Name: Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Apprenez à isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire en utilisant le modèle souris NuTRAP et la technique de pull-down GLP.

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Ce travail a été partiellement soutenu par NIH R00HD082686. Nous remercions la bourse de recherche d’été de l’Endocrine Society à H.S.Z. Nous remercions également le Dr Yuan Kang pour la reproduction et le maintien de la colonie de souris.

Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont suivi les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’Auburn.
REMARQUE: Le protocole suivant utilise un testicule (environ 100 mg) à P28 de Gli1-CreERT2; Souris NuTRAP (Mus musculus). Les volumes de réactifs peuvent devoir être ajustés en fonction des types d’échantillons et du nombre de tissus.
1. Prélèvement de tissus
<ol><li>Euthanasier les souris à l’aide d’une chambre CO2 , désinfecter la surface de l’abdomen avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Ouvrez le bas-ventre avec des ciseaux et retirez les testicules. Utilisez de l’azote liquide (LN2) pour congeler immédiatement les testicules.</li>
	<li>Conserver les échantillons dans la phase vapeur de LN2 jusqu’à utilisation.</li>
</ol>2. Préparation des réactifs et des billes
<ol><li>Préparer la solution mère d’homogénéisation : Ajouter 50 mM de Tris (pH 7,4), 12 mM de MgCl2, 100 mM de KCl, 1 % de NP-40 et 1 mg/mL d’héparine. Conserver la solution à 4 °C jusqu’à utilisation (jusqu’à 1 mois).</li>
	<li>Préparer le tampon de travail d’homogénéisation à partir de la solution mère (étape 2.1) fraîchement avant utilisation : Ajouter le DTT (concentration finale : 1 mM), le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL), la ribonucléase recombinante (concentration finale : 200 unités/mL) et le cocktail inhibiteur de protéase (concentration finale : 1x) à la solution mère d’homogénéisation pour obtenir la quantité requise du tampon de travail d’homogénéisation. Conserver le tampon de travail fraîchement préparé sur de la glace jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Préparez les tampons de lavage à faible teneur en sel et à haute teneur en sel :<ol><li>Pour préparer un mélange tampon de lavage à faible teneur en sel, 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl et 1% NP-40. Ajouter le DTT (concentration finale : 1 mM) et le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL) avant utilisation.</li>
		<li>Pour préparer un mélange tampon de lavage à haute teneur en sel 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Ajouter le DTT (concentration finale : 2 mM) et le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL) avant utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer des billes de protéines G (tableau des matières) :<ol><li>Chaque échantillon nécessitera 50 μL de billes de protéine G. Placez la quantité requise de billes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et séparez les billes de la solution à l’aide d’une grille magnétique en laissant le tube sur le rack pendant 30 à 60 s.</li>
		<li>Retirer le surnageant par pipetage. Lavez les billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage glacé à faible teneur en sel à chaque fois.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lyse tissulaire et homogénéisation
<ol><li>Ajouter 2 mL de tampon de travail d’homogénéisation à froid glacé (fraîchement préparé à partir de l’étape 2.2) dans un ensemble de broyeur de tissu en verre. Placez rapidement l’échantillon congelé dans le broyeur et homogénéisez le tissu en 30 coups sur glace à l’aide d’un pilon lâche.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de 2 ml et centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL. Économisez 100 μL dans un tube de 1,5 mL comme « entrée ».</li>
	<li>Incuber le surnageant dans le tube de 2 mL avec l’anticorps anti-GFP (5 μg/mL; 1:400) à 4 °C sur un rotateur bout à bout (24 rpm) pendant une nuit.</li>
</ol>4. Immunoprécipitation
<ol><li>Transférer le mélange homogénat/anticorps dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL contenant les billes de protéines G lavées de l’étape 2.4. Incuber à 4 °C sur un rotateur bout à bout (24 tr/min) pendant 2 h.</li>
	<li>Séparez les billes magnétiques du surnageant à l’aide d’un support magnétique. Enregistrer le surnageant comme « fraction négative ». La fraction négative contient (1) des ARN dans les cellules EGFP-négatives et (2) des ARN dans les cellules EGFP-positives qui ne sont pas liés aux ribosomes.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de tampon de lavage à haute teneur en sel aux billes et vortex brièvement le tube pour laver les perles. Placez le tube dans un support magnétique.</li>
