Préparation biologique et technique mécanique pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zozonulaires
16 décembre 2021
Le protocole décrit une méthode pour l’étude de la viscoélasticité de la matrice extracellulaire et de sa dépendance à la composition protéique ou aux facteurs environnementaux. Le système matriciel ciblé est la zonule de souris. La performance de la méthode est démontrée en comparant le comportement viscoélastique des fibres zonulaires de type sauvage avec celles dépourvues de glycoprotéine-1 associée aux microfibrilles.
L’importance de notre méthode réside dans sa capacité à répondre à la question, quelles sont les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires, les fibres qui suspendent le cristallin à l’intérieur de l’œil? Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet de quantifier les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires petites et délicates de souris avec et sans modifications génétiques ciblées. Des mutations dans les gènes codant pour des protéines de microfibrilles sous-tendent plusieurs conditions syndromiques héréditaires.
En utilisant notre technique, nous pouvons étudier comment des mutations spécifiques modifient les propriétés biomécaniques des microfibrilles. Pour commencer, après l’euthanasie de la souris, retirez les yeux à l’aide de pinces fines. Insérez la pointe d’une aiguille de fixation à travers la paroi de l’œil et positionnez-la au centre de l’humeur vitrée, en prenant soin de ne pas endommager la lentille.
Transférer soigneusement l’œil empalé dans un tube rempli de 4% de paraformaldéhyde et de solution saline tamponnée au phosphate. Ouvrez la vanne reliant l’aiguille à un réservoir fixé situé à 25 centimètres au-dessus de l’échantillon qui maintient une pression positive équivalente à 15 à 20 millimètres de mercure dans l’œil pendant la période de fixation et laissez l’échantillon se fixer pendant la nuit. Le lendemain, retirez l’aiguille de fixation et lavez l’œil pendant 10 minutes dans une solution saline tamponnée au phosphate.
En utilisant des ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et un stéréomicroscope, faites une incision de pleine épaisseur dans la paroi de l’œil près de la tête du nerf optique. Étendez la coupe vers l’avant vers l’équateur, puis autour de la circonférence équatoriale de l’œil tout en épargnant soigneusement les processus ciliaires délicats et les fibres zonulaires associées. Exposez la surface postérieure de la lentille en retirant l’arrière du globe.
Retirez l’œil disséqué de la solution tampon à l’aide d’une pince et placez-le sur une lingette sèche avec la cornée tournée vers le bas. Faites glisser doucement la cornée sur la surface de la lingette pour la sécher. Appliquez une goutte de colle instantanée au fond d’une boîte de Petri de 50 millimètres et fixez-y la plate-forme.
Placez le plat sur la plaque de scène du stéréomicroscope afin que le puits avec la colle soit en vue. Pour accueillir l’œil dans les puits de la plate-forme de la boîte de Pétri, ajoutez trois microlitres de colle instantanée. Placez-le soigneusement dans le puits et ajustez-le rapidement de sorte que l’arrière de la lentille soit orienté vers le haut.
Séchez le côté exposé de la lentille en épongeant doucement avec le coin d’une lingette sèche. Pour mesurer la réponse viscoélastique zozonulaire, allumez la balance, placez la boîte de Petri sur la balance, puis démarrez le programme d’enregistrement de la balance et le logiciel de la caméra. Allumez le contrôleur du servomoteur.
Démarrez l’application du contrôleur sur l’ordinateur et définissez les paramètres de mouvement par incréments de 50 micromètres. Créez une courbure de 90 degrés dans une tige capillaire. Glissez le capillaire plié dans le porte-sonde capillaire et serrez les vis de fixation.
À la pointe capillaire, ajoutez une petite perle de colle de durcissement UV. Déplacez l’extrémité de la sonde capillaire à l’aide des réglages manuels du manipulateur et placez-la directement sur le dessus de l’objectif. Grâce à l’inspection visuelle frontale et à la vue latérale à l’aide d’une caméra de microscope, examinez que la partie inférieure de la colle UV semble centrée sur le dessus de l’objectif.
En regardant à travers l’appareil photo, abaissez la pointe de la sonde jusqu’à ce que la colle UV entre en contact avec l’objectif et couvre 1/3 à 1/2 de sa surface supérieure. Durcissez la colle à l’aide d’une source de lumière UV directionnelle presque visible de 380 à 400 nanomètres de longueur d’onde et d’une intensité d’environ un milliwatt. Ajouter la solution de PBS à la boîte de Petri jusqu’à ce que l’œil soit recouvert à une profondeur d’au moins deux millimètres.
