la colonne à 16 000 g pendant une minute. Pipeter un volume égal d’éthanol à 70% dans l’extrait cellulaire et bien mélanger par pipetage.
Pipeter jusqu’à 200 microlitres du mélange dans la colonne de purification d’ARN préconditionnée. Pour réduire la perte d’échantillons ne remplissez pas la colonne à plus de 80% de sa capacité. Répétez cette étape plusieurs fois jusqu’à ce que tous les ARN soient collectés dans la même colonne de chaque fraction.
Centrifuger la colonne pendant deux minutes pour lier l’ARN à la membrane de la colonne. Continuez ensuite la centrifugation pendant 30 secondes. Jetez le flux et pipeter 100 microlitres de tampon de lavage dans la colonne.
Centrifuger pendant une minute, puis éliminer le flux. Pipette 75 microlitres de solution d’ADN se mélangent directement dans la membrane de la colonne de purification. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
Ensuite, pipeter 40 microlitres de lavage tamponner un dans la colonne et centrifuger pendant 30 secondes supplémentaires. Ignorez le flux. Introduire à la pipette 100 microlitres de tampon de lavage deux dans la colonne et centrifuger à 8 000 g pendant une minute.
Ignorez le flux. Acheter PET 100 microlitres de tampon de lavage deux dans la colonne et centrifuger à 16 000 g pendant deux minutes. Éliminer l’écoulement et recentrifuger la même colonne à 16 000 g pendant une minute pour éliminer toute trace de tampon de lavage.
Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. pipette 12 microlitres d’eau libre de RNase directement sur la membrane de la colonne de purification en veillant à ce que l’embout de la pipette ne touche pas la membrane. Incuber à température ambiante pendant une minute et centrifuger à 1000 g pendant une minute.
Puis à 16 000 G pendant une minute pour éluer l’ARN. Utilisez un bioanalyseur pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARN extrait. Conservez les ARN dans un congélateur à 80 degrés ou envoyez-les pour une analyse plus approfondie.
Les souris porteuses des deux allèles génétiques génétiquement modifiés, Gli1-CreERT2 et NuTRAP, on nous injecte du tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours pour trois injections. L’analyse par immunofluorescence des tissus prélevés montre que l’EGFP a été exprimé dans les cellules interstitielles des testicules. L’EGFP a également été trouvé dans les cellules capsulaires surrénales chez les souris Gli1-CreERT2, NuTRAP.
Chez Sonic Hedgehog-CreERT2, souris NuTRAP La population cellulaire positive EGFP réside dans le cortex externe de la glande surrénale sous la capsule, confirmant l’expression des cellules pré-exprimant l’EGFP. Après l’extraction des ARN spécifiques du type cellulaire, l’ARN extrait a été envoyé pour analyse de microréseau. Les résultats ont montré qu’environ 3000 gènes ont été enrichis dans la fraction positive, par rapport aux gènes dans la fraction négative, tandis qu’environ 4 000 gènes ont été enrichis dans la fraction négative.
Parmi les gènes différentiels exprimés, les gènes associés aux cellules de Leydig Hsd11b1 et Hsd3b6 ont été enrichis dans la fraction positive. Dans la fraction négative, les gènes associés à la cellule Sertoli Desert Hedgehog et Gstm6 ont été enrichis. Seuls quelques gènes exprimés différentiellement ont été identifiés en comparant la fraction négative avec l’entrée.
La RT-PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour confirmer l’expression de gènes clés dans les fractions positive et négative. Semblable à ce qui a été trouvé dans le test de microréseau, les enzymes stéroïdogènes 3-bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase et l’enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol ont été enrichies dans la fraction positive. Pendant ce temps, le marqueur cellulaire Sertoli SRY box facteur de transcription neuf et le marqueur de cellules germinales synaptonemal complexe protéine trois ont été enrichis dans la fraction négative.
Lors de la tentative de ce protocole, il est important de préparer un nouveau tampon de travail d’homogénéisation Ajouter le DTT, la ribonucléase recombinante cycloheximide et le cocktail inhibiteur de protéinase à la solution mère d’homogénéisation uniquement avant utilisation. Il est également important de préparer des tampons frais à faible teneur en sel et à haute teneur en sel avant utilisation.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode permettant d'isoler des ARNm ribosomaux spécifiques à un type cellulaire à l'aide du modèle murin NuTRAP, ce qui permet d'extraire des ARN de haute qualité à partir de petites populations cellulaires sans nécessiter de tri cellulaire. La méthode est particulièrement utile pour l'étude des cellules exprimant EGFP et l'identification de gènes différentiellement exprimés associés à des types cellulaires spécifiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
Contexte
- Le modèle murin NuTRAP permet l'isolement des ARN liés aux ribosomes.