	<li>Retirez le tampon de lavage. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Les billes contiennent maintenant le complexe billes-ribosome-ARN des cellules EGFP-positives.</li>
</ol>5. Extraction de l’ARN
NOTE: Les étapes suivantes sont adaptées du kit d’isolement ARN (Table of Materials). Traiter chaque fraction (c.-à-d. entrée, positive et négative) comme un échantillon indépendant et isoler les ARN indépendamment.
<ol><li>Incuber les billes de l’étape 4.4 avec 50 μL de tampon d’extraction (du kit d’isolement d’ARN) dans un thermomélangeur (42 °C, 500 rpm) pendant 30 min pour libérer les ARN des billes.</li>
	<li>Séparez les billes avec un support magnétique, transférez le surnageant qui contient le complexe perles-ribosome-ARN dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 3000 x g pendant 2 min, puis pipeter le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ce tube contient la « fraction positive » de l’étape TRAP. NOTE: Pour les fractions d’entrée et négatives, extraire l’ARN de 25 μL d’échantillons en utilisant 1 mL de tampon d’extraction. Incuber dans un thermomélangeur (42 °C, 500 tr/min) pendant 30 min.</li>
	<li>Préconditionner la colonne de purification de l’ARN : Pipeter 250 μL de tampon de conditionnement sur la colonne de purification. Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Centrifuger la colonne à 16 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Piper un volume égal de 70% d’EtOH dans le surnageant à partir de l’étape 5.3 (environ 50 μL d’EtOH à 70% pour la fraction positive et 1 mL d’EtOH à 70% pour les fractions entrantes et négatives). Bien mélanger en pipetant de haut en bas.</li>
	<li>Introduire à la pipette le mélange dans la colonne à partir de l’étape 5.4.</li>
	<li>Centrifuger la colonne à 100 x g pendant 2 min pour permettre à l’ARN de se lier à la membrane dans la colonne, puis continuer la centrifugeuse à 16 000 x g pendant 30 s immédiatement. Jetez le flux continu. NOTE: Pour les fractions d’entrée et négatives, ajouter 250 μL du mélange à la colonne à chaque fois. Répétez les étapes 5.6 et 5.7 jusqu’à ce que tous les mélanges soient utilisés.</li>
	<li>Introduire à la pipette 100 μL de tampon de lavage 1 (W1) dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.</li>
	<li>Pipeter 75 μL de solution de DNase mélanger directement dans la membrane de la colonne de purification. Incuber à TA pendant 15 min.</li>
	<li>Pipeter 40 μL de W1 dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.</li>
	<li>Introduire à la pipette 100 μL de tampon de lavage 2 (W2) dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.</li>
	<li>Pipeter 100 μL de W2 dans la colonne et centrifuger à 16 000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu. Recentrifuger la même colonne à 16 000 x g pendant 1 min pour éliminer toute trace de tampon de lavage avant l’étape d’élution.</li>
	<li>Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Pipeter 12 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne de purification. L’embout de la pipette ne doit pas toucher la membrane. Incuber à TA pendant 1 min et centrifuger à 1000 x g pendant 1 min. Poursuivre ensuite la centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN.</li>
</ol>6. Concentration et qualité de l’ARN
<ol><li>Utiliser un bioanalyseur pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARN10 extrait.</li>
</ol>7. Stockage et analyse plus approfondie
<ol><li>Conservez l’ARN à -80 °C (jusqu’à 1 an) jusqu’à une analyse plus approfondie (p. ex. microréseau, PCR quantitative (qPCR), RNA-seq, etc.). REMARQUE : Pour plus de détails sur l’analyse qPCR, y compris la synthèse de l’ADNc, se reporter à Lyu et coll.11. Les amorces pour la qPCR sont énumérées dans le tableau des matériaux.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
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<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’utilité de l’analyse du transcriptome des tissus entiers pourrait être atténuée, en particulier lors de l’étude de tissus hétérogènes complexes. Comment obtenir des ARN spécifiques au type cellulaire devient un besoin urgent de libérer la puissante technique de séquençage de l’ARN. L’isolement d’ARN spécifiques à un type cellulaire repose généralement sur la collecte d’un type spécifique de cellules à l’aide de la micromanipulation, du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou de la microdissection par capture l...

