Name: Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Découvrez une méthode UPLC-MS/MS semi-ciblée pour détecter les métabolites phénoliques dans le plasma. Cette approche chromatographique permet d'évaluer l'absorption des composés phénoliques après intervention nutritionnelle chez les personnes âgées.

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Les auteurs sont reconnaissants du soutien financier de CONACYT, Mexique (CB- 2016-01-286449), et UACJ-PIVA (Projets 313-17-16 et 335-18-13). L’OAMB tient à remercier CONACYT pour sa bourse de doctorat. Le soutien technique du bureau de production multimédia de l’UACJ est reconnu avec gratitude.

Les échantillons de plasma utilisés dans ce protocole ont été prélevés dans une étude précédente suivant toutes les directives éthiques et approuvés par le Comité institutionnel d’éthique et de bioéthique (CIEB-2018-1-37) de l’Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Le protocole complet pour l’extraction et l’identification des composés phénoliques et des métabolites dans le plasma par UPLC-MS/MS est représenté à la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de l’extraction et de l’identification des composés phénoliques et des métabolites dans le plasma par la méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Conserver les échantillons de plasma à -80 °C jusqu’à l’analyse.</li>
	<li>Décongeler les échantillons de plasma à température ambiante pendant 15 min. REMARQUE: Les échantillons peuvent être placés dans un bain-marie à 37 ° C pour accélérer le processus (5 min).</li>
	<li>Placer 200 μL d’échantillon de plasma dans un microtube de 2 mL et mélanger avec 1 000 μL d’éthanol pur. Vortex de l’échantillon de plasma pendant 30 s. REMARQUE: Utilisez toujours des gants lorsque vous travaillez avec des échantillons de plasma.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 6 580 x g pendant 5 min. Après centrifugation, recueillir le surnageant avec une micropipette ou une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau microtube. Conserver le surnageant à 4 °C.</li>
	<li>Mélanger la pastille de l’étape précédente avec 1 000 μL d’éthanol à 100 %, vortex pendant 30 s, puis centrifuger à 6 580 x g pendant 5 min. REMARQUE: Le granulé est fortement emballé et doit être bien remis en suspension pour assurer le contact entre l’échantillon et l’éthanol pur. L’utilisation d’une micropipette pour rincer la pastille avec de l’éthanol est recommandée.</li>
	<li>Après centrifugation, recueillir le surnageant et mélanger avec le surnageant précédemment obtenu à l’étape 1.4. dans un microtube de 2 mL.</li>
	<li>Retirer l’éthanol de l’échantillon en utilisant de l’azote pur (99,997 %) à 135 psi. Gardez l’aiguille à 1 cm du haut du microtube pour éviter la perte d’échantillon et rincez jusqu’à ce que l’échantillon soit sec. Aucune chaleur n’est nécessaire pour évaporer l’éthanol. REMARQUE: Le débit d’azote doit être faible pour éviter la perte d’échantillon. Une fois l’éthanol séché, maintenir le débit d’azote pendant au moins 5 minutes pour assurer la sécheresse de l’échantillon. Le protocole peut être mis en pause à ce stade; les échantillons doivent être conservés à -20 °C. Évitez de conserver les échantillons pendant plus de 12 h.</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons secs dans 100 μL d’un mélange d’acétonitrile : eau à une proportion de 50:50 (v:v).</li>
	<li>Filtrer l’échantillon à travers une membrane de seringue en nylon de 0,45 μm directement dans un micro-insert de flacon HPLC. REMARQUE: Les échantillons dans le flacon peuvent être conservés à -20 ° C avant l’analyse. Conservez les échantillons pendant 8 h maximum. Il est recommandé d’injecter les échantillons dans le système UPLC juste après la filtration.</li>
</ol>2. Analyse UPLC-MS/MS
<ol><li>Injecter 3 μL d’échantillon sur un UPLC équipé d’une colonne en phase inverse C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Réglez la température de l’échantillonneur automatique à 20 °C et le thermostat à colonne à 25 °C. Injecter chaque échantillon en trois exemplaires.</li>
