Drosophila melanogaster Protocole d’injection de larves
19 octobre 2021
Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.
Ce protocole aborde les difficultés et les défis liés à la microinjection de larves en décrivant une méthode précise qui permettra l’utilisation de la larve de Drosophila melanogaster comme modèle pour diverses études immunitaires et moléculaires. Il s’agit d’une technique d’injection simple qui présente une méthode efficace, rentable et rapide pour administrer à plusieurs reprises une variété de substances de manière uniforme, ce qui permet d’obtenir des résultats cohérents et fiables. Commencez par sélectionner les larves du stade du troisième stade et lavez-les avec la solution de Ringer dans une petite boîte de Pétri.
Placez un papier filtre dans une boîte de Petri et humidifiez-le avec 5 ml de solution de Ringer. Placez ensuite les larves sur le papier filtre. Préparer les capillaires à l’aide de tubes capillaires en verre de 3,5 po dans un extracteur de micropipette.
Ouvrez le capillaire en verre à l’aide de pinces à point moyen dentelées droites. Remplissez le capillaire ouvert avec de l’huile minérale à l’aide d’une seringue jetable en plastique. Ensuite, éjectez l’huile du tube capillaire avec un injecteur de nanolitres.
Remplissez le capillaire avec la préparation bactérienne souhaitée pour injection. Transférer les larves anesthésiées dans un papier filtre humidifié avec la solution de Ringer. À l’aide de pinces, appliquez une pression ferme sur la face dorsale de l’extrémité postérieure des larves, où les spiracles trachéaux sont apparents.
Ensuite, insérez l’aiguille horizontalement, vers l’extrémité postérieure des larves, et injectez les stocks bactériens. Retirez les pinces pour éviter le déversement d’hémolymphe ou d’intestin. Ensuite, retirez l’aiguille préalablement insérée dans les larves.
Infecter 20 larves pour chaque condition expérimentale. À l’aide d’un pinceau, transférez doucement les larves injectées dans un papier filtre humide séparé. Ajoutez la solution de Ringer si nécessaire pour éviter la dessiccation.
Incuber la boîte de Petri dans un incubateur à 25 larves de C.Drosophila melanogaster infectées par Photorhabdus asymbiotica a montré un taux de survie de 57% pendant 24 heures après l’injection, tandis que la larve injectée avec Escherichia coli a montré un taux de survie de 85% au même moment. L’importance de cette méthode est que l’aiguille est maintenue approximativement parallèlement à la larve. La pression appliquée pour retenir la larve est très faible, ce qui réduit la possibilité de fuite d’hémolymphe, de blessure mortelle ou d’administration inadéquate de la substance souhaitée.
Cette technique peut être perfectionnée avec la pratique.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole décrit une technique d'injection de larves chez Drosophila melanogaster, conçue pour faciliter l'utilisation des larves dans les études immunologiques et moléculaires. La méthode permet de surmonter les difficultés liées à la microinjection des larves et offre une approche fiable pour l'administration de substances.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Microbiologie
- Immunologie
Contexte
- Drosophila melanogaster est un organisme modèle largement utilisé.
- La compréhension des réponses immunitaires innées antimicrobiennes est cruciale.
- Les stades larvaires offrent des aperçus supplémentaires sur les stratégies d'infection microbienne.
- Les techniques de microinjection sont essentielles pour assurer la reproductibilité expérimentale.
Objectif de l'étude
- Utiliser les larves de D. melanogaster comme système modèle.
- Fournir une méthode détaillée pour l'injection microscopique chez les larves.
- Améliorer la fiabilité des études immunologiques et moléculaires.
Méthodes utilisées
- Sélectionner des larves de troisième stade pour l'injection.
- Laver les larves avec une solution de Ringer.
- Préparer des capillaires à l'aide de tubes capillaires en verre.
- Injecter les substances de manière uniforme dans les larves.
Résultats principaux
- La technique permet une administration efficace des substances.