- Cette approche évite les complications liées au tri cellulaire dans les tissus hétérogènes.
Méthodes utilisées
- Prélèvement GLP pour l'isolement d'ARN lié aux ribosomes
- Modèle murin NuTRAP
- Analyse par puces à ADN et RT-PCR pour la validation de l'expression génique
Résultats principaux
- Environ 3000 gènes ont été enrichis dans la fraction d'ARN positive, tandis que 4000 gènes ont été enrichis dans la fraction négative.
- Des gènes spécifiques liés aux cellules de Leydig et aux cellules de Sertoli ont été identifiés dans les fractions d'ARN respectives.
- L'enrichissement des gènes codant pour des enzymes clés était conforme aux résultats de la puce à ADN.
Conclusions
- L'étude démontre une méthode fiable pour isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire.
- Les résultats contribuent à la compréhension de l'expression génique dans des types cellulaires testiculaires distincts.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'isolement d'ARN spécifiques à un type cellulaire à partir de tissus hétérogènes sans tri cellulaire répond à un défi clé dans la validation ciblée et la réduction des risques mécanistiques. La méthode NuTRAP fondée sur TRAP permet un profilage transcriptomique reproductible et quantitatif de populations cellulaires définies, renforçant ainsi la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte. Cette approche réduit le bruit biologique et améliore la continuité translationnelle entre la découverte et la validation préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans des types cellulaires spécifiques au sein de tissus complexes.
- Valeur opérationnelle : Évite les artefacts liés au tri cellulaire, en préservant les états natifs de l'ARN pour une validation fiable des cibles.
- Valeur prédictive : Facilite la découverte de biomarqueurs et la clarification des voies dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des entrées d'ARN normalisées liées aux ribosomes pour le développement d'analyses en aval.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs, adaptés à une préparation pour le criblage à haut débit.
- Extensibilité : Compatible avec une quantité limitée de matériel initial, permettant une réutilisation sur plusieurs modèles exprimant EGFP.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la pertinence pathologique en capturant les transcriptomes spécifiques à chaque type cellulaire à partir de tissus dans leur contexte natif.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique grâce à une logique cohérente d'isolement de l'ARN.
- Atténuation des risques : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les résultats liés à l'engagement de la cible et aux criblages phénotypiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible à l'optimisation du composé de départ, notamment lorsque la résolution au niveau du type cellulaire est essentielle pour obtenir des informations mécanistiques. Elle permet la vérification d'hypothèses et la réduction des risques biologiques avant les campagnes de criblage de composés.
- Biologie de la découverte : Permet des tests d'hypothèses précis dans des tissus hétérogènes en isolant les ARN en cours de traduction à partir de populations cellulaires définies.
- Écrantage : Produit des pools normalisés d'ARN associés aux ribosomes, adaptés à la validation de tests et à l'évaluation de la reproductibilité.
- Analytique : Fournit des données quantitatives d'expression génique (par exemple, puces à ADN, RT-PCR) permettant la comparaison entre différentes conditions et la priorisation de cibles.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte précoce aux travaux précliniques en préservant les signaux spécifiques aux types cellulaires dans des organes complexes comme les testicules et la glande surrénale.
- Réutilisation en milieu professionnel : Adaptable à plusieurs lignées exprimant Cre et NuTRAP, ce qui en fait une plateforme évolutible pour les analyses omiques spécifiques aux types cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant les signaux perturbateurs provenant de tissus hétérogènes.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires grâce à des étapes normalisées de lyse, d'immunoprécipitation et de récupération d'ARN.
- Valeur stratégique : Permet de mieux décider de poursuivre ou non un projet en fournissant des données transcriptomiques plus propres et plus interprétables pour le tri du portefeuille.
- Impact sur le portefeuille : Permet une avancée ajustée au risque en isolant les signaux véritables spécifiques aux types cellulaires, réduisant ainsi les fausses pistes lors de la validation en aval.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus, l'immunoprécipitation et les techniques de conservation de l'ARN.
- Dépend de l'accès à des supports magnétiques, des ThermoMixers, des centrifugeuses et des colonnes de purification de l'ARN.
- Exige la préparation standardisée de tampons (homogénéisation, lavage, élution) fraîchement préparés avant utilisation afin de prévenir l'activité des RNases.
- Les considérations d'adaptation incluent la validation des niveaux d'expression d'EGFP et de l'efficacité de liaison des ribosomes dans de nouveaux modèles activateurs de Cre.
- Les limitations pratiques comprennent les contraintes relatives à la quantité de tissu en entrée ainsi que la nécessité d'optimiser les concentrations d'anticorps et de billes.