	<li>Utilisez 0,1 % (v:v) d’acide formique dans l’eau comme solvant A et 100 % d’acétonitrile comme solvant B. Réglez le débit à 0,4 mL/min et un programme de gradient comme suit : 0-1 min 10 % B, 1-4 min 30 % B, 4-6 min 38 % B, 6-8 min 60 % B, 8-8,5 min 60 % B, 8,5-9 min 10 % B (tableau 1).</li>
	<li>Réglez le spectromètre de masse sur l’ionisation en mode négatif. Utiliser l’azote comme gaz de séchage à 340 °C et un débit de 13 L/min. Réglez la pression du nébuliseur à 60 psi. Réglez la tension capillaire à 4 000 V, la tension du fragmenteur à 175 V et la tension Skimmer à 65 V. Utilisez l’énergie de collision à 20 V (tableau 2).</li>
	<li>Scannez les masses comprises entre 100 et 1100 rapport masse/charge (m/z) et, pour MS/MS, entre 50 et 1000 m/z (tableau 2). Réglez l’acquisition de données sur le mode Auto MS/MS. Utilisez la masse de référence suivante : 119,036 et 966,0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temps (min)</td>
			<td>Solvant A (0,1 % d’acide formique dans l’eau CLHP)</td>
			<td>Solvant B (100 % acétonitrile)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 à 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 à 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 à 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 à 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 à 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,5 à 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Gradient de phase mobile utilisé pour la séparation des composés phénoliques par UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mode d’ionisation</td>
			<td>Négatif</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gaz de séchage</td>
			<td>Azote à 340 °C, débit 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pression du nébuliseur</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tension capillaire</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
<tr>
<td>Masses d’analyse MS</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Masses d’analyse MS/MS</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Paramètres d’ionisation pour l’analyse MS/MS.
3. Construction de la base de données
<ol><li>Recherchez des composés phénoliques, des métabolites phénoliques ou d’autres composés d’intérêt dans la littérature scientifique.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de gestion de base de données inclus dans le système UPLC. Sélectionnez | de fichier Nouvelle bibliothèque de composés de base de données personnelles (PCDL) | Créez un nouveau PCDL. Sélectionnez le type de PCDL : LC/MS Metabolomics. Définissez un nom pour le PCDL. Sélectionnez ensuite Créer.</li>
	<li>Dans la barre d’outils, sélectionnez PCDL , puis l’option Autoriser l’édition . Cliquez ensuite sur le bouton Rechercher des composés . REMARQUE: Comme il s’agit d’un nouveau PCDL, les résultats de la table seront vides. Cela changera une fois que de nouveaux composés seront ajoutés dans le PCDL.<ol>
<li>Ajoutez des composés à la bibliothèque de composés de la base de données personnelle spécialisée en les copiant à partir de la bibliothèque générale de l’instrument. Ouvrez la base de données existante de l’instrument incluse dans le logiciel de gestion de base de données. Cliquez sur le bouton Rechercher des composés. Dans l’option Recherche unique , entrez les critères de recherche composés pour trouver le composé d’intérêt. REMARQUE: Les composés peuvent être trouvés par nom, formule moléculaire, masse exacte et temps de rétention.</li>
		<li>Dans le tableau des résultats composés, sélectionnez le composé d’intérêt. Pour sélectionner plusieurs composés, cliquez sur le premier composé, maintenez la touche CTRL enfoncée , puis cliquez sur chaque composé d’intérêt. Ensuite, faites un clic droit sur tous les composés en surbrillance et sélectionnez Ajouter à PCDL.</li>