Les approches à haut débit, y compris le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et les microarrays, ont permis d’interroger les profils d’expression génique à l’échelle du génome. Pour les tissus complexes tels que le cœur, le cerveau et les testicules, les données spécifiques au type cellulaire fourniront plus de détails comparant l’utilisation des ARN du tissu entier 1,2,3. Pour surmonter l’impact de l’hétérogénéité cellulaire, la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purifie) est développée depuis le début des années 20104. TRAP est capable d’isoler les ARN liés aux ribosomes de types cellulaires spécifiques sans dissociation tissulaire. Cette méthode a été utilisée pour l’analyse des translatomes (ARNm qui sont recrutés sur le ribosome pour la traduction) dans différents organismes, y compris le ciblage d’une population extrêmement rare de cellules musculaires chez les embryons de drosophile5, l’étude de différentes cellules racinaires dans la plante modèle Arabidopsis thaliana6 et l’analyse du transcriptome des cellules endothéliales chez les mammifères7.
TRAP nécessite une modification génétique pour marquer le ribosome d’un organisme modèle. Evan Rosen et ses collègues ont récemment développé un modèle murin appelé Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, disponible auprès du Jackson Laboratory depuis 2017. En croisant avec une lignée de souris Cre, les chercheurs peuvent utiliser ce modèle murin NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes et les noyaux cellulaires des cellules exprimant Cre sans tri cellulaire. Dans les cellules exprimant Cre qui portent également l’allèle NuTRAP , le ribosome marqué EGFP/L10a permet l’isolement des ARNm transposés à l’aide de tests d’affinité. Dans la même cellule, la membrane nucléaire marquée au peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP), qui est également positive à la cerise, permet l’isolement nucléaire en utilisant une purification basée sur l’affinité ou la fluorescence. La même équipe de recherche a également généré une lignée de souris similaire dans laquelle la membrane nucléaire est marquée uniquement avec mCherry sans biotine8. Ces deux lignées de souris génétiquement modifiées donnent accès à la caractérisation des profils épigénomiques et transcriptomiques appariés de types spécifiques de cellules d’intérêt.
La voie de signalisation du hérisson (Hh) joue un rôle essentiel dans le développement des tissus9. GLI1, un membre de la famille GLI, agit comme un activateur transcriptionnel et médie la signalisation Hh. Les cellules Gli1+ peuvent être trouvées dans de nombreux organes sécrétant des hormones, y compris la glande surrénale et le testicule. Pour isoler les ADN et les ARN spécifiques du type cellulaire des cellules Gli1+ à l’aide du modèle murin NuTRAP, des souris Gli1-CreERT2 ont été croisées avec les souris NuTRAP . Des souris Shh-CreERT2 ont également été croisées avec les souris NuTRAP visant à isoler les cellules exprimant sonic hedgehog (Shh). Le protocole suivant montre comment utiliser Gli1-CreERT2; Des souris NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir de cellules Gli1+ dans des testicules de souris adultes.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>amorces qPCR</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (amorce directe/amorce inverse)</td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>amorces qPCR</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (amorce directe/amorce inverse)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 aimant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Kit de broyeur de verre</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>héparine</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR amorces</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (amorce directe/amorce inverse)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Souris Clariom S Assay microarrays</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray service</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Kit</td><td></td> d’isolement de l’ARN Invitrogen 18418020 <td></td></tr><tr><td>PicoPure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Cellules de croissance d’eau sans RNase</td><td></td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inhibiteur de la ribonucléase recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9amorces</td> <td>qPCR</td> <td>eurofins</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (amorce directe/amorce inverse</td></tr><tr><td>Superscript IV transcriptase inverse</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>amorces qPCR</td><td>GAATGTGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGTGA (amorce avant/amorce inversée)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