- Les résultats sont cohérents et fiables d'une expérience à l'autre.
- Méthode rentable, adaptée à diverses études.
- Permet l'exploration des réponses immunitaires chez les larves.
Conclusions
- La technique d'injection chez les larves est un outil précieux pour les chercheurs.
- Elle accroît l'utilité de D. melanogaster dans les études scientifiques.
- Les recherches futures pourront exploiter cette méthode afin d'obtenir des connaissances plus approfondies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les larves de Drosophila melanogaster offrent un modèle génétiquement accessible et économique pour l'étude de l'immunité innée et des interactions hôte-pathogène, permettant une validation précoce des cibles avec une charge éthique et financière réduite. Le protocole d'injection larvaire améliore la reproductibilité des tests de réponse immunitaire, soutenant la détection mécanistique des candidats antimicrobiens et immunomodulateurs. Cette approche fait le lien entre la biologie de la découverte et l'évaluation préclinique en fournissant des résultats quantifiables sur la survie et l'infection dans un système pertinent pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques liées aux voies immunitaires innées et aux mécanismes de virulence.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système évolutif pour la validation fonctionnelle de cibles à l'aide de modèles de défi microbien.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en générant des données quantitatives sur l'infection et la survie pour l'évaluation des composés leaders.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Fournit des protocoles standardisés de préparation des larves et d'injection pour une exposition cohérente aux substances.
- Données quantitatives : Permet la mesure des taux de survie et de la charge pathogène comme variables dépendantes dans les campagnes de criblage.
- Reproductibilité : Réduit la variabilité technique grâce à un contrôle des mécanismes d'injection et des conditions environnementales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise les réponses immunitaires innées pertinentes pour l'humain face à des pathogènes bactériens tels que Photorhabdus asymbiotica et Escherichia coli.
- Continuité translationnelle : Permet de passer de la validation du ciblage à l'évaluation de l'efficacité préclinique dans un contexte d'organisme entier.
- Réduction des risques mécanistiques : Clarifie les voies de défense de l'hôte et les contributions des facteurs de virulence avant les études chez les mammifères.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode d'injection chez les larves s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, soutenant la validation ciblée guidée par des hypothèses et permettant des formats de tests reproductibles pour le criblage de composés avant l'optimisation du candidat médicament.
- Biologie du vivant : Soutient la validation fonctionnelle de cibles liées au système immunitaire par des défis contrôlés avec des agents pathogènes chez les larves.
- Criblage : Génère des données de réponse-dose et de survie adaptées au criblage à haut contenu d'agents immunomodulateurs ou antimicrobiens.
- Analyse : Fournit des mesures quantitatives de survie (par exemple, taux de survie à 24 heures) permettant la comparaison entre différentes conditions expérimentales et traitements.
- Recherche translationnelle : Met en place un système pertinent sur le plan pathologique pour évaluer l'impact thérapeutique sur les issues d'infection avant la progression vers des modèles chez le rongeur.
- Réutilisation en milieu professionnel : Représente une plateforme standardisée et peu coûteuse, applicable à plusieurs projets en recherche en immunologie et en maladies infectieuses.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des interactions hôte-pathogène.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires grâce à des paramètres d'injection définis et à un contrôle environnemental rigoureux.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité des décisions d'aller/arrêt en fournissant précocement des signaux d'efficacité et de toxicité dans un modèle animal entier.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des candidats ajustée au risque, fondée sur des données de survie et d'élimination de l'infection.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des larves, l'anesthésie et les techniques de micro-injection.
- Dépend de l'accès à des tireuses de micropipettes, des injecteurs nanolitre et des outils de préparation de capillaires en verre.
- Exige la préparation d'une solution de Ringer normalisée et une incubation environnementale à 25 °C pour des résultats reproductibles.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors du test de différentes souches microbiennes ou de la viscosité des substances.
- Est limitée par la taille des larves et les contraintes de volume d'injection, ce qui peut restreindre l'administration de grosses molécules ou de particules.