		<li>Dans la nouvelle fenêtre, recherchez et sélectionnez le fichier de base de données personnel spécialisé. Cochez les cases Inclure les spectres pour les composés s’ils sont présents et Inclure les informations sur la mobilité ionique pour les composés s’ils sont présents. Cliquez sur le bouton Ajouter . Dans la nouvelle boîte de dialogue, sélectionnez Oui pour vérifier les nouveaux composés ajoutés. Sélectionnez Non pour continuer à rechercher d’autres composés d’intérêt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si les composés d’intérêt ne sont pas disponibles dans la bibliothèque générale de l’instrument, ajoutez de nouveaux composés manuellement.<ol>
<li>Ouvrez la base de données personnelle spécialisée. Une fois ouvert, suivez l’étape 3.3. Sélectionnez l’option Modifier les composés . Cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau .</li>
		<li>Dans la partie supérieure de la fenêtre, complétez les informations relatives au nouveau composé. Remplissez la formule, le nom, le nom IUPAC, le numéro CAS, l’ID Chemspider et d’autres identificateurs.</li>
		<li>Utilisez les informations disponibles dans les bibliothèques en ligne gratuites (Chemspider, PubChem et Phenol Explorer) pour remplir les informations relatives au nouveau composé d’intérêt. Une fois terminé, cliquez sur le bouton Enregistrer comme neuf pour enregistrer les nouvelles informations composées dans la base de données personnelle spécialisée. REMARQUE: Lorsque vous ajoutez des informations provenant de bibliothèques libres, assurez-vous d’inclure les informations sur les composés sans la présence d’ions chlorure ou iodure. Cela peut modifier la masse exacte et la formule moléculaire du composé d’intérêt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez le processus avec tous les composés d’intérêt pour compléter la base de données personnelle spécialisée.</li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Utilisez le logiciel de gestion qualitative de l’instrument pour identifier les composés phénoliques et les métabolites phénoliques présents dans les échantillons.</li>
	<li>Ouvrez le fichier d’exemple. Dans le panneau Chromatogramme, sélectionnez Définir les chromatogrammes et extrayez le chromatogramme ionique total (TIC), le chromatogramme ionique extrait de MS (EIC) et l’EIC de MS/MS. Sélectionnez l’option Intégrer le chromatogramme.</li>
	<li>Dans le panneau Rechercher des composés , sélectionnez Rechercher par options de formule. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Source de formule , puis l’option Base de données/Bibliothèque . Trouvez la base de données personnelle précédemment créée et cliquez sur Ouvrir.</li>
	<li>Sélectionnez l’option Correspondance de formule et définissez une tolérance de correspondance de masse de 5 parties par million (ppm). REMARQUE: Une tolérance de correspondance différente des masses peut être réglée à 10 ppm; cette différence dépend du spectromètre de masse utilisé.</li>
	<li>Sélectionnez l’option Ions négatifs et sélectionnez uniquement la boîte de dialogue -H . Dans l’option Résultats , cochez les boîtes de dialogue Extraire le EIC, Extraire le spectre nettoyé, Extraire le spectre brut et Inclure la structure .</li>
	<li>Sélectionnez l’option Filtres de résultats . Marquez Avertir si le score est et définissez la correspondance de score à 80,00%. Marquer Ne pas correspondre si le score est et définir le score à 75,00%. REMARQUE: Les scores de correspondance / non de correspondance peuvent être modifiés en valeurs inférieures si nécessaire. Cela réduira la précision de l’identification.</li>
	<li>Cliquez sur trouver des composés par formule pour identifier les composés d’intérêt dans l’échantillon.</li>
</ol>

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</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’identification et la quantification des composés phytochimiques bioactifs qui sont absorbés après la consommation d’un aliment ou d’un complément alimentaire sont cruciales pour démontrer et comprendre les bienfaits pour la santé de ces composés et des aliments qui en contiennent. Dans le présent travail, la méthode UPLC-MS/MS a été développée, visant uniquement à identifier les principaux composés phénoliques et leurs métabolites qui ont augmenté en concentration dans le plasma après une intervention nutritionnelle de...