isoler des arn spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

L’hétérogénéité cellulaire pose des défis pour comprendre la fonction des tissus complexes au niveau du transcriptome. L’utilisation d’ARN spécifiques au type cellulaire évite les pièges potentiels causés par l’hétérogénéité des tissus et libère la puissante analyse du transcriptome. Le protocole décrit ici montre comment utiliser la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purity) pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir d’une petite quantité de cellules exprimant l’EGFP dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Ce protocole convient à l’isolement d’ARN spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP récemment disponible et pourrait également être utilisé pour isoler les ARN de toutes les cellules exprimant l’EGFP.

Les souris Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) ont d’abord été croisées avec la souris rapporteure NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) pour générer des souris double-mutantes. Des souris portant les deux allèles génétiques génétiquement modifiés (c.-à-d. Gli1-CreERT2 et NuTRAP) ont reçu une injection de tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours, pour trois injections. Des échantillons de tissus ont été prélevés le 7ème jour après le 1er...

Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Ce protocole vise à obtenir des ARN spécifiques de types cellulaires de haute qualité à partir d’un petit nombre de cellules dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Il utilise un modèle murin récemment disponible qui permet aux chercheurs d’isoler un ARN lié à un ribosome en utilisant l’extraction des BPL. La méthode convient également pour isoler les ARN liés aux ribosomes de toutes les cellules exprimant l’EGFP.Pour commencer, ajoutez deux millilitres de tampon de travail d’homogénéisation à froid glacé à un ensemble de broyeur de tissus en verre. Placez rapidement l’échantillon congelé dans le broyeur et homogénéisez le tissu en 30 coups sur glace à l’aide d’un pilon lâche. transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de deux millilitres et centrifuger à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres sans perturber la pastille, en réservant 100 microlitres comme entrée. Incuber le surnageant avec l’anticorps anti-GFP à quatre degrés Celsius sur un rotateur d’extrémité sur extrémité pendant la nuit. Transférer le mélange d’homogénate et d’anticorps dans un nouveau tube à fond rond de deux millilitres contenant des billes de protéines g lavées et incubé à quatre degrés Celsius sur rotateur à 24 tr / min pendant deux heures.Séparez les billes magnétiques du surnageant à l’aide d’un rack magnétique. Enregistrer le surnageant comme fraction négative qui contient les ARN dans les cellules EGFP négatives et les ARN dans les cellules EGFP positives qui ne sont pas liées aux ribosomes. Ajouter un millilitre de tampon de lavage à haute teneur en sel aux perles et vortex brièvement le tube pour laver les perles.Placez ensuite le tube dans un rack magnétique. Retirez le tampon de lavage et répétez les étapes de lavage deux fois de plus pour obtenir le complexe ARN ribosome des billes à partir de cellules EGFP positives. Incuber les billes avec 50 microlitres de tampon d’extraction du kit d’isolement d’ARN dans un ThermoMixer pendant 30 minutes pour libérer les ARN des billes.Séparez les billes avec un support magnétique et transférez le surnageant dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube à 3000 g pendant deux minutes. Ensuite, pipeter le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.Pour préconditionner la colonne de purification de l’ARN, pipeter 250 microlitres de tampon de conditionnement sur la colonne de purification et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Puis centrifuger la colonne à 16 000 g pendant une minute. Pipeter un volume égal d’éthanol à 70% dans l’extrait cellulaire et bien mélanger par pipetage.Pipeter jusqu’à 200 microlitres du mélange dans la colonne de purification d’ARN préconditionnée. Pour réduire la perte d’échantillons ne remplissez pas la colonne à plus de 80% de sa capacité. Répétez cette étape plusieurs fois jusqu’à ce que tous les ARN soient collectés dans la même colonne de chaque fraction.Centrifuger la colonne pendant deux minutes pour lier l’ARN à la membrane de la colonne. Continuez ensuite la centrifugation pendant 30 secondes. Jetez le flux et pipeter 100 microlitres de tampon de lavage dans la colonne.Centrifuger pendant une minute, puis éliminer le flux. Pipette 75 microlitres de solution d’ADN se mélangent directement dans la membrane de la colonne de purification. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.Ensuite, pipeter 40 microlitres de lavage tamponner un dans la colonne et centrifuger pendant 30 secondes supplémentaires. Ignorez le flux. Introduire à la pipette 100 microlitres de tampon de lavage deux dans la colonne et centrifuger à 8 000 g pendant une minute.Ignorez le flux. Acheter PET 100 microlitres de tampon de lavage deux dans la colonne et centrifuger à 16 000 g pendant deux minutes. Éliminer l’écoulement et recentrifuger la même colonne à 16 000 g pendant une minute pour éliminer toute trace de tampon de lavage.Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. pipette 12 microlitres d’eau libre de RNase directement sur la membrane de la colonne de purification en veillant à ce que l’embout de la pipette ne touche pas la membrane. Incuber à température ambiante pendant une minute et centrifuger à 1000 g pendant une minute.Puis à 16 000 G pendant une minute pour éluer l’ARN. Utilisez un bioanalyseur pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARN extrait. Conservez les ARN dans un congélateur à 80 degrés ou envoyez-les pour une analyse plus approfondie.Les souris porteuses des deux allèles génétiques génétiquement modifiés, Gli1-CreERT2 et NuTRAP, on nous injecte du tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours pour trois injections. L’analyse par immunofluorescence des tissus prélevés montre que l’EGFP a été exprimé dans les cellules interstitielles des testicules. L’EGFP a également été trouvé dans les cellules capsulaires surrénales chez les souris Gli1-CreERT2, NuTRAP.Chez Sonic Hedgehog-CreERT2, souris NuTRAP La population cellulaire positive EGFP réside dans le cortex externe de la glande surrénale sous la capsule, confirmant l’expression des cellules pré-exprimant l’EGFP. Après l’extraction des ARN spécifiques du type cellulaire, l’ARN extrait a été envoyé pour analyse de microréseau. Les résultats ont montré qu’environ 3000 gènes ont été enrichis dans la fraction positive, par rapport aux gènes dans la fraction négative, tandis qu’environ 4 000 gènes ont été enrichis dans la fraction négative.Parmi les gènes différentiels exprimés, les gènes associés aux cellules de Leydig Hsd11b1 et Hsd3b6 ont été enrichis dans la fraction positive. Dans la fraction négative, les gènes associés à la cellule Sertoli Desert Hedgehog et Gstm6 ont été enrichis. Seuls quelques gènes exprimés différentiellement ont été identifiés en comparant la fraction négative avec l’entrée.La RT-PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour confirmer l’expression de gènes clés dans les fractions positive et négative. Semblable à ce qui a été trouvé dans le test de microréseau, les enzymes stéroïdogènes 3-bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase et l’enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol ont été enrichies dans la fraction positive. Pendant ce temps, le marqueur cellulaire Sertoli SRY box facteur de transcription neuf et le marqueur de cellules germinales synaptonemal complexe protéine trois ont été enrichis dans la fraction négative.Lors de la tentative de ce protocole, il est important de préparer un nouveau tampon de travail d’homogénéisation Ajouter le DTT, la ribonucléase recombinante cycloheximide et le cocktail inhibiteur de protéinase à la solution mère d’homogénéisation uniquement avant utilisation. Il est également important de préparer des tampons frais à faible teneur en sel et à haute teneur en sel avant utilisation.

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Apprenez à isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire en utilisant le modèle souris NuTRAP et la technique de pull-down GLP.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

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