Placez une lentille cylindrique devant le microscope et de près de la boîte de Pétri sans la toucher. Dans le même temps, démarrez la journalisation dans un programme de minuterie. Prenez une photo de l’œil et de la sonde à l’aide de l’appareil photo.
Après 60 secondes, commencez un déplacement de 50 micromètres. Répétez toutes les 60 secondes jusqu’à ce que l’expérience soit terminée comme indiqué par la rupture de toutes les fibres zonulaires. Enregistrez les données de journalisation de l’échelle à la fin d’une exécution et exportez-les dans un format de feuille de calcul compatible.
Enregistrez également les images de l’objectif obtenues pendant la course. Importez les données dans une feuille de calcul. À l’aide de la première et de la dernière échelle, interpolez la dérive de la lecture d’arrière-plan au fil du temps due à l’évaporation, puis soustrayez l’arrière-plan interpolé de la lecture à chaque point temporel.
Après avoir effectué le test et corrigé l’évaporation, le graphique des données viscoélastiques est inversé. L’ampleur des forces instantanées et détendues augmente à chaque pas jusqu’à environ 1 000 secondes, puis diminue à mesure que les fibres zonulaires commencent à se briser jusqu’à ce que le point de temps de 1 500 secondes soit atteint lorsque toutes les fibres sont brisées. Pour cette démonstration, la réponse viscoélastique pour les souris de type sauvage et les souris déficientes en MAGP-1 a également été comparée.
Au temps initial de zéro à 600 secondes, les graphiques se ressemblent suggérant que les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires n’ont pas été modifiées de manière significative. Cependant, chez la souris knockout MAGP-1, les fibres se cassent prématurément. Les forces de rupture des fibres zonulaires ont été obtenues avec la méthode pull-up pour MAGP-1 par rapport aux souris de type sauvage à un mois et un an.
Les résultats ont indiqué que la force des fibres augmente avec l’âge pour les souris de type sauvage. Tout contact accidentel avec la boîte de Petri au cours de ces étapes peut provoquer un déplacement de la paroi oculaire par rapport au cristallin, endommageant potentiellement les fibres zonulaires. Ce test de traction aide à identifier les protéines qui contribuent à la résistance à la traction des microfibrilles.
Nous utiliserons ces informations pour construire des modèles plus réalistes de l’intérieur des fibres zonulaires.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour étudier les propriétés viscoélastiques de la matrice extracellulaire, en se concentrant spécifiquement sur la zonule murine. Il montre comment la composition protéique et les facteurs environnementaux influencent ces propriétés, comme le démontrent les comparaisons entre les fibres zonulaires de type sauvage et celles dépourvues de la glycoprotéine associée aux microfibrilles-1.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Biomécanique
Contexte
- Les fibres zonulaires suspendent le cristallin dans l’œil.
- Les propriétés viscoélastiques sont essentielles pour comprendre le comportement biomécanique.
- Des mutations dans les protéines des microfibrilles peuvent entraîner des affections héréditaires syndromiques.
- La compréhension de ces propriétés peut aider à étudier les effets génétiques sur la santé oculaire.
Objectif de l'étude
- Quantifier les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires.
- Évaluer l'impact de mutations génétiques spécifiques sur ces propriétés.
- Fournir une méthode fiable pour l'étude de structures biologiques délicates.
Méthodes utilisées
- Prélèvement des fibres zonulaires après euthanasie des souris.
- Utilisation de pinces fines pour l'ablation de l'œil.
- Insertion d'une aiguille de fixation dans l'œil pour l'analyse.
- Comparaison des fibres provenant de souris de type sauvage et de souris génétiquement modifiées.
Résultats principaux
- La méthode quantifie avec succès les propriétés viscoélastiques.
- Des différences dans les propriétés ont été observées entre les fibres de type sauvage et les fibres mutantes.
- On a montré que des mutations spécifiques modifient les caractéristiques biomécaniques.
- La technique est applicable à des études génétiques supplémentaires.
Conclusions
- Cette méthode fournit des informations sur les propriétés biomécaniques des fibres zonulaires.