La sarcopénie est un trouble squelettique progressif lié à une perte musculaire accélérée chez la population âgée. Cette condition augmente le risque de chutes et conduit à des activités limitées de la vie quotidienne. La sarcopénie est présente chez environ 5 % à 10 % des personnes de plus de 65 ans et environ 50 % des personnes âgées de 80 ans ou plus1. Aucun médicament spécifique n’a été approuvé pour le traitement de la sarcopénie, il est donc important de prévenir par l’activité physique et une alimentation équilibrée1,2. Les interventions nutritionnelles avec des aliments spécialement formulés enrichis en protéines laitières et en acides aminés essentiels ont montré des résultats positifs dans la prévention de la sarcopénie2. Dans d’autres études, les auteurs ont inclus des vitamines et des antioxydants, comme la vitamine E et les isoflavones, dans l’alimentation, augmentant ainsi les avantages pour le gain musculaire à la taille et aux hanches3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) est un arbre qui pousse dans les régions tropicales mexicaines; il a été consommé par les cultures mayas en raison de sa haute valeur nutritionnelle4. C’est une bonne source de protéines, de fibres, de minéraux et d’antioxydants phénoliques, tels que l’acide chlorogénique5. Comme elle peut être moulue en poudre et utilisée dans les produits de boulangerie ou consommée dans les boissons, des études récentes ont évalué l’incorporation de farine de graines de Ramón (RSF) dans différents aliments pour améliorer leur valeur nutritionnelle. Une boisson aromatisée au cappuccino supplémentée par RSF a été formulée, qui était riche en fibres alimentaires et contenait plus de 6 g de protéines par portion, et était très acceptée par les consommateurs; il a donc été considéré comme une solution de rechange potentielle pour répondre à des besoins alimentaires particuliers6. Dans une étude de suivi, RSF a également été utilisé pour formuler un muffin et une nouvelle boisson riche en protéines, fibres alimentaires, micronutriments et antioxydants phénoliques. Le muffin et la boisson ont été utilisés dans une intervention diététique pour les personnes âgées, qui ont consommé les deux produits deux fois par jour pendant 30 jours. Après cette période, l’état nutritionnel et sarcopénique des participants s’est amélioré et la teneur totale en phénol du plasma a augmenté7. Cependant, la détermination des composés phénoliques totaux dans le plasma a été effectuée par une méthode spectrophotométrique, de sorte qu’il n’a pas été possible d’identifier les composés phénoliques réels qui ont été absorbés; de plus, cette méthode n’est pas complètement spécifique pour les composés phénoliques, de sorte qu’une certaine surestimation peut se produire8.
L’identification et la quantification des composés phénoliques qui sont absorbés après la consommation d’aliments riches en ces antioxydants est une tâche difficile mais nécessaire pour démontrer l’activité biologique de ces composés phytochimiques. La biodisponibilité de la plupart des composés phénoliques est faible; moins de 5% d’entre eux peuvent être trouvés sans transformation structurelle dans le plasma. Les composés phénoliques subissent plusieurs biotransformations, telles que la méthylation, la sulfonation ou la glucuronidation, qui sont effectuées par les entérocytes et les hépatocytes9. Les composés phénoliques sont également biotransformés par le microbiote en catabolites bactériens qui peuvent exercer leurs effets bénéfiques dans le corps après avoir été absorbés dans le plasma10. Par exemple, l’acide phénylacétique est un produit de la transformation bactérienne des flavonoïdes et des proanthocyanidines oligomères, qui peuvent inhiber jusqu’à 40% de l’adhésion des bactéries (Escherichia coli) dans les voies urinaires après la consommation de canneberges11.
La diversité structurelle des composés phénoliques naturels, ajoutée à la diversité de leurs métabolites et à leur faible biodisponibilité, rend leur identification dans le plasma encore plus difficile. Le profilage métabolomique, utilisant des plateformes d’analyse spectroscopique comme la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectroscopie de masse en tandem (MS/MS), est probablement la meilleure approche pour atteindre cet objectif; malheureusement, l’équipement n’est pas facilement accessible et le développement de protocoles d’analyse est encore limité12. Plusieurs études ont rapporté que la SEP/SEP couplée à un système de séparation (comme la chromatographie liquide) comme stratégie pour réduire la complexité des spectres de masse dans les études métabolomiques. L’introduction récente de méthodes de séparation par chromatographie liquide à ultra-haute performance (UPLC) a réduit le temps d’analyse et augmenté la résolution et la sensibilité par rapport aux protocoles liquides conventionnels à haute performance, de sorte que les systèmes UPLC-MS/MS ont rapidement été largement acceptés par la communauté de la métabolomique analytique13. De cette façon, certaines études ont étudié les métabolites phénoliques et détecté des dérivés glucuronidés de l’acide caféique, de la quercétine et de l’acide férulique, ainsi que des dérivés sulfonés de l’acide syringique et vanillique dans le plasma des individus après la consommation de canneberge14. Les protocoles précédents visaient à trouver des composés phénoliques et des métabolites phénoliques dans des biofluides tels que le plasma. Ces protocoles étaient basés sur l’identification et la quantification par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) couplée à un détecteur UV-vis15. Néanmoins, de tels protocoles exigent l’utilisation de normes authentiques pour évaluer l’identification absolue et la quantification précise. Un large éventail d’études ont identifié les métabolites les plus courants dans les biofluides (formes sulfonées, glucuronidées et méthylées) par UPLC-MS et UPLC-MS/MS; toutefois, une grande partie des métabolites bactériens n’a pas été signalée en raison du manque de bases de données contenant leurs informations complètes16. L’identification des métabolites est compliquée par le coût et la disponibilité commerciale des étalons de métabolites. Par conséquent, la meilleure stratégie peut être l’analyse non ciblée ou semi-ciblée des métabolites MS/MS, qui repose sur l’utilisation d’informations sur les caractéristiques moléculaires (m/z, masse exacte monoisotopique, distribution isotopique et modèle de fragmentation) pour déterminer l’identité chimique et la comparer à des bases de données en ligne disponibles gratuitement qui contiennent des métabolites polyphénoliques identifiés dans les biofluides après la consommation de polypolyphénols riches12 . Les bases de données les plus importantes utilisées dans les études UPLC-MS/MS pour l’identification des composés phénoliques et de leurs métabolites sont la human Metabolome Database (HMDB), la LipidBlast Library, la METLIN Library et d’autres bases de données complémentaires, telles que PubChem, ChemSpider et Phenol Explorer17.
Dans la présente étude, une méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS a été mise au point pour analyser les échantillons de plasma du groupe de personnes âgées participant à l’étude sur la consommation de muffins et de boissons contenant du RSF7. Les données de différentes bases de données en ligne gratuites sur les métabolites plasmatiques ont été recueillies et intégrées dans une base de données spécialisée. Cette base de données est accessible automatiquement par le logiciel de l’équipement pour identifier les métabolites polyphénoliques dans les cinq échantillons de plasma avant et après l’intervention nutritionnelle de 30 jours. Ceci est fait pour identifier les principaux composés phénoliques, ou leurs métabolites, qui sont absorbés par les aliments fonctionnels spécialement formulés conçus pour la prévention de la sarcopénie.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Passeur d’échantillons Agilent</td><td>Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Série Infinity</td></tr><tr><td>C18 colonne de phase inverse</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 &mu ; m; Centrifugeuse HD à résolution rapide</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin ; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Compartiment colonne avec thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290 Détecteur</td></tr><tr><td>à barrettes de diodes série Infinity (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Série Infinity</td></tr><tr><td>Source d’ionnisation par électronébulisation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Pulvérisateur double Source ESI</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Réactif Baker, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Data Acquisition</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Analyse qualitative</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Marque</td><td>BR780546</td><td>Tube de microcentrifugation, 2 mL avec couvercle</td></tr><tr><td>Pure éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 proof, pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530</td></tr><tr><td>Pompe quaternaire</td> de masse précise <td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Infinity series Filtre</td></tr><tr><td>à seringue</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0.45 &mu ; m, membrane en nylon</td></tr><tr><td>Thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Série Infinity</td></tr><tr><td>Flacon</td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Ambre, PFTE rouge silicone 2 mL avec bouchon à vis et bouchons bleus Insert</td></tr> de <tr><td>flacon</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Insert de flacon 200 &mu ; L pour ouverture standard de 2 ml, conique</td></tr><tr><td>Water</td><td>Tedia</td><td>WL2212-001</td><td>LC Spectrométrie de masse</td></tr></tbody></table>

chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Un groupe de 23 personnes âgées a reçu des repas fonctionnels (une boisson et un muffin) spécialement formulés pour la prévention de la sarcopénie (perte de masse musculaire liée à l’âge). Des échantillons de plasma ont été prélevés au début de l’intervention et après 30 jours de consommation des repas fonctionnels. Une chromatographie semi-ciblée à ultra-haute performance couplée à une analyse de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été réalisée pour identifier les composés phénoliques et leurs métabolites. Les protéines plasmatiques ont été précipitées avec de l’éthanol et les échantillons ont été concentrés et remis en suspension dans la phase mobile (acétonitrile 1:1 : eau) avant injection dans l’instrument UPLC-MS/MS. La séparation a été réalisée avec une colonne de phase inverse en C18 , et les composés ont été identifiés à l’aide de leur masse expérimentale, de leur distribution isotopique et de leur motif de fragment. Les composés d’intérêt ont été comparés à ceux des banques de données et de la bibliothèque interne semi-ciblée. Les résultats préliminaires ont montré que les principaux métabolites identifiés après l’intervention étaient l’acide phénylacétique, la glycitine, l’acide 3-hydroxyphénylvalérique et la gomisine M2.