- Elle peut être utilisée pour explorer les effets de modifications génétiques.
- Les résultats pourraient contribuer à la compréhension des affections syndromiques liées à l'œil.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet une évaluation quantitative des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires, un système de matrice extracellulaire modélisé, afin d'analyser comment des mutations spécifiques des protéines modifient la fonction biomécanique. En fournissant un signal sensible et reproductible de l'intégrité des fibres soumises à une contrainte mécanique contrôlée, elle contribue à la validation ciblée des mécanismes des maladies oculaires et à la réduction des risques précliniques des thérapies génétiques. L'approche offre une plateforme évolutible pour explorer les relations entre les protéines de la MEC et des pathologies du tissu conjonctif allant au-delà de l'œil.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en associant la composition protéique des zonules à des modifications mesurables du comportement viscoélastique.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à la comparaison directe de fibres de type sauvage et de fibres génétiquement modifiées soumises à une charge mécanique normalisée.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en identifiant les protéines dont la perte est corrélée à une rupture prématurée des fibres sous des seuils de déplacement définis.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’essai : Produit des systèmes biologiques validés (préparations de fibres zonulaires) avec des sorties de tension quantifiables, adaptés aux criblages de composés ou génétiques en aval.
- Reproductibilité : Des protocoles standardisés de fixation, de montage et de déplacement assurent des mesures de base cohérentes entre les différentes expériences.
- Extensibilité : La conception de la plateforme permet le traitement parallèle de plusieurs échantillons à l’aide de puits identiques de boîtes de Pétri et de dispositifs capillaires identiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise des affections syndromiques humaines résultant de mutations des protéines des microfibrilles, permettant une évaluation préclinique des relations génotype-phénotype.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la validation préliminaire des cibles et l'évaluation préclinique en fournissant un indicateur biomécanique commun pour les systèmes de type sauvage et les modèles de maladie.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet de déterminer si les modifications phénotypiques observées découlent d'une altération de la viscoélasticité de la MEC plutôt que d'effets développementaux hors cible.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en fournissant des données biomécaniques de phase précoce qui renseignent sur la confiance accordée à la cible et la préparation des tests en vue d'une validation ultérieure.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant l'impact des mutations génétiques sur la capacité portante des microfibrilles zonulaires.
- Écrantage : Génère des préparations prêtes à l'essai associées à des mesures force-déplacement, permettant la comparaison entre conditions de type sauvage, hétérozygotes et mutants homozygotes.
- Analytique : Fournit des mesures de tension résolues temporellement, permettant le calcul de paramètres de force instantanés et relaxés, et facilitant les comparaisons statistiques entre génotypes.
- Recherche translationnelle : Offre un système pertinent pour les maladies, permettant d'évaluer si l'expression protéique restaurée ramène les profils viscoélastiques vers les valeurs de référence du type sauvage.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme biomécanique standardisée, applicable à d'autres systèmes ECM soumis à traction (par exemple, tendons, ligaments), avec une adaptation minimale du protocole.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en isolant la contribution de protéines spécifiques de la matrice extracellulaire à la viscoélasticité au niveau tissulaire.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures standardisées et peu coûteuses, sensibles aux changements dépendant de l'âge et du génotype dans la résistance des fibres.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des critères biomécaniques objectifs pour la priorisation des cibles dans les programmes visant les tissus conjonctifs.
- Impact sur le portefeuille : Permet une avancée ajustée au risque en quantifiant la conséquence fonctionnelle des modifications génétiques sur les réseaux de matrice extracellulaire supportant la charge.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection oculaire, microchirurgie et essais biomécaniques sous microscope.
- Dépend d'instruments de précision, notamment des contrôleurs de servomoteurs, des balances sensibles à la force et des systèmes de polymérisation UV pour l'attachement de la sonde à la lentille.
- Exige des protocoles normalisés de fixation et de montage afin de prévenir la dérive de l'échantillon ou les artefacts mécaniques durant la mesure de la tension.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'application de la technique de traction vers le haut à des systèmes de matrice extracellulaire présentant une organisation structurelle ou une résistance à la traction différente.
- Les limitations pratiques incluent le temps de préparation des échantillons et la nécessité de conditions environnementales contrôlées (par exemple, tampon PBS) pour minimiser les artefacts d'évaporation pendant les essais prolongés.