Le processus étape par étape d’identification des métabolites phénoliques par l’analyse semi-ciblée UPLC-MS/MS, en mode négatif, d’échantillons de plasma est illustré à la figure 2. Tout d’abord, le chromatogramme ionique total (TIC) de l’extrait de phénol plasmatique (obtenu après précipitation protéique de l’échantillon plasmatique total) a été obtenu grâce au logiciel qualitatif de l’instrument. Ensuite, le chromatogramme ionique extrait a été utilisé, et la masse ex...

L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma à l’aide d’une méthode de chromatographie-spectrométrie de masse semi-ciblée.

Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma par une méthode UPLC-MS/MS semi-ciblée. Les protéines plasmatiques ont été précipitées avec de l’éthanol et des échantillons concentrés, et remises en suspension dans la phase mobile, avant l’injection dans l’équipement UPLC. Les composés ont été identifiés à l’aide d’une bibliothèque semi-ciblée assemblée en laboratoire, en utilisant le gestionnaire PCDL pour la métabolomique, des logiciels et différentes bases de données en ligne gratuites.Nous avons mis en place une intervention nutritionnelle avec un muffin et une boisson avec de la farine de graines de brosimum alicastrum. À la fin de l’intervention, l’état nutritionnel et sarcopénique des participants a été amélioré et la teneur totale en phénol du plasma a été augmentée. Mais nous devons identifier quels composés phénoliques ont été absorbés et ont contribué à l’effet positif.L’identification et la quantification des composés phénoliques qui sont absorbés après la consommation d’aliments riches en ces antioxydants est une tâche difficile mais nécessaire, si l’on veut démontrer l’activité biologique de ces composés phytochimiques. La biodisponibilité de la plupart des composants phénoliques est faible, de plus moins de 5% d’entre eux entrent sans transformation structurelle en plasma. La plupart passent par plusieurs biotransformations, telles que la méthylation, la sulfonation ou la glucuronidation.Un large éventail d’études ont identifié les métabolites les plus courants dans les biofluides par UPLC-MS et UPLC-MS/MS. Cependant, une grande partie du métabolite bactérien n’est pas signalée au manque de bases de données contenant leurs informations complètes. L’identification des métabolites est compliquée par le coût et la disponibilité commerciale des étalons de métabolites.Par conséquent, la meilleure stratégie peut être l’analyse non ciblée ou semi-ciblée des métabolites de la SEP/SEP. Cette analyse repose sur l’utilisation d’informations sur les caractéristiques moléculaires, le rapport masse/charge de la masse exacte monoisotopique, la distribution isotopique et le modèle de fragmentation. Déterminer l’identité chimique et la comparer avec les bases de données en ligne disponibles gratuitement qui contiennent des métabolites polyphénoliques identifiés dans les biofluides après la consommation de régimes riches en polyphénols.Dans la présente étude, nous avons mis au point une méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS pour analyser les échantillons de plasma d’un groupe de personnes âgées impliquées dans une intervention nutritionnelle. Conservez les échantillons de plasma à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Décongeler les échantillons de plasma à température ambiante pendant 15 minutes ou à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Placer 200 microlitres d’échantillon de plasma dans un microtube de deux millimètres et mélanger avec 1000 microlitres d’éthanol pur. Échantillon de plasma Vortex pendant 30 secondes. Échantillon de centrifugeuse à 6 580 de force centrifuge pendant cinq minutes.Après centrifugation, recueillir le surnageant avec une micropipette ou une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau microtube. Réservez le surnageant. Mélanger une pastille avec de l’éthanol pur de 1000 microlitres, vertex pendant 30 secondes, puis centrifuger dans les mêmes conditions.Recueillir le surnageant et mélanger avec le premier surnageant. Retirer l’éthanol de l’échantillon en utilisant de l’azote pur à 135 psi. Gardez l’aiguille à un centimètre du sommet du microtube pour éviter la perte d’échantillon et rincez jusqu’à ce qu’un échantillon soit sec.Remettre en suspension des échantillons secs dans 100 microlitres d’un mélange d’acétonitrile avec de l’eau. Filtrer à travers une membrane de seringue en nylon de 45 micro directement dans un micro-insert de flacon HPLC Injecter trois microlitres d’échantillon sur UPLC équipé d’une colonne de phase inverse C 18. Réglez la température de l’échantillonneur automatique à 20 degrés Celsius et le thermostat à colonne à 25 degrés Celsius.Injecter chaque échantillon en trois exemplaires. Utiliser 0,1% d’acide formique dans l’eau comme solvant A et 100% d’acétonitrile comme solvant B.Réglez le débit à 0,4 millimètre par minute et un programme de gradient comme suit, de zéro à une minute 10% B, une à quatre minutes 30% B, quatre à six minutes 38% B, six à huit minutes 60% B, huit à 8,5 minutes 60% B, 8,5 à neuf minutes 10%B. Réglez le spectromètre de masse en mode d’ionisation négative.Utilisez l’azote comme gaz de séchage à 300 degrés Celsius et le débit à 13 litres par minute. Réglez la pression du nébuliseur à 30 psi. Réglez une tension capillaire à 4 000 volts, une tension fragmentaire à 175 volts et une tension Skimmer à 65 volts.Scannez les masses entre 100 et 1100 m/z et pour la spectrométrie de masse, scannez les masses entre 50 et 1000 m/z. Réglez l’acquisition de données en mode Auto MS/MS. Utilisez la masse de référence suivante, 119.036 et 966.0007.Recherche de composés phénoliques, de métabolites phénoliques et d’autres composés d’intérêt dans la littérature scientifique. Ouvrez le logiciel de gestion de base de données inclus dans le système UPLC. Sélectionnez fichier, puis sélectionnez une nouvelle bibliothèque composée de base de données personnelle, PCDL.Sélectionnez ensuite, créez un nouveau PCDL. Sélectionnez le type de métabolomique PCDL LC/MS. Définissez le nom de PCDL.Sélectionnez ensuite créer. Dans la barre d’outils, sélectionnez PCDL, puis l’option Autoriser l’édition. Cliquez ensuite sur le bouton Rechercher des composés.Les composés peuvent être ajoutés à la bibliothèque personnelle de deux façons, d’abord en les copiant à partir de la bibliothèque générale de l’instrument. Pour ce faire, ouvrez la base de données existante des instruments inclus dans la gestion des données jusqu’à présent. Cliquez sur le bouton Rechercher des composés.Dans l’option de recherche unique, entrez les critères de recherche composés pour trouver le composé d’intérêt. Dans le tableau des résultats composés, sélectionnez le composé d’intérêt. Pour sélectionner plusieurs composés, cliquez sur le premier composé, puis maintenez la touche CTRL enfoncée, puis cliquez sur chaque composé d’intérêt.Ensuite, faites un clic droit sur tous les composés en surbrillance et sélectionnez Ajouter à PCDL. Dans la nouvelle fenêtre, recherchez et sélectionnez le fichier de base de données personnel spécialisé. Cochez la case inclure les spectres pour le composé s’il est présent.Cliquez sur le bouton Ajouter. Dans la nouvelle boîte de dialogue, sélectionnez Oui pour vérifier les nouveaux composés ajoutés. Sélectionnez Non pour continuer à rechercher d’autres composés d’intérêt.Deuxièmement, de nouveaux composés peuvent être ajoutés manuellement s’ils ne sont pas disponibles dans la bibliothèque générale de l’instrument. Pour cela ouvert, la base de données personnelle spécialisée. Une fois ouvert, sélectionnez PCDL, puis l’option Autoriser l’édition.Sélectionnez l’option Modifier les composés. Cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau. Dans la partie supérieure de la fenêtre, complétez les informations du nouveau composé.Remplissez la formule, le nom, le nom IUPAC, le numéro CAS, l’ID Chemspider et d’autres identificateurs. En utilisant les informations disponibles dans les bibliothèques en ligne gratuites, Chemspider, PubChem et Phenol Explorer pour remplir les informations du nouveau composé d’intérêt. Une fois terminé, cliquez sur le bouton Enregistrer comme neuf pour enregistrer les nouvelles informations composées dans la base de données personnelle spécialisée.Répétez le processus avec tous les composés d’intérêt pour compléter la base de données personnelle spécialisée. Utilisez le logiciel de gestion qualitative de l’instrument pour identifier les composés phénoliques et les métabolites phénoliques. Ouvrez le fichier d’exemple.Dans le panneau Chromatogramme, sélectionnez Définir les chromatogrammes et extraire le chromatogramme ionique total TIC, le chromatogramme ionique extrait de MS EIC et l’EIC de MS/MS. Sélectionnez l’option Intégrer le chromatogramme. Dans le panneau Rechercher des composés, sélectionnez les options Rechercher par formule.Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez la source de formule, puis l’option bibliothèque de barres obliques de base de données. Trouvez la base de données personnelle précédemment créée et cliquez sur ouvrir. Sélectionnez l’option de correspondance de formule et définissez une tolérance de correspondance de masse de cinq parties par million, ppm.Sélectionnez l’option ions négatifs et sélectionnez uniquement la boîte de dialogue moins H. Dans l’option résultats, marquez l’EIC d’extraction, extrayez le spectre nettoyé, extrayez le spectre brut et incluez des boîtes de dialogue structurées. Sélectionnez l’option filtres de résultats.Et puis marquez avertir si le score est, puis définissez la correspondance de score à 80%Puis marque ne correspondez pas si le score est et définissez le score à 75%Puis cliquez sur la recherche de composés par formule pour identifier les composés d’intérêt dans l’échantillon. Le processus étape par étape pour l’identification des métabolites phénoliques par l’analyse semi-ciblée UPLC MS/MS des échantillons de plasma est illustré dans la figure suivante. Tout d’abord, le chromatogramme ionique total a été obtenu à l’aide d’une base de données PCDL auto-créée qui contenait 645 composés phénoliques et leurs métabolites, obtenus à partir de bases de données en ligne gratuites.Ensuite, le chromatogramme ionique extrait et le motif de fragmentation, ou les ions de masse inférieure à cinq ppm, correspondent à la tolérance ont été obtenus. Enfin, la distribution isotopique des pics détectés a été comparée à celle des composés théoriques. À partir de cette analyse, un total de 25 composés phénoliques et métabolites ont été identifiés dans les échantillons de plasma.Pour évaluer l’efficacité de la méthode de conception dans l’identification des composés phénoliques absorbants ou de leurs métabolites, cinq échantillons des participants à l’étude obtenus avant et après l’intervention de 30 jours ont été analysés. L’abondance relative de chaque composé a été calculée en divisant l’aire sous la courbe après traitement par ASC avant traitement. Le tableau quatre montre la liste des 12 composés phénoliques qui ont montré une augmentation du plasma après la consommation de 30 jours de la farine de brosimum alicastrum contenant des aliments.L’acide phénylacétique n’a été trouvé que comme métabolite systématiquement à une concentration plus élevée après le traitement. La glycitine, une isoflavone glycosylée et trois acides hydroxyphénylvalériques ont augmenté dans trois des cinq échantillons, mais ont diminué dans les deux autres. La gomisine M2, un lignan, n’a été détectée dans trois des cinq échantillons qu’après l’intervention nutritionnelle.Les autres composés phénoliques et métabolites n’ont été trouvés que dans un seul échantillon et seulement après le traitement. La méthode développée dans le présent document montre que, dans la plupart des cas, elle était bien adaptée à l’objectif pour lequel elle a été créée. L’échantillon par traitement était simple et efficace.La séparation upLC et l’identification semi-ciblée des métabolites phénoliques de la SEP/SEP ont été réalisées.

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Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés (Vidéo) | JoVE Journal

Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés

